Coloração histológica do tecido neural

Histological Staining of Neural Tissue

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Neuroscience

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Histological Staining of Neural Tissue

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08:55 min

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April 30, 2023

Overview

Para examinar o layout celular, estrutural e molecular de tecidos e órgãos, os pesquisadores utilizam um método conhecido como coloração histológica. Nesta técnica, um tecido de interesse é preservado usando fixação química e seccionada, ou cortada em fatias muito finas. Uma variedade de técnicas de coloração são então aplicadas para fornecer contraste com as seções visualmente uniformes. No estudo da neuroanação, técnicas histológicas são frequentemente aplicadas para visualizar e estudar tecido do sistema nervoso.

Este vídeo se concentra em técnicas histológicas de coloração para tecido neural. Uma visão geral das manchas cerebrais comuns é fornecida, incluindo aquelas que marcam especificamente corpos de células neuronais, como manchas de Nissl, e aquelas que destacam seletivamente axônios mieliados, como a mancha azul Luxol Fast. Técnicas imunohistológicas, que aproveitam a interação específica entre anticorpos e proteínas celulares únicas, também são discutidas. Em seguida, descreve-se a preparação de amostras cerebrais para coloração, incluindo os passos básicos para fixação, incorporação, secção e reidratação do tecido. A apresentação também fornece um procedimento passo a passo para a coloração imunohistológica seguida de uma mancha de Nissl, além de aplicações práticas dessas técnicas.

Procedure

Fatias, ou seções, de tecido cerebral são um material rico para estudar a estrutura e a função do cérebro. No entanto, o cérebro não tratado é um tecido visualmente uniforme, como uma tela em branco. A coloração é uma forma de “pintar” o cérebro para visualizar claramente os componentes celulares, estruturais e moleculares do órgão. Enquanto a maioria das manchas compartilham métodos histológicos comuns, cada abordagem tem um alvo morfológico único. Este vídeo fornecerá um esboço dos princípios gerais da histologia cerebral, demonstrará algumas técnicas comuns de coloração e revisará algumas aplicações desses métodos em laboratórios de neurociência hoje.

Antes de discutir como os procedimentos de coloração neurológica são realizados, vamos rever os objetivos dessas técnicas.

Manchas histológicas são comumente usadas para fornecer contraste, revelando características que não podem ser distinguidas em tecidos não manchados. Por exemplo, para visualizar os corpos das células neurônios, ou somata, que compõem a matéria cinzenta do sistema nervoso, múltiplas manchas estão disponíveis. Os corantes usados nas manchas de nissl se ligam aos ácidos nucleicos, colorindo o roxo somata e revelando a organização neuronal.

Alternativamente, para olhar para a matéria branca, você pode manchar a mielina – a baia de ácido graxo ao redor dos axônios – com corantes como Luxol Fast Blue. Alternativamente, a coloração imunohistoquímica pode destacar alvos moleculares encontrados em tipos celulares específicos. Esta técnica aproveita a especificidade entre anticorpos e alvos moleculares conhecidos como antígenos. O uso de anticorpos fundidos a enzimas ou compostos fluorescentes permite que os pesquisadores visualizem seus locais de ligação usando reações enzimáticas ou fluorescência.

Agora que você foi introduzido à ideia de seções de coloração, vamos olhar para os passos histológicos comuns que precedem a coloração do tecido cerebral e garantir condições ideais para visualização.

Para preservar a estrutura tecidual, o cérebro é primeiro perfundido – o que significa que o sangue é drenado do cérebro e a vasculatura do animal é usada para fornecer um fixador químico. Após a dissecação, o cérebro está totalmente imerso em fixação para completar o processo de preservação.

Em seguida, a amostra é embutida em um meio com propriedades mecânicas semelhantes ao tecido cerebral, como cera de parafina. Após a incorporação, o cérebro é finamente seccionado usando um instrumento conhecido como microtome. As fatias são então montadas em lâminas e permitidas a secar.

Como a maioria dos corantes são à base de água, o tecido precisa ser desaboado e rehidratado antes que a coloração possa começar. Para isso, os slides são enxaguados em xileno para dissolver a cera antes da reidratação gradual através de uma série de etanol cada vez mais diluído. Este processo deve ser realizado em um capuz de fumaça enquanto usa o equipamento de proteção individual apropriado.

