Name: Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a determinar concentração viral usando ensaios de placa com sobreposição líquida de celulose microcristalina. Este método simplifica a aplicação e remoção, facilitando a triagem de compostos terapêuticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer à FMC BioPolymer USA pelas amostras de produtos da Avicel. Este trabalho foi apoiado pela concessão HDTRA1-13-1-0005 da Agência de Redução de Ameaças de Defesa para KK e pela concessão de pesquisa do NIH 1R15AI100001-01A1 para KK.

1. Preparação de Células e Reagentes <ol><li> No dia antes do ensaio, placa de células hospedeiras apropriadas para o vírus em questão (Tabela 1 e 2) em 90 - 100% de confluência. </li><li> Preparar a solução de fixação de 10% de formaldeído em dH 2 O. No exemplo, misturar 5,56 ml de estoque 36% de formaldeído, com 14,44 mL de H 2 O destilada (dH2O). NOTA: Use as práticas de manuseio seguro adequado e ventilação quando se utiliza formaldeído. </li><li> Prepare a mancha violeta de cristal: 1% de cristal violeta (CV) em etanol a 20% e dH 2 O. </li><li> Prepare a mídia de placa 2x (tipo de célula dependente na concentração 2x; ver Tabela 2). Filtrar através de um filtro de 0,2 um, se quaisquer reagentes não são estéreis. </li><li> Preparação de sobreposições de imobilização (Tabela 3) <ol><li> Para sobreposições de líquidos, fazer uma solução estéril de 2,4% de Avicel em dH 2 O. Para evitar aglomeração, adicionar o pó a um balão contendo água tha mistura é rapidamente com uma barra de agitação, verter em Avicel lentamente e agita-se rapidamente à temperatura ambiente (RT). Quando a solução for muito viscoso para uma barra de agitação para homogeneizar, mudar para um shaker frasco para&gt; 30 min com agitação pesado para garantir uma homogeneização. NOTA: As soluções de reserva pode ser feita em concentrações mais baixas, mas as soluções podem separar-se e terá de ser remisturado para assegurar a homogeneização. As soluções de trabalho de Avicel pode ser utilizado variando 0,6-3%. </li><li> Após homogeneização, a solução autoclave selado e armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Para agarose e carboximetilcelulose (CMC) sobreposições, preparar uma solução de reserva em dH2O de 2% de CMC ou 0,6% de agarose. Misture com uma barra de agitação e autoclave ou forno de microondas para trazer a solução. </li></ol></li></ol> 2. As diluições e Infecções <ol><li> No dia após o plaqueamento, verificar visualmente a confluência e viabilidade das células antes de se iniciar o ensaio. Certifique-se de um padrão celular morfologiand uma monocamada confluente ~ 90% está presente. </li><li> Realizar uma diluição em série de dez vezes das amostras infecciosas. Usar o meio de crescimento celular para a propagação viral como diluente (Tabela 2). Variar o número de diluições necessárias com base na titulação esperada do vírus em causa, e sempre usar uma amostra de controlo não infectado, independentemente, para assegurar a viabilidade celular e ajuda na identificação de placas. </li><li> A partir das diluições em série, infectar as células durante 45 min a 1 h (Tabela 1). Utilizar um volume suficiente de inoculo para cobrir as células, mantendo o volume tão baixo quanto possível para maximizar o contacto com a monocamada viral (Tabela 4). Placas rochosas suavemente a cada 20 min para garantir uma cobertura uniforme e evitar a monocamada celular de secagem. </li><li> Após a infecção, sobrepor um volume apropriado de meio de imobilizar directamente para os inóculos no poço (Tabela 2) usando uma mistura 1: 1 de 2 x media de placa e o immobilizing sobreposição de escolha (CMC, agarose ou Avicel). Agite suavemente para misturar. <ol><li> Para sobreposições de líquidos, misture 1: 1 com aquecido mídia chapa 2x e 1,2-2,4% da RT Avicel para obter uma solução de trabalho de 0,6-1,2% Avicel meio de cobertura. </li><li> Para obter uma camada de agarose, utilizar uma mistura 1: 1 de meios de placa 2x aquecido e uma solução de estoque de 0,6% de agarose aquecido, em lugar de um C num banho de água a 56 ° durante 30 minutos para equilibrar a temperatura a obtenção de uma concentração final de agarose / sobreposição de 0,3 %. </li><li> Para CMC, preparar uma solução stock de 2% e tratar como descrito para a sobrecamada de agarose. </li><li> Ao aplicar-se uma camada superior ao monocamada, sempre equilibrar agarose quente ou CMC numa água de 56 ° C para evitar danos na monocamada. Certifique-se de que a solução é quente, mas não quente ao toque para evitar a morte celular e reduzidos os títulos virais. A maioria das camadas de agarose vai começar a solidificar abaixo de 42 ° C, trabalhar rapidamente e / ou preparar pequenos lotes para evitar a solidificação durante o manuseio. </li></ol></li><li> Após a adição da sobreposição, incubar as placas para produzir chapas que são claramente distintos contáveis. A formação de placa pode demorar de 2-14 dias, dependendo do vírus a ser analisada, Tabela 1. NOTA: Uma vez que as placas sobrepostas líquidos são colocados na incubadora, não movê-los. Movimento das sobreposições de líquidos durante o período de incubação resultará em placas borratadas. Agarose e CMC sobreposições são semi-sólidas e podem ser movidos ou verificada periodicamente sob um microscópio de luz para monitorar o desenvolvimento da placa. </li></ol> 3. Fixação e coloração de células <ol><li> Para fixar as células, deitar fora ou aspirar o Avicel sobreposição, e fixar as células usando a solução de formaldeído a 10% durante 30 minutos a durante a noite (&lt;1 ml por poço para uma placa de 6 poços). <ol><li> Para agarose ou CMC, adicionar directamente a solução de formaldeído à sobreposição durante 1 hora a durante a noite. NOTA: As amostras podem ser mantidas por longos períodos de tempo no fixador desde que faznão evaporar e secar como isto pode falsear a monocamada. </li></ol></li><li> Antes da coloração e após a sua fixação, descartar o formaldeído e remover os bujões semi-sólidas para a agarose e CMC quer com água corrente ou manualmente com uma espátula. Lavar as placas Avicel com água para remover o residual de sobreposição / fixador antes da coloração. </li><li> Para a coloração, cobrir as células com uma quantidade mínima de solução de violeta de cristal durante ~ 15 min. Placas de rocha se necessário para garantir uma cobertura uniforme. </li><li> Delicadamente, lave a mancha violeta de cristal com água. Uma vez fixados, corados e seco, placas de loja por tempo indeterminado para análise futura. </li></ol> 4. Determinar virais Títulos <ol><li> Contar as placas em cada poço, considerando a média de todas as repetições técnicos da mesma diluição. Para grandes formatos de placas, poços de desconto com menos de 5 ou maior do que 100 placas. Tome nota do tamanho e morfologia de placas. O controle negativo deve ter uma monocamada uniforme epode ser usado como um controlo de referência. </li><li> Determinar o título viral da amostra stock tendo o número médio de placas para uma diluição e o inverso do factor de diluição total. </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Como um exemplo, 30 e 32 para as placas foram contadas repetições do 1 x 10 -7 diluição [31 (média) / 10 -7 (diluição) x 0,4 ml (inoculo)] iria originar um título de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+N.+Y%22%5BJournal%5D)">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li>
<li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li>
<li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).</li>
<li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63(2006).</li>
<li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technically+simple+%E2%80%98non-lethal%E2%80%99+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata%2C+Japan%2C+in+2004+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li>
<li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li>
<li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li>
<li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li>
<li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+%28MDCK%29+in+the+presence+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol.+%28Berl.%29%22%5BJournal%5D)">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar e nenhum interesse financeiro ou concorrente no protocolo ou nos produtos descritos.

