Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

O objetivo geral deste procedimento é determinar a concentração viral por meio da quantificação de variantes infecciosas por meio da contagem de placas discretas em cultura de células. Isso é feito primeiro plaqueando as células para formar uma monocamada confluente para infecção. O segundo passo é realizar a diluição seriada da amostra viral desconhecida a ser quantificada.

Em seguida, as monocamadas confluentes são infectadas usando a diluição seriada do estoque viral, seguida pela aplicação de uma cobertura imobilizadora. A etapa final é fixar e corar as placas após o tempo de incubação adequado para o vírus em questão, a fim de contar as placas discretas. Em última análise, os ensaios de placa podem ser usados e modificados de várias maneiras diferentes para determinar os títulos virais de uma amostra viral desconhecida.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a sobreposição semissólida, é que a aplicação e a remoção são muito mais simples tanto em aplicações tradicionais quanto de alto rendimento. Além disso, não é necessário aquecimento dos reagentes. As implicações desta técnica se estendem à pesquisa de muitos vírus líticos diferentes, como o uso de uma camada líquida.

Em um formato de 96 poços, permite a triagem rápida de novos compostos terapêuticos, o que pode diminuir muito as longas horas gastas no laboratório realizando ensaios tradicionais de placa No dia anterior à placa de ensaio, as células apropriadas para o vírus em questão, a fim de atingir 90 a 100% de fluência no dia da infecção. As soluções estoque também podem ser preparadas no dia anterior ao ensaio: primeiro prepare uma solução de fixação de formaldeído a 10% em água destilada misturando 5,56 mililitros de formaldeído a 36% com 14,44 mililitros de água destilada. Em seguida, prepare a mancha violeta de cristal consistindo de 1% de violeta de cristal em 20% de etanol diluído em água destilada.

Em seguida, enquanto trabalha em condições estéreis, prepare os dois meios de placa x apropriados para o tipo de células que estão sendo usadas. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 mícron se algum dos reagentes não for estéril. Preparar uma camada líquida para uso no ensaio de placa a 2,4 gramas de célula avy para um frasco contendo 97,6 mililitros de água destilada que se mistura rapidamente com uma barra de agitação.

Misture a solução em temperatura ambiente até que fique muito viscosa para a barra de agitação. Neste ponto, transferir o balão para um agitador e agitar fortemente durante 30 minutos para assegurar uma homogeneização homogénea. Por fim, autoclave a solução a 121 graus Celsius a 14 PSI por 30 minutos.

E quando o programa terminar, armazene lacrado em temperatura ambiente para uma sobreposição de aros. Prepare uma solução estoque de 0,6% de agro em água destilada. Misture com uma barra de agitação e autoclave para colocar em solução ou uma camada de carboximetilcelulose.

Prepare uma solução de 2% de carboximetilcelulose em água destilada e misture em autoclave como antes do dia seguinte ao revestimento. Use um microscópio invertido para verificar a fluência e a viabilidade das células antes de iniciar o ensaio. Certifique-se de que as células exibam morfologia celular padrão e aproximadamente 90% de fluência de co.

Realize uma diluição em série de dez vezes das amostras infecciosas em meios de crescimento celular, variando o número de diluições necessárias com base no título esperado do vírus em questão. Além disso, prepare uma amostra de controle não infectada para garantir de forma independente a viabilidade celular e auxiliar na identificação da placa. Pipetar o controlo não infectado e a diluição em série para os poços da placa, tendo o cuidado de não perturbar a monocamada.

Use um volume suficiente de inóculo para cobrir as células, mantendo o volume o mais baixo possível para maximizar o contato viral com a monocamada. Coloque as placas na incubadora de cultura de tecidos e infecte as células por 45 minutos a uma hora a cada 20 minutos. Balance suavemente as placas para garantir uma cobertura uniforme e evitar que a monocamada celular seque durante a infecção.

