Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar uma triagem química em embriões de peixe-zebra usando processamento manual de amostras. Isso é conseguido primeiro colocando o peixe-zebra adulto em câmaras de acasalamento com uma divisória durante a noite e, em seguida, removendo a divisória na manhã seguinte para coletar embriões. Em seguida, grupos de embriões de peixe-zebra são dispostos em placas de 96 poços e, em seguida, tratados com um medicamento no estágio de desenvolvimento desejado.

Em seguida, os embriões podem se desenvolver fixados com 4% de paraldeído e ensaio para avaliar os efeitos de pequenas moléculas no processo de desenvolvimento de interesse. Os resultados mostram mudanças no desenvolvimento, como o ganho ou perda de domínios de expressão gênica que podem indicar alterações na morfogênese do sulfato ou do tecido causadas pelas pequenas moléculas que foram interrogadas. As implicações dessa técnica se estendem ao tratamento clínico de uma variedade de doenças devido à capacidade de identificar compostos potencialmente terapêuticos.

Geralmente, indivíduos novos nessa técnica podem ter dificuldades porque precisam adquirir a destreza necessária para trabalhar com embriões, como transferi-los entre placas de vários poços sem danos. Demonstrando o procedimento estaremos eu e Eric Donahue, um pesquisador de graduação no laboratório Para configurar acasalamentos de peixes-zebra. Use câmaras de acasalamento com divisórias, coloque o peixe-zebra macho adulto de um lado da divisória e o peixe-zebra fêmea adulta do outro lado.

Para cada placa de 96 poços de pequenas moléculas a serem testadas. Configure 25 tanques de acasalamento e deixe-os durante a noite. No dia seguinte, remova a câmara que separa cada par de peixes e, após uma hora, use uma peneira de malha fina para coletar os embriões antes de colocá-los em placas de Petri contendo meio E três com uma pipeta de transferência.

Remova os detritos das placas e sob um estereoscópio. Observe cada ninhada de embriões e remova todos os ovos não fertilizados. Transvase o E três médio e substitua por um novo E três.

Em seguida, coloque cada prato de embriões em uma incubadora a 28,5 graus Celsius por duas horas. Verifique as placas novamente e descarte quaisquer ovos não fertilizados adicionais. Continue a incubar os embriões até o estágio 40% eely.

Remova a placa da biblioteca química de menos 80 graus Celsius. Use papel alumínio para cobri-lo e deixe-o descongelar em temperatura ambiente com uma pipeta de oito canais. Adicione 99 microlitros de E três às colunas dois a 12 de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione um microlitro dos compostos apropriados aos poços nas colunas dois a 11 aqui, designados como amostras experimentais Pipete um microlitro de DMSO na coluna de controle aqui projetada para ser a coluna 12. Use papel alumínio para cobrir a placa de diluição e devolva a biblioteca química de estoque ao freezer. Em seguida, depois de selecionar uma placa de Petri contendo embriões no estágio 40% epi, use uma pipeta de transferência para colocar cuidadosamente cerca de 10 embriões por poço nas colunas dois a 12 de 96.

Placa de poço. Use uma pipeta de transferência de vidro para remover o excesso de E três de cada poço e expulse para um recipiente de resíduos líquidos. Para tratar quimicamente os embriões, transfira 100 microlitros de cada diluição química da placa de 96 poços para o respectivo poço de embriões para criar uma câmara úmida com uma toalha de papel e coloque-a em um recipiente sensível à luz.

Grande o suficiente para conter uma placa de 96 poços. Em seguida, use um tapete de teto para selar a placa. Coloque-o no recipiente sensível à luz e incube-o a 28,5 graus Celsius pelo tempo desejado.

Para remover os produtos químicos, adicione 300 microlitros de E três a cada fileira de poços tratados com medicamentos. Em seguida, retire o meio antes de usar E três para lavar os embriões três vezes para fixar os embriões, transfira-os para quatro placas de 24 poços rotuladas, colocando a pipeta na frente de um fundo escuro. Após cada transferência de poço para identificar os embriões deixados na pipeta e evitar o cruzamento, remova todos os embriões mortos.

Retire o E três para que os embriões fiquem submersos em líquido. Em seguida, use uma pipeta de vidro para adicionar duas gotas de 50 miligramas por mililitro de pronase a cada uma. Bem, incube os embriões por cinco minutos antes de agitar os poços para fazer com que o Corian se quebre.

Depois de usar E três para lavar os embriões duas vezes, retire e descarte o E três restante. Adicione 4%P-F-A-P-B-S a cada poço e incube os embriões durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, execute uma tela de interesse, como hibridização in situ de montagem em furo, ou deseje pontuar os embriões da tela química, conforme descrito no protocolo de texto.

Transfira-os para placas de 12 poços marcadas antes de usar um microscópio estéreo para observá-los, conforme descrito neste diagrama. É prático para uma única pessoa realizar uma triagem genética química em aproximadamente 600 compostos ao longo de nove semanas de esforço dedicado, e esse tempo pode ser reduzido para três semanas se realizado por três pessoas. Assim, o tempo de bancada de uma ou algumas pessoas pode contornar a necessidade de equipamentos de alta demanda de recursos, como sistemas automatizados.

Como mostrado aqui, embriões de peixe-zebra foram submetidos a compostos individuais de uma biblioteca bioativa de 50% das pessoas a 24 HPF e, em seguida, ensaiaram por desejo, usando um coquetel de três sondas ribo para detectar segmentos de néfrons. Como exemplo, o sistema de classificação, um composto que resultou em um túbulo contorcido proximal dramaticamente aumentado ou PCT será categorizado como classe um, que representa a classe associada ao defeito mais grave e ao maior nível de confiança no fenótipo observado. O composto seria então anotado como PCT de classe um.

Além disso, essa classificação fornece uma maneira simples e rápida de descrever uma pequena molécula de interesse, incluindo a gravidade de seu efeito no organismo, a região afetada pela droga e a maneira como a região é afetada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar seus embriões no momento correto do desenvolvimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma triagem química manual com embriões de peixe-zebra.