O factor mais crítico para um ensaio de placa de sucesso encontra-se na optimização do protocolo para a cultura viral particular em questão como condições podem variar significativamente. Pontos-chave a ter em conta são: sediar compatibilidade celular com o vírus em questão, as condições de crescimento virais apropriadas, faixas de diluição suficientes, a fim de diferenciar claramente placas e seleção sobreposição correta e coloração para as células e os vírus em questão. Enquanto VEEV e RVFV tanto crescer sob condições muito semelhantes, utilizando muitos dos mesmos tipos de células hospedeiras, as diferenças na cinética de crescimento e morfologia de placas variar significativamente. Ao usar células Vero para ensaios de placa, que têm sido usados ​​tradicionalmente como uma linha de células de propagação e indicador de vírus da febre hemorrágica e alphaviruses, VEEV tipicamente cresce para títulos mais altos do que RVFV e demonstra um aumento da cinética de replicação, o desenvolvimento de placas uniformes grandes às 48 hpi 4, 10-12. Em contraste com VEEV, RVFV requer 72 hpi e demonstra placas que são tipicamente muito menor e variável em tamanho. Em oposição a RVFV e VEEV, o vírus da gripe é altamente específico da célula hospedeira e pode ser difícil de propagar através de cultura de tecidos. Para o vírus da gripe, a entrada viral e fusão é normalmente iniciado pela ligação do receptor da superfície celular com a glicoproteína hamagglutinin viral (HA), que medeia a entrada na célula-alvo através da ligação com o receptor da superfície ácido siálico-α da célula hospedeira. HA trimérico é uma glicoproteína que está presente no envelope da membrana de todos os vírus Influenza e requer clivagem para a subunidades HA1 e HA2 por uma protease célula hospedeira específica. Para complicar ainda mais a questão, estes sítios de clivagem muitas vezes pode variar entre 13 cepas virais. À medida que a expressão de proteases capazes de clivar HA é restrita a tecidos específicos, proteases ARe frequentemente adicionadas ao meio de cultura de células, a fim de facilitar a fusão viral e a entrada na célula hospedeira seleccionada 13. TPCK-tripsina é um exemplo de uma protease vulgarmente utilizado que é usado em cultura de células MDCK com ambos e células Vero: facilitar a replicação multi-ciclo (na ausência de qualquer soro de inactivação da tripsina) por meio da activação proteolítica de HA viral 14,15. Como demonstrado neste estudo e outros, as diferenças no ciclo de vida viral pode influenciar seleções de sobreposição, formatos de placas, e tempos de coleta, com variações significativas entre as diferentes classes e espécies de vírus. Em nosso estudo, camadas de agarose demonstrou placas claras em títulos mais elevados do que qualquer CMC ou sobreposições de líquidos, tanto para RVFV e vírus Influenza B, reforçando sua utilidade entre uma ampla gama de vírus e tipos de células. Usando uma baixa concentração final de agarose muito auxiliado na remoção dos plugues sólidos e coloração simplificada. CMC global mostrou a poorest eficácia como uma cobertura para todos os três vírus testados e muito pequenas e indistintas placas produzidas para o vírus da Influenza B. Embora CMC global mostrou as características menos desejáveis, a sua utilização em rápido crescimento e extremamente virulentas vírus poderia revelar-se vantajoso, como o fez aparecer para reduzir o tamanho da placa com apenas uma redução mínima na titulação. A sobreposição de líquido provou ser o mais versátil na medida em que era extremamente simples de preparar, maior facilidade de utilização, e a agarose foi comparável em todos os vírus seleccionados. Num formato de placa de maior rendimento de 96 poços, aplicação e remoção não foi inibida devido à solidificação como com sobreposições tradicionais, e proporcionaram resultados precisos e consistentes. A consideração ao usar sobreposições de líquidos reside na coloração opaca e incapacidade de controlar a formação de placas como as placas não podem ser movidos até o ponto de coleta, limitando essa adaptação ao vírus com cinética de replicação anteriormente caracterizados. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pequenas modificações nas condições de ensaio de placa pode alterar significativamente os resultados, bem como a avaliação e desempenho de qualquer novo sistema ou técnica é sempre garantido. Enquanto um protocolo de ensaio de placa otimizada e padronizada não existe para cada situação, o nosso relatório demonstram a versatilidade e facilidade de uso em tradicional, bem como sobreposições de líquidos para novos ensaios de placa, proporcionando um fundo suficiente para mais modificações do usuário.

