Name: EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprenda a coletar amostras de enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando o método EPA 1615 com filtro eletropositivo. Este procedimento padronizado garante resultados precisos para monitoramento de vírus.

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Os autores agradecem numeroso pessoal EPA cujas contribuições fez o acompanhamento realizado durante o ICR e UCMR3 possível, os seguintes investigadores principais de outros estudos da EPA relatados: Daniel Dahling, Alfred Dufour, Andrey Egorov, Susan Glassmeyer, Asja Korajkic, Richard Lieberman, Robert Safferman, e Tim Wade; e Shannon Griffin e Michael Ware para rever criticamente este manuscrito. Os autores agradecem os trabalhos de água Indian Hill para o uso de uma de suas casas de bombas para demonstrar coleta de amostras. Embora este trabalho foi avaliada pelo USEPA e aprovado para publicação, pode não refletem necessariamente a política oficial Agência. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação de uso.

1. Procedimentos Preliminares <ol><li> Montar um aparelho de filtro padrão como mostrado na Figura 1 consiste de um módulo de admissão, um módulo de alojamento do cartucho, e um módulo de descarga, como descrito em Materiais Complementares. </li><li> Calibre o fluxo de metro / totalizador nas taxas de fluxo usados ​​para a amostragem antes do primeiro uso. Verifique a calibragem após a primeira utilização e, em seguida, após um mês de uso. Se a calibragem da vazão mudou após uma primeira utilização ou após o primeiro mês de uso, determinar a frequência dos controlos de calibração conforme descrito em Materiais Complementares. <ol><li> Conecte-se um módulo de descarga a um módulo de entrada e então conectar o módulo de alimentação a uma torneira. Defina o fluxo de metro / totalizador de ler a taxa de fluxo. Abra a torneira completamente e, em seguida, ajuste a vazão de 10 L / min, utilizando a válvula globo de bronze. Uma vez que a taxa de fluxo é estável a 10 L / min, redefinir o fluxo de metro / totalizador de ler volume total. </li><li> Coloque o foradeixe de o módulo de descarga para um 4 L ou maior cilindro graduado e redefinir simultaneamente o totalizador para zero. Medir a leitura totalizador na marca de 4-G e o tempo necessário para atingir a marca 4 L no cilindro. Alterar o fluxo metro / totalizador configuração de volta à taxa de fluxo. NOTA: Se a vazão caiu para abaixo de 9,95 L ou aumentou para mais de 10,05 L Após concluir o passo 1.2.2, espere até que a taxa de fluxo é estável e repita o Passo 1.2.2. Um medidor corretamente calibrados atingirá a marca de 4 L na proveta graduada com 24 ± 1 seg com uma leitura do totalizador de 4,0 ± 0,04 L. </li><li> Se a leitura do totalizador é menos do que 3,96 ou maior do que 4,04 L, calcular um factor de correcção necessárias para ajustar a diferença observada. Por exemplo, se o fluxo de medidor / totalizador lê 3,9 L na marca de 4 L no cilindro graduado, o factor de correcção seria 1.026 (4 ÷ 3,9). Assim, se o volume desejado de uma amostra de campo foram de 300 L, o volume recolhido de acordo com a reading no fluxo de metro / totalizador deve ser de 300 ÷ 1.026 = 292,4 L. </li></ol></li><li> Esterilizar o aparelho de filtro padrão e prepará-lo para a coleta de amostra. <ol><li> Esterilizar os módulos de entrada e de cartuchos de habitação com hipoclorito de sódio a 0,525% durante pelo menos 30 min antes de cada uso, por imersão ou completamente os módulos nas soluções ou pela circulação de hipoclorito de sódio, embora os módulos, usando uma bomba. Lavar os módulos com dH 2 O estéril e então dechlorinate em uma solução contendo 50 ml de 1 M de tiossulfato de sódio por litro de água estéril, de grau reagente durante 5 min. Cubra o módulo de aparelho de amostragem filtro termina com papel de alumínio esterilizado. </li><li> Adicionar um cartucho de filtro para o electropositiva assepticamente módulo de alojamento de cartucho. NOTA: Tenha cuidado para garantir que filtro de cartucho está encaixado corretamente nas caixas. Devidamente filtros assentados não vai vazar e o filtro não irá se mover dentro do alojamento quando abalada. As juntas em aproperly filtro assentado terá recortes visíveis mostrando onde os contatos filtrá-los. As juntas de vedação devem ser sempre verificado para entalhes imediatamente a jusante do filtro é removida da carcaça. </li><li> Gravar um número da amostra original em uma folha de amostra de dados (ver Materiais Complementares, por exemplo) e, em seguida, levar ou enviar o aparelho de amostragem filtro e a Folha de dados de exemplo para a pessoa que irá receber a amostra de campo, junto com as instruções necessárias sobre amostra coleção (por exemplo, o volume de amostra, local de amostragem, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Preparação para coleta de amostras no local de amostragem <ol><li> Lavar as mãos após a chegada ao local de coleta e don luvas cirúrgicas para minimizar a possibilidade de contