Quantificação de Orofacial nos fenótipos Xenopus

O objetivo geral do procedimento a seguir é descrever os fenótipos faciais orais de embriões xap Levis de maneira estatística quantitativa. Isso é conseguido montando primeiro cabeças de embriões xip destacadas em um molde de argila para documentação fotográfica usando as imagens. As dimensões faciais são medidas para fornecer informações sobre o tamanho da região facial oral.

Em seguida, os pontos de referência são aplicados por meio de morfometria geométrica para avaliar a forma da região facial oral. Os resultados mostram mudanças significativas de tamanho e forma na região facial oral de Opus com base em análises estatísticas das dimensões faciais e posição relativa do ponto de referência. Embora esse método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento opus ou facial, ele também pode ser aplicado a outros estudos de morfologia de vertebrados, como comparações de espécies intimamente relacionadas para fins evolutivos ou ecológicos.

Esta seção descreve como fazer pratos de linha de argila para segurar cabeças de embriões para sua documentação fotográfica. Primeiro, alise um pouco de massa de modelar em um prato de qualquer tamanho e alise-o para cobrir todo o prato. Em seguida, pressione levemente uma agulha reta na argila em um ângulo de 45 graus.

Segure a agulha com firmeza e mova lentamente o prato para criar uma linha deprimida. Em seguida, use uma pipeta de vidro para fazer depressões circulares rasas ao longo de cada linha. Em cada depressão, uma cabeça de embrião pode ser colocada antes do carregamento.

As cabeças encheram o prato com PBT. Detalhes sobre a cultura de zap piss são descritos no protocolo de texto, bem como detalhes sobre a fixação de embriões. Para este protocolo, fixe os embriões entre os estágios 42 e 45.

Primeiro, coloque os embriões fixados em uma placa de Petri de 150 milímetros contendo aproximadamente 100 mililitros de PBT. Agora, corte suas cabeças. Primeiro, segure um embrião com um par de pinças e use um bisturi para fazer uma incisão na parte posterior do intestino.

Em segundo lugar, faça uma incisão no lado anterior do intestino perto do coração para remover completamente a cabeça. Usando uma pipeta, transfira as cabeças para o prato de linha de argila. É fundamental que as cabeças dos embriões sejam colocadas na argila exatamente na mesma orientação para a fotografia.

Para garantir o sucesso, use as linhas desenhadas na argila como guias. Também é benéfico se a mesma pessoa capturar todas as imagens no mesmo dia. Para vista frontal, as fotografias posicionam as cabeças com o lado posterior voltado para baixo nas depressões.

Use uma pinça para manipular as cabeças e a argila ao redor, de modo que as cabeças fiquem fixas de frente para a câmera e não sejam inclinadas para a visão lateral. As fotografias posicionam as cabeças de forma que seus lados fiquem todos voltados para a mesma direção. Manipule as cabeças e a argila ao redor, de modo que as glândulas de cimento apontem para baixo no mesmo ângulo.

Agora, usando qualquer microscópio de dissecção com recursos de captura de imagem, colete imagens das cabeças dos girinos. Use várias luzes para evitar sombras excessivas e use a maior ampliação possível. Fotografe cada cabeça da mesma maneira.

Em seguida, salve as imagens descompactadas e na resolução mais alta possível. A partir das imagens, medir as dimensões faciais orais. Primeiro, determine a largura da face.

Identifique os pontos em que a parte ventral de cada olho encontra as periferias da face e meça a distância entre esses pontos. Detalhes sobre a medição da altura da face e da área facial oral podem ser encontrados no protocolo de texto. Preste atenção especial à determinação do comprimento do focinho Nas imagens laterais, faça uma linha vertical que marque a parte anterior do olho.

Em seguida, meça a distância horizontal do ponto mais anterior onde a face encontra a borda dorsal da glândula de cimento até a linha vertical que marca a parte anterior do olho. Outras dimensões, como largura da boca e redondeza, são explicadas no protocolo de texto para esta análise, as coordenadas do ponto de referência facial devem ser padronizadas e salvas em um arquivo. Os pontos de referência devem capturar a forma da imagem e ser utilizáveis em todas as imagens.

Portanto, não use estruturas que podem não existir em todas as amostras. Agora abra o primeiro arquivo de imagem. Para avaliar, selecione a guia de plug-ins na barra de ferramentas principal e escolha seletor de pontos.