O isolamento precisas e quantificação das amostras virais viáveis ​​tem sido consistentemente um objetivo a investigação em curso em virologia. Não era até o advento do ensaio de placa em 1952 que um meio para calcular quantitativamente e qualitativamente os títulos virais animais foi desenvolvido pela primeira vez 1,2. Esta técnica foi adaptada e modificada a partir de ensaios de fagos, os quais foram anteriormente utilizados para calcular os títulos de banco de bacteriófagos em planta biologia 1,2 primeiro. Enquanto meios alternativos para quantificação viral desde então têm sido desenvolvidos e adaptados, como imunoensaios, fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão, ajustável de detecção de pulso resistiva (TRPS), citometria de fluxo, sistemas de repórter recombinantes, e reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase com transcrição (qRT-PCR) , esses métodos não conseguem identificar e quantificar replicação virons competentes 1,3. Embora os avanços nas tecnologias e técnicas de continuar a aperfeiçoar e alterar a paisagem; PLAQUE os ensaios continuam a representar o padrão ouro na determinação das concentrações virais para virons líticas infecciosas 1,4. Durante um ensaio de placa, uma monocamada confluente de células hospedeiras está infectado com um vírus lítico de uma concentração desconhecida que foi diluída em série para uma gama contáveis, tipicamente entre 5-100 viriões. As monocamadas infectadas são então coberto com um meio de cobertura de imobilização para impedir a infecção viral a partir de indiscriminadamente, quer através de difusão do fluxo de convecção mecânica ou do meio líquido durante a propagação viral. Apesar da sobreposição sólidas ou semi-sólidas, tais como agarose, metilcelulose ou carboximetilcelulose (CMC) têm sido tradicionalmente utilizados, sobreposições de líquidos tornaram-se cada vez mais uma alternativa atraente, com o desenvolvimento de novas folhas de prova de líquidos, tais como Avicel 5- 7. Ensaios de placa utilizando líquido contra sobreposições tradicionais têm várias vantagens como a sobreposição pode ser applied à temperatura ambiente, e a aplicação e remoção é significativamente mais fácil. Como sobreposições líquidos não requerem aquecimento, vírus lábil delicados e de calor também pode revelar-se mais fácil de placa. Após a infecção inicial e aplicação da sobreposição imobilizante, placas individuais, ou zonas de morte celular, irá começar a desenvolver infecção como a replicação viral e são constrangidas para a monocamada circundante. As células infectadas irão continuar o ciclo de replicação de lise-infecção, mais de propagação da infecção, resultando em placas cada vez mais distintos e separados. Dependendo da cinética de crescimento viral e célula hospedeira utilizada, uma placa visível forma, normalmente, dentro de 2-14 dias. As monocamadas celulares podem então ser contadas com um microscópio de campo brilhante padrão, ou mais tipicamente fixo e contrastadas pelo vermelho ou cristal violenta neutro, a fim de identificar prontamente placas a olho nu. Há uma grande variedade de contra placa manchas disponíveis, cada oferta their vantagens e desvantagens específicas. O violeta de cristal é tipicamente adicionado na altura da recolha e após a fixação / remoção da cobertura, proporcionando um contador de mancha rápida e distinta, que permite a identificação de placas muito pequenas quando morfologia mista está presente. Vermelho neutro tem a vantagem de aplicação antecipada e constante contato com a sobreposição, permitindo o monitoramento ao vivo de desenvolver a formação de placas, o que é particularmente útil quando se trabalha com um desconhecido cinética de vírus ou de replicação. Nós descobrimos que a coloração no entanto não é geralmente tão distinta quando utilizando vermelho neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) oferece diversas vantagens, como as manchas de cor amarelo vivo corantes células placas azuis escuras e virais podem ser contados, sem remoção da sobreposição quanto com vermelho neutro. O alto contraste entre as células vivas e mortas oferecidas pela MTT também permite a detecção de pequenas placas em uma hora mais cedo a infecção ponto pós, Apesar de armazenamento ainda exigiria a remoção da cobertura 8. Como violeta de cristal pode ser feita simplesmente em uma solução de água e álcool, e proporciona um elevado grau de sensibilidade para a morfologia da placa mista, optámos-lo como um contador de manchas preferido e simplificado para o protocolo como demonstrado que estamos utilizando várias famílias de bem vírus caracterizados. Após fixação e coloração da monocamada celular infectada, as placas são contadas no fim titule banco de amostras virais em termos de unidades formadoras de placas (pfu) por mililitro. Uma gota de registo deve ser observado entre diluições em série e, dependendo do tamanho da placa, entre as placas foram contadas 5-100, com um controlo negativo utilizado como uma referência. Amostras estatisticamente irá variar em 10% para cada 100 placas contados quando se compara amostra replica 3. A vantagem de usar ensaios de placas para determinar os títulos virais reside na sua capacidade para quantificar o número real de partículas virais infecciosas within a amostra. Como múltiplos viriões poderia potencialmente infectar uma célula única, a terminologia de unidades contra virons é utilizado durante as titulações em placa 1,2. Morfologia da placa pode variar drasticamente sob diferentes condições de crescimento e entre espécies virais. Tamanho da placa, a clareza, a definição das fronteiras, e distribuição devem todos ser notado como eles podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento e fatores de virulência de vírus em questão. Os princípios básicos da placa de ensaio também pode ser adaptado e modificado num número de maneiras diferentes, tais como no uso de ensaios de formação de foco (FFAs). FFAs não dependem de lise celular e de contraste para detectar a formação de placa, mas sim empregar técnicas para detectar diretamente as proteínas virais intracelulares através de anticorpos marcados imunomarcação. O aumento da sensibilidade, diminuição dos tempos de incubação após a infecção, e mais importante a capacidade para quantificar os vírus não-líticos são todos distintosvantagens quando se emprega FFAs. Embora amplamente utilizados, os factores críticos que limitam FFAs em comparação com um ensaio de placa tradicional reside na necessidade de anticorpos apropriados e a capacidade de somente sonda para subunidades de proteínas virais contra viriões infecciosos 4 reais. Para o propósito deste estudo, vamos limitar nossa discussão para ensaios de placa clássicos e descrever o uso de sobreposições de sólidos e semi-sólidos tradicionais (agarose e CMC), juntamente com novas sobreposições de celulose líquido microcristalinas.