Tendo preparado seu tecido cerebral, agora você está pronto para começar o procedimento de coloração.

O primeiro passo, conhecido como bloqueio, reduz a coloração de fundo causada pela ligação de anticorpos não específicos. Expor a seção ao soro realiza isso introduzindo anticorpos sem rótulo que se ligam a locais não-alvo. Após um bloqueio de 30 minutos para a noite, o tecido está pronto para incubação com anticorpos primários, que se liga a alvos moleculares específicos.

Os anticorpos geralmente são diluídos em uma solução de bloqueio contendo detergente, que interrompe as membranas celulares e permite que anticorpos entrem no citoplasma.

Após uma incubação durante a noite, o excesso de anticorpos primários são removidos por lavagens breves no buffer. Em seguida, os anticorpos secundários, conjugados a enzimas ou fluoroforos, são introduzidos para rotular especificamente os anticorpos primários. Várias horas depois, o excesso de anticorpos é removido com múltiplas alterações de buffer.

Agora que os alvos foram rotulados, vamos falar sobre como detectá-los. Para secundários conjugados por enzimas, isso é realizado pela introdução de um substrato cromogênico. Quando o substrato interage com a enzima, ocorre uma mudança de cor, daí o termo “cromogênico”. Uma vez que a coloração desejada é alcançada, tipicamente após cerca de 2 minutos, a reação é interrompida por imergir rapidamente as seções na água.

Após a coloração de anticorpos, um segundo passo ainda pode ser necessário para fornecer algum contexto neuroanatomômico aos resultados. Por exemplo, você pode optar por aumentar o contraste tecidual usando uma mancha de Nissl. Este procedimento se baseia em corantes básicos como o violeta cresyl, que interagem com ácidos nucleicos.

O primeiro passo é filtrar a solução de corante para remover cristais não resolvidos. Os slides são então incubados na mancha até que o contraste desejado seja alcançado. Em seguida, lave as seções em várias mudanças de água para parar a mancha.

Os slides são então imersos em uma série de álcool para limpar o excesso de manchas e desidratar as fatias. Após a desidratação, as fatias são limpas com xileno, que remove o álcool, e melhora a imagem, uma vez que possui propriedades de difração leve semelhantes às do tecido.

Para preservar as seções manchadas para análise posterior, cubra com um meio de montagem permanente e deixe secar durante a noite.

Agora que delineamos os procedimentos e metas de coloração, vamos olhar para algumas aplicações.

Em primeiro lugar, a coloração histológica é usada rotineiramente para visualizar neurônios individuais. Por sua vez, a visualização é necessária para técnicas como microdissecção de captura a laser, na qual os pesquisadores usam um laser para isolar células específicas cultivadas em uma película fina. O material genético pode ser extraído das células manchadas e dissecadas, permitindo que os pesquisadores investiguem a expressão genética específica dos neurônios.

A coloração também pode ser empregada para caracterizar características morfológicas de neurônios individuais. Neste experimento, a imunohistoquímica é realizada em células expressando GFP para visualizar dendritos formadores de sinapse. A coloração é comparada entre células normais e ativadas, revelando que os dendritos sofrem múltiplas alterações em resposta à ativação de estímulos.

Finalmente, graças à especificidade do IHC, a expressão de proteínas individuais pode ser usada para identificar a localização e identidade de populações celulares únicas no sistema nervoso. Por exemplo, a coloração do cerebelo do camundongo com anticorpos zebrin 2 revela a localização de neurônios especializados conhecidos como células Purkinje.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à coloração direcionada de fatias cerebrais. Neste vídeo demonstramos os métodos gerais e objetivos de coloração, além de procedimentos específicos para coloração de IHC e Nissl.

Obrigado por assistir!

Transcript

Slices, or sections, of brain tissue are a rich material for studying the structure and function of the brain. However, untreated brain is a visually uniform tissue, like a blank canvas. Staining is a way of “painting” the brain to clearly visualize the cellular, structural, and molecular components of the organ. While most stains share common histological methods, each approach has a unique morphological target. This video will provide an outline of the general principles of brain histology, demonstrate some common staining techniques, and review a few applications of these methods in neuroscience labs today.

Before discussing how neurological staining procedures are carried out, lets review the goals of these techniques.