Prepare a solução de trabalho de sobreposição para sobreposições líquidas. Misture meios de placa aquecidos e 1,2 a 2,4% de temperatura ambiente Célula de ave de estoque em uma proporção de um para um para obter uma solução de trabalho de 0,6 a 1,2% de meio de sobreposição de célula avy ou AROS ou CMC sobreposições de mídia de placa aquecida mista e uma solução de estoque de 0,6% AROS ou 2% CMC aquecido em uma proporção de um para um. Em seguida, coloque em banho-maria a 56 graus Celsius, 30 minutos para equilíbrio de temperatura.

Certifique-se de que a solução esteja quente, mas não quente ao toque, para evitar a morte celular e reduzir os títulos virais. Após a infecção, aplique as sobreposições nas monocamadas infectadas após a adição da sobreposição Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a 14 dias, dependendo do vírus que está sendo analisado, para fixar as células com uma sobreposição líquida, despeje ou aspire a camada de células e, em seguida, pipete a solução de formaldeído a 10% nos poços e fixe em temperatura ambiente por 30 minutos durante a noite ou aros ou CMC diretamente. Adicione a solução de formaldeído à cobertura por uma hora a uma noite em temperatura ambiente após a fixação, descarte o formaldeído e remova manualmente os tampões semi-sólidos onde o aros com a espátula.

Enxágue as placas de células aby com água para remover o fixador de sobreposição residual antes da coloração. Para colorir, cubra as células com uma quantidade mínima de solução de cristal violeta por aproximadamente 15 minutos. Balance as placas, se necessário, para garantir uma cobertura uniforme.

Lave suavemente a mancha de cristal violeta com água, uma vez fixada, manchada e seca, armazene o plexo indefinidamente para análise futura. Conte as placas em cada poço descontando poços com menos de cinco ou mais de 100 placas. Tomar a média de quaisquer replicates técnicos da mesma diluição.

Observe o tamanho e a morfologia da placa. Determinar o título viral da amostra-mãe tomando o número médio de placas para uma diluição e o inverso do factor de diluição total. Esta imagem mostra comparações de sobreposição de placas do vírus da febre do Vale do Rift utilizando placas de 12 poços que foram plaqueadas em 2,5 vezes 10 das quintas células em placas de 12 poços e infectadas com 200 microlitros usando a mesma amostra inicial diluída em série de MP 12.

Após a infecção, sobreposições de 1,5 mililitro de 0,3% aros 0,6% AVY, ou 1% CMC foram aplicadas para comparar diretamente as sobreposições. Este histograma mostra os resultados da contagem de placas e títulos para todas as três sobreposições. Aqui. As comparações de sobreposição de placas ViiV utilizando placas de 12 poços são mostradas que as agências foram plaqueadas como antes e infectadas com um volume de 200 microlitros usando a mesma amostra inicial diluída em série da cepa da vacina ViiV TC 83 após a infecção, sobreposições de 1,5 mililitro de 0,3% aros 0,6% célula avy ou 1% CMC foram aplicadas como antes.

Novamente, o histograma mostra os resultados da contagem de placas e títulos para todas as três sobreposições. Esta imagem mostra um exemplo de sobreposições de placas de alto rendimento. Uma placa de 96 poços de VIRs plaqueada em três vezes 10 das quartas células por poço foi infectada com 50 microlitros de inóculo usando a mesma amostra inicial diluída em série do vírus da febre do Vale do Rift MP 12 por uma hora em duplicata quádrupla para as sobreposições 0,6 e 1,2% As concentrações finais de células avy foram testadas para determinar a viabilidade e reprodutibilidade da utilização de sobreposições líquidas de maneira de alto rendimento.

Este histograma mostra os títulos determinados a partir de cada sobreposição. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada vírus é diferente e otimizações, incluindo a utilização de diferentes tipos de células, tempos de incubação e/ou meio de crescimento, podem ser necessárias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio básico de placa utilizando revestimentos líquidos e semissólidos.