<table><tbody><tr><td>Placa CellStar de 6 poços para cultura de tecidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>Placa CellStar de 12 poços para cultura de tecidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>Placa CellStar de 96 poços para cultura de tecidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml placa de poço profundo</td><td>EUA Scientific</td><td>C15046314</td><td>Para diluições seriadas</td></tr><tr>Qualidade<td>DMEM</td><td> Biológicos</td><td>112 013 101</td><td>Meio Celular/Diluente</td></tr><tr><td>2x EMEM para placas</td><td>Biológicos de Qualidade</td><td>115 073 101</td><td>Quente a 37 &#176; C</td></tr><tr><td>MEM 100x&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Inativar o calor antes do uso a 62 &#176; C por 30 min</td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Faça alíquotas/Evite congelar e descongelar</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cristal</td><td>Violeta Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Formaldeído</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Etanol desnaturado Grau de Reagente</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Agite vigorosamente ao reconsitiuting&nbsp; por >30 min para homogeneizar a</td></tr><tr><td>Agarose UltraPura&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboximetilcelulose, Sal de Sódio Viscosidade Média&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

concentração determinação viral através de placa ensaios: usando tradicionais e novos sistemas de sobreposição

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Ensaios de placa continuam sendo um dos métodos mais precisos para a quantificação direta de virons infecciosas e substâncias antivirais através da contagem de placas discretas (unidades infecciosas e zonas mortas celulares) em cultura de células. Aqui demonstramos como realizar um ensaio básico placa, e como sobreposições e técnicas diferentes podem afetar a formação de placas e de produção. Tipicamente substratos sólidos ou semi-sólidos de sobreposição, tais como agarose ou carboximetil celulose, têm sido utilizados para restringir propagação viral, prevenindo a infecção indiscriminada através do meio de crescimento líquido. Sobreposições imobilizadas restringir a infecção celular para a monocamada imediatamente circundante, permitindo a formação de focos contáveis ​​discreta e subsequente formação de placa. Para superar as dificuldades inerentes ao uso de sobreposições tradicionais, uma sobreposição de líquido romance utilizando celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio tem sido cada vez mais utilizado como um substituto no padrãoensaio de placas. Ensaios de placas de sobreposição líquidos podem ser prontamente realizada em qualquer padrão 6 ou 12 formatos de placas, bem como por técnicas tradicionais e não requerem equipamento especial. Devido ao seu estado líquido e subsequente facilidade de aplicação e remoção, formatos de placas de microcultura podem, alternativamente, ser utilizado como uma alternativa de transferência rápida, precisa e de alta para titulações virais maior escala. O uso de um polímero líquido viscoso aquecido não oferece a oportunidade de agilizar o trabalho, conserva reagentes, espaço incubadora, e aumenta a segurança operacional quando usado em laboratórios de contenção tradicionais ou altos como nenhum aquecimento do reagente ou das suas obras são necessárias. Sobreposições de líquidos podem também revelar-se mais sensível do que as sobreposições tradicionais para determinados calor vírus lábil.