Histological stains are commonly used to provide contrast, thereby revealing features that cannot be distinguished in unstained tissue. For instance, to visualize the neuron cell bodies, or somata, that make up the gray matter of the nervous system, multiple stains are available. The dyes used in Nissl stains attach to nucleic acids, coloring the somata purple and revealing neuronal organization.

Alternatively, to look at white matter, you can stain myelin – the fatty acid sheath surrounding axons – with dyes like Luxol Fast Blue. Alternatively, immunohistochemical staining can highlight molecular targets found on specific cell types. This technique takes advantage of the specificity between antibodies and molecular targets known as antigens. The use of antibodies fused to enzymes or fluorescent compounds allows researchers to visualize their binding sites using enzymatic reactions or fluorescence.

Now that you’ve been introduced to the idea of staining sections, lets look at the common histological steps that precede brain tissue staining and ensure optimal conditions for visualization.

To preserve tissue structure, the brain is first perfused – meaning the blood is drained from the brain and the animal’s vasculature is used to deliver a chemical fixative. After dissection, the brain is fully immersed in fixative to complete the preservation process.

Next, the specimen is embedded in a medium with similar mechanical properties to brain tissue, like paraffin wax. After embedding, the brain is thinly sectioned using an instrument known as a microtome. The slices are then mounted on slides and allowed to dry.

Since most dyes are water-based, the tissue needs to be dewaxed and rehydrated before staining can begin. To accomplish this, the slides are rinsed in xylene to dissolve the wax prior to gradual rehydration through a series of increasingly diluted ethanol. This process should be carried out in a fume hood while wearing the appropriate personal protective equipment.

Having prepared your brain tissue, you are now ready to begin the staining procedure.

The first step, known as blocking, reduces background staining caused by nonspecific antibody binding. Exposing the section to serum accomplishes this by introducing unlabeled antibodies that bind to non-target sites. After a 30-minute to overnight block, the tissue is ready for incubation with primary antibody, which binds to specific molecular targets.

Antibodies are usually diluted in a blocking solution containing detergent, which disrupts cell membranes and allows antibodies to enter the cytoplasm.

After an overnight incubation, excess primary antibodies are removed by brief washes in buffer. Next, the secondary antibodies, conjugated to enzymes or fluorophores, are introduced to specifically label the primary antibodies. Several hours later, excess antibodies are removed with multiple changes of buffer.

Now that the targets have been labeled, let’s talk about how to detect them. For enzyme-conjugated secondaries, this is accomplished by introduction of a chromogenic substrate. When the substrate interacts with the enzyme, a color change occurs, hence the term “chromogenic”. Once the desired staining is achieved, typically after about 2 minutes, the reaction is stopped by quickly immersing the sections in water.

After antibody staining, a second step may still be required to provide some neuroanatomical context to the results. For example, you may choose to enhance tissue contrast using a Nissl stain. This procedure relies upon on basic dyes like Cresyl violet, which interact with nucleic acids.

The first step is to filter the dye solution to remove undissolved crystals. The slides are then incubated in stain until the desired contrast is achieved. Then, wash the sections in multiple changes of water to stop the staining.

The slides are then immersed in a series of alcohol to clear excess stain and dehydrate the slices. After dehydration, the slices are cleared with xylene, which removes the alcohol, and improves imaging since it has light diffraction properties similar to those of the tissue.

To preserve the stained sections for later analysis, coverslip with a permanent mounting medium and let dry overnight.

Now that we have outlined the procedures and goals of staining lets look at some applications.

First off, histological staining is routinely used to visualize individual neurons. In turn, visualization is required for techniques like laser capture microdissection, in which researchers use a laser to isolate specific cells grown on a thin film. Genetic material can be extracted from the stained and dissected cells, allowing researchers to investigate neuron-specific gene expression.

Staining may also be employed to characterize morphological features of individual neurons. In this experiment, immunohistochemistry is performed on cells expressing GFP to visualize synapse-forming dendrites. Staining is compared between normal and activated cells, revealing that dendrites undergo multiple changes in response to activating stimuli.

Finally, thanks to the specificity of IHC, the expression of individual proteins can be used to identify the location and identity of unique cell populations in the nervous system. For example, staining of the mouse cerebellum with zebrin 2 antibodies reveals the location of specialized neurons known as Purkinje cells.

You’ve just watched JoVE’s introduction to targeted staining of brain slices. In this video we have demonstrated the general methods and goals of staining, in addition to specific procedures for IHC and Nissl staining.

Thanks for watching!

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