No menu suspenso, selecione a guia adicionar pontos e posicione os pontos de referência na imagem. Eles aparecem como multicoloridos. As cruzes alternam entre os pontos de referência usando a ferramenta Mover cruzes.

Depois que todos forem colocados, selecione a guia exibir resultados na barra de ferramentas principal e escolha a opção mostrar. Isso exibe as coordenadas do ponto de referência. Em seguida, copie as coordenadas em um programa de planilha em uma linha vazia acima do tipo de dados colado LM igual seguido pelo número de pontos de referência na amostra na linha abaixo.

A ID do tipo de dados colada é igual a seguida pelo nome que identifica a amostra. Cada exemplo deve ter um identificador exclusivo. Repita esse processo até que todas as imagens de amostra tenham sido mapeadas e inseridas na planilha.

Em seguida, copie as colunas com uma identificação de amostra e coordenadas de cada ponto de referência e salve-as em um documento de texto. Em seguida, abra o programa de software morfométrico. Neste software, selecione criar novo conjunto de dados no menu principal.

Nomeie o arquivo e o conjunto de dados na tela pop-up e importe o arquivo como um TPS. Agora selecione um arquivo de texto de coordenadas para criar o conjunto de dados. Em seguida, execute um ajuste e alinhamento de procrustes.

Primeiro, realce o conjunto de dados na guia da árvore do projeto. Em seguida, escolha as preliminares na barra de ferramentas principal e as novas procrustes se encaixam no menu suspenso. Nas seleções disponíveis, escolha alinhado pelo eixo principal.

Em seguida, selecione a opção para executar o ajuste do crusty de volta no menu suspenso preliminares, selecione gerar matriz Covance e selecione Executar. Agora, na guia de resultados, visualize as correlações da matriz de Covance. Para distinguir amostras de grupos experimentais e de controle, crie um arquivo de classificação atribuindo cada amostra no conjunto de dados à variável de classificação apropriada.

Em uma planilha, crie uma coluna rotulada ID e crie uma coluna rotulada tratamento. Em seguida, liste cada exemplo na coluna ID e atribua-o a um grupo. Na coluna de tratamento, salve-o como um arquivo de texto e, no programa de software morfométrico, importe-o por meio da opção escolher correspondência por identificador.

Agora, na guia de comparação, crie uma transformação de análise de função discriminante no menu pop-up. Nessa função, certifique-se de que o conjunto de dados apropriado esteja selecionado e que o tipo de dados seja as coordenadas de ajuste de procusto. Destaque os pares de grupos a serem comparados e, em seguida, execute um teste de permutação de 1000.

Para visualizar o mapa vetorial das coordenadas, vá para o menu de gráficos e selecione a guia de diferença de forma. Se a imagem estiver invertida, abra o menu pop-up no espaço de plotagem para inverter o diagrama para a orientação correta. Além disso, no menu pop-up, altere o gráfico para uma grade de transformação para sobrepor os vetores em detalhes de uma grade na criação de uma análise de componente principal.

Análise de componentes do princípio do gráfico de dispersão. As grades de transformação CVA, gráfico de dispersão e grades de transformação CVA são todas fornecidas no protocolo de texto. Os embriões foram tratados com um receptor micromolar de ácido retinóico ou inibidor de RAR do estágio de desenvolvimento 24 ao estágio 30 e, em seguida, fixados no estágio 42 e embriões de controle fotografados tratados com DMSO desenvolvidos.

Normalmente, o tratamento com inibidores de RAR resultou em um estreitamento das anormalidades oculares da face e uma boca de formato triangular malformada. Após a realização de uma análise morfométrica geométrica, a variância foi avaliada por meio da análise de componentes principais. Os embriões tratados foram claramente distinguidos dos controles.

Ao longo do eixo do PC um, as setas identificam outliers estatísticos de dentro de um grupo. As diferenças morfológicas foram avaliadas em seguida por uma análise de função discriminante. Mudanças dramáticas na posição dos pontos de referência laterais indicam um estreitamento do formato do rosto.

Uma ligeira mudança para fora na posição da narina é notada pelas setas. Há também uma deformação notável na região do terço médio da face. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar uma combinação de medidas tradicionais de tamanho e morfometria geométrica para avaliar o tamanho e a forma da face embrionária de Theus.