A capacidade dos ensaios de placas para avaliar com precisão os títulos virais depende de numerosos factores: selecção da célula hospedeira apropriada, meios apropriados e condições de crescimento para a viabilidade celular e viral, a propagação viral imobilizada, e uma determinação exacta do período de incubação viral para permitir um tempo adequado para distinta e formação de placas contáveis. Para este estudo, os vírus de três famílias representativas foram escolhidas para demonstrar as diferenças de: seleção de sobreposição, períodos de incubação e morfologia da placa através de diferentes tipos de amostras. Encefalite Equina Venezuelana (VEEV) foi seleccionada como um modelo viral (+) ssRNA, o que pode causar doença significativa em equinos e humanos e representa a família Togaviridae. Influenza B tensão Taiwan, um segmentado (-) vírus ssRNA infectando principalmente os seres humanos, representa a família Orthomyxoviridae. Rift Valley vírus da febre (RVFV), a (-) ssRNA artrópode nascido vírus infectando principalmente artrópodes,ruminantes e humanos, foi escolhido como representante da família Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), os títulos foram determinados a partir de uma solução de estoque de uma estirpe viva atenuada recombinante MP12 de RVFV em um formato de placa de 12 poços utilizando CMC, de agarose, ou sobreposições Avicel que foram incubadas lado-a-lado para a infecção de 72 h pós (IPH). Uma placa representativa mostrando diluições que variam de 10 -4 a 10 -7 pode ser visto no Painel A. As placas utilizando a CMC e camadas de agarose mostrou placas pequenas, claras e distintas com uma borda circular bem definido. As placas com uma sobreposição de líquido eram ligeiramente mais abundante e maior em comparação a agarose e as placas de CMC, e proporcionada uma fronteira menos distintas. Os títulos virais foram comparados no Painel B com todas as sobreposições de realização comparavelmente. A fim de obter uma comparação visual mais clara entre sobreposições para MP12, juntamente com uma amostra maior para determinar reproduçõeslidade, uma placa de 6 poços foi também testadas em triplicado (Figura 2). No formato de placa de 6 poços, a utilização de uma sobreposição de placas CMC apresentaram menores do que quer camadas de agarose ou líquidos, que eram comparáveis ​​em tamanho para o outro. Apesar de os títulos virais foram semelhantes entre todos os três sobreposições (Painel D), placas formadas em camadas de agarose e liquidas mostrou mais fáceis de contar, devido ao seu tamanho aumentado. Em contraste com RVFV, os títulos de VEEV e morfologia da placa entre as diferentes sobreposições variaram significativamente (Figura 3A). As placas formadas nas sobreposições CMC demonstraram uma morfologia clara e distinta quando se utiliza um formato de placa de 12, à custa do tamanho da placa e sensibilidade (Painel B). Em contraste com a CMC, a utilização de líquidos de agarose e sobreposições resultou em placas significativamente maiores, indicando menor inibição viral e aumento da sensibilidade à replicação VEEV. Isto foi confirmado anteriormente, quando apenas comparando agarose contra CMC em apaper publicado por Juarez et al. 4. Enquanto agarose e líquidos produzidos sobreposições placas maiores do CMC, as placas tinham fronteiras mal definidas e eram difíceis de contar em um formato bem 12, com sobreposições de líquidos que fornecem a maior difusão fronteira. Quando as placas foram testadas em placas de 6 poços (Figura 4), ​​o maior 6 formato bem negada a emissão de placas abertamente grandes que eram difíceis de diferenciar, no formato de 12 poços, com agarose e sobreposições líquidos provando superior às sobreposições CMC em termos de definição de placa bacteriana e sensibilidade (Figura 4D). Em comparação com RVFV ou VEEV, influenza oferece vários desafios quando da formação das placas, como a exigência de uma protease externa. A sensibilidade do vírus da gripe de diferentes selecções de sobreposição, também tem sido bem documentada no passado como alterações significativas foram notadas quando as modificações como menores, tal como as marcas de agarose ser diferentes têmen usado 9. Curiosamente para a estirpe de gripe B Taiwan, a utilização de CMC como uma sobreposição resultou em placas marcadamente menores que eram difíceis de contar e provou difícil de marcar de forma fiável (Figura 5A). A utilização de uma sobrecamada de agarose que proporcionaram os melhores placas (Painel C), e resultou em uma mancha mais escura do fundo (provavelmente devido ao aumento da viabilidade monocamada), e mostrou placas mais claras e nítidas em comparação directa com a utilização do líquido de sobreposição (Painel B ). Uma vantagem distinta de polímeros líquidos e sólidos mais de sobreposições semi-sólidas, tais como agarose e CMC, reside na facilidade de remoção e de aplicação. Sobreposições de semi-sólidos requerem aquecimento e solidificação pode revelar-se problemática quando o manuseio e remoção. A fim de aproveitar essas vantagens e para determinar a viabilidade de utilizar Avicel de uma forma de alto rendimento para RVFV, um formato de placa de 96 poços foi julgado em diferentes concentrati sobreposiçãoons (Figura 6). Para RVFV MP-12, diluições foram realizadas em quadruplicado em ambos os 0,6 e 1,2% concentrações finais de Avicel. Recobrimento e remoção provou simples, sem diferenças aparentes entre as repetições ou entre as concentrações observadas, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade. Quando conseguir, as placas eram distintos e contáveis ​​a olho nu, o que demonstra a viabilidade de utilização de sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento para RVFV. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 12 poços Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 5 células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC (c definitivaoncentrations), foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Três ml de sobreposições de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A, B, e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para painéis de AC, com as placas foram contadas e titulam-se no Painel D (N = 3). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;fortes&gt; VEEV placa comparações de sobreposição utilizando placas de 12 poços. Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 5 células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir da estirpe de vacina VEEV TC-83. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4:. V EEV comparações de sobreposição de placa, utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de VEEV TC-83. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou uma CMC de 1%, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstradoem Painéis A, B e C. experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para os Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: Influenza comparações de placas de sobreposição células MDCK foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de Influenza B Taiwan.. Nenhum soro fetal bovino (FBS) foi utilizado no meio de crescimento ou sobreposições, como FBS pode inibir a propagação da gripe por meio da inibição de determinadas proteases que são necessários para a fusão viral. TPCK-tripsina foi adicionada a todas as folhas de prova antes da aplicação, a fim de facilitar a fusão e a entrada viral com as células hospedeiras. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC foram aplicados a fim de comparar directamenteas sobreposições, tal como demonstrado no Painel A, B e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita no Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). Enquanto a média foi levado para placas CMC eles provaram difícil contar confiável como eles demonstraram fronteiras difusas e tamanhos de placas muito pequenas. <img alt="A Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Sobreposições de placas High Throughput Uma placa de 96 poços de Veros colocadas em placas a 3 x 10 4 culas por po, foram infectados com 50 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de RVFV MP12 durante 1 hora, em quadruplicado. Para as sobreposições, 0,6 e 1,2% de Avicel concentrações finais foram testadas a fim de determinar a viabilidade de utilização de reprodutibilidade e sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento, Painéis A e B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infecção </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> O tempo de incubação </td><td> 3 dias </td><td> 2 dias </td><td> 3 dias </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Placa condições do ensaio de inoculação e Celulares Tipos <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo de Crescimento</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Placa de mídia </td><td> A 2xEMEM </td><td> A 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina. 2. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina, 0,2% Albumina de Soro Bovino, 0,025% de HEPES, DEAE-dextrano com 50 ug / ml. A. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com FBS a 5% (25 ml), 1% Mínimo essenciais Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato de sódio (5 ml), 1% de L-Glutamina (5 ml), 2% de Pen / Strep (10 ml). B. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), com 50 ug / ml, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextrano, Tripsina-TPCK * * Pouco antes da preparação, adicione 1 ml por cada 25ml de 2 mg / ml de TPCK-tripsina à alíquota que será utilizado para misturar com agarose para placas. Tabela 2: Placa e Viral / Cellular Crescimento Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infecção </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> O tempo de incubação </td><td> 3 dias </td><td> 2 dias </td><td> 3 dias </td></tr></tbody></table> Soluções de sobreposição não irá expirar quando feito desde que a esterilidade seja mantida. Tabela 3: Sobreposições da <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 bem </td><td> 12 bem </td><td> 96 bem </td></tr><tr><td> N ° de células / poço </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volume de inóculo (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volume de sobreposição (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Formatos de Placa

Os ensaios de placa são o padrão-ouro para quantificação viral, utilizando sobreposições de aprisionamento em monocamadas celulares hospedeiras para determinar os títulos virais. Embora várias sobreposições semissólidas tenham sido tradicionalmente usadas, aqui demonstramos técnicas de placa comparando sobreposições semissólidas a uma nova celulose microcristalina líquida entre várias famílias de vírus.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a concentração viral por meio da quantificação de vírions infecciosos, contando placas discretas em cultura celular. Isso é realizado primeiramente cultivando células para formar uma monocamada confluente destinada à infecção. O segundo passo consiste em realizar diluições seriadas da amostra viral desconhecida a ser quantificada. Em seguida, as monocamadas confluentes são infectadas utilizando as diluições seriadas do estoque viral, seguido pela aplicação de uma camada sobreposta imobilizadora. O passo final é fixar e corar as placas após o tempo apropriado de incubação para o vírus em questão, a fim de contar as placas discretas. Em última análise, os ensaios de placa podem ser utilizados e modificados de diversas maneiras para determinar os títulos virais de uma amostra viral desconhecida.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a camada semissólida, é que a aplicação e remoção são muito mais simples tanto em aplicações de alto rendimento quanto nas tradicionais. Além disso, não é necessária a aquecimento dos reagentes. As implicações desta técnica estendem-se à pesquisa de muitos vírus líticos diferentes, pois o uso de uma camada líquida em formato de placa de 96 poços permite o rápido triagem de compostos terapêuticos inovadores, o que pode reduzir significativamente as longas horas passadas no laboratório realizando ensaios tradicionais de placas.No dia anterior ao ensaio, plaque as células apropriadas para o vírus em questão, a fim de obter uma confluência de 90 a 100% no dia da infecção. As soluções estoque também podem ser preparadas no dia anterior ao ensaio. Primeiro, prepare uma solução fixadora contendo 10% de formaldeído em água destilada, misturando 5,56 mililitros de formaldeído estoque a 36% com 14,44 mililitros de água destilada. Em seguida, prepare a coloração com violeta cristal, consistindo de 1% de violeta cristal em etanol a 20%, diluído com água destilada. Depois, trabalhando em condições estéreis, prepare o meio de placa apropriado 2x para o tipo de células que está sendo utilizado. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 mícron, caso algum dos reagentes não seja estéril. Para preparar uma cobertura líquida para uso no ensaio de placa, adicione 2,4 gramas de Avicel a um frasco contendo 97,6 mililitros de água destilada que esteja sendo rapidamente misturada com um bastão de agitação. Misture a solução à temperatura ambiente até que fique muito viscosa para o bastão de agitação. Nesse momento, transfira o frasco para um agitador e agite vigorosamente por 30 minutos para garantir uma homogeneização uniforme. Por fim, autoclave a solução a 121 graus Celsius e 14 PSI por 30 minutos.E quando o programa terminar, armazene fechado à temperatura ambiente. Para uma sobreposição de agarose, prepare uma solução estoque de agarose a 0,6% em água destilada, misture com um bastão de agitação e autoclave para dissolver. Para uma sobreposição de carboximetilcelulose, prepare uma solução de carboximetilcelulose a 2% em água destilada e misture. Em seguida, autoclave como anteriormente.No dia seguinte ao plaqueamento, utilize um microscópio invertido para verificar a confluência e a viabilidade das células antes de iniciar o ensaio. Certifique-se de que as células apresentem morfologia celular padrão e aproximadamente 90% de confluência.Realize uma diluição seriada decimal das amostras infecciosas em meio de crescimento celular, variando o número de diluições necessárias com base no título esperado do vírus em questão. Além disso, prepare uma amostra controle não infectada para garantir independentemente a viabilidade celular e auxiliar na identificação das placas. Pipete o controle não infectado e as diluições seriadas nos poços da placa, tomando cuidado para não perturbar a monocamada.Utilize um volume suficiente de inóculo para cobrir as células, mantendo o volume o mais baixo possível para maximizar o contato viral com a monocamada. Coloque as placas no incubador de cultura de tecidos e infecte as células por 45 minutos a uma hora. A cada 20 minutos, agite suavemente as placas para garantir uma cobertura uniforme e evitar que a monocamada celular seque. Durante a infecção, prepare a solução de trabalho para coberturas líquidas. Misture meio para placas aquecido e Stock Avicel a 1,2 a 2,4% em temperatura ambiente em uma proporção de um para um, obtendo uma solução de trabalho com meio de cobertura contendo 0,6 a 1,2% de Avicel. Para coberturas de agarose ou CMC, misture meio para placas aquecido e uma solução estoque de agarose 0,6% aquecida ou CMC 2% em uma proporção de um para um. Em seguida, coloque em banho-maria a 56 graus Celsius por 30 minutos para equilíbrio térmico. Certifique-se de que a solução esteja morna, mas não quente ao toque, para evitar a morte celular e redução nos títulos virais. Após a infecção, aplique as coberturas sobre as monocamadas infectadas. Após a adição da cobertura, incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a 14 dias, dependendo do vírus analisado. Para fixar as células com uma sobreposição líquida, despeje ou aspire a sobreposição de Avicel, em seguida pipete a solução de formaldeído a 10% nas cavidades e fixe à temperatura ambiente por 30 minutos a durante a noite. Para agarose ou CMC, adicione diretamente a solução de formaldeído à sobreposição por uma hora a durante a noite à temperatura ambiente. Após a fixação, descarte o formaldeído e, em seguida, remova manualmente os tampões semissólidos da agarose com a espátula.Lave as placas celulares de Avicel com água para remover o fixador residual da sobreposição antes da coloração.Para corar, cubra as células com uma quantidade mínima de solução de violeta cristal por aproximadamente 15 minutos. Agite suavemente as placas, se necessário, para garantir uma cobertura uniforme. Lave cuidadosamente o corante violeta cristal com água. Uma vez fixadas, coradas e secas, armazene as placas indefinidamente para análises futuras. Conte as placas em cada poço, desconsiderando poços com menos de cinco ou mais de 100 placas. Calcule a média de quaisquer réplicas técnicas da mesma diluição. Observe o tamanho e a morfologia das placas. Determine o título viral da amostra original tomando o número médio de placas para uma diluição e o inverso do fator total de diluição.Esta imagem mostra comparações de sobreposição de placas do vírus da febre do Rift Valley utilizando placas de 12 poços. Células Veros foram semeadas a 2,5 vezes 10 à quinta células em placas de 12 poços e infectadas com 200 microlitros usando a mesma amostra inicial diluída em série do MP 12. Após a infecção, foram aplicadas sobreposições de 1,5 mililitro contendo agarose 0,3%, Avicel 0,6% ou CMC 1% para comparação direta das sobreposições. Este histograma mostra os resultados das contagens de placas e titulações para as três sobreposições. Aqui são apresentadas comparações de sobreposição de placas do VEEV utilizando placas de 12 poços. As células Veros foram semeadas como anteriormente e infectadas com um volume de 200 microlitros usando a mesma amostra inicial diluída em série da cepa vacinal VEEV-TC 83; após a infecção, foram aplicadas sobreposições de 1,5 mililitro de agarose 0,3%, Avicel 0,6% celular ou CMC 1%, como antes.Novamente, o histograma mostra os resultados das contagens de placas e titulações para as três coberturas. Esta imagem mostra um exemplo de coberturas de placas de alto rendimento. Uma placa de 96 poços com células Veros semeadas a três vezes 10 à quarta células por poço foi infectada com 50 microlitros de inóculo utilizando a mesma amostra inicial diluída em série do vírus da febre do Vale do Rift MP 12, durante uma hora em quadruplicata. Para as coberturas, foram testadas concentrações finais de 0,6 e 1,2% de Avicel cell para determinar a viabilidade e reprodutibilidade do uso de coberturas líquidas de maneira de alto rendimento. Este histograma mostra as titulações determinadas a partir de cada cobertura. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que cada vírus é diferente e podem ser necessárias otimizações, incluindo o uso de diferentes tipos celulares, tempos de incubação e/ou meios de crescimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de placa básico utilizando camadas líquidas e semissólidas.

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Quando se trabalha com meios de comunicação e dos reagentes utilizados para os microorganismos de cultura, uma técnica asséptica deve ser praticado para assegurar a contaminação é minimizado. Uma variedade de métodos de revestimento são rotineiramente utilizados para isolar, propagar ou bactérias enumerar e de fagos, os quais incorporam os procedimentos que mantêm a esterilidade de materiais experimentais.

Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Este vídeo descreve o ensaio de placa viral do vírus herpes simplex infeccioso ou HSV. As partículas virais diluídas são inoculadas na monocamada das células epiteliais. Após a incubação, o vírus forma placas e é contado visualmente para determinar o título do vírus infeccioso.

Ensaio de placa viral: uma técnica para medir o vírus herpes simplex infeccioso por meio da quantificação de placas formadas em monocamada de células infectadas por vírus

Este vídeo demonstra o método para realizar um ensaio de placa usando um vírus obtido da córnea suína infectada. A córnea suína é usada para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.

Determinando a eficácia antiviral de drogas experimentais por meio de um ensaio de placa

Este artigo apresenta um método baseado na expressão de luciferase de alto rendimento para titular vários vírus de RNA e DNA usando manipuladores de líquidos automatizados e manuais.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

Plaquing é um método de rotina usado para quantificar vírus vivos em uma população. Embora o plaquing seja frequentemente ensinado em vários currículos de microbiologia com bactérias e bacteriófagos, o plaquamento de vírus mamíferos é mais complexo e demorado. Este protocolo descreve os procedimentos que funcionam de forma confiável para o trabalho regular com vírus herpes simplex.

Plaquing de Vírus Herpes Simplex

O presente protocolo descreve a propagação do vírus Zika (ZIKV) em células Vero African green monkey kidney e a quantificação do ZIKV usando métodos de imunodetecção colorimétrica baseados em células nos formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento).

Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células

Aprenda a determinar concentração viral usando ensaios de placa com sobreposição líquida de celulose microcristalina. Este método simplifica a aplicação e remoção, facilitando a triagem de compostos terapêuticos.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Explorar mais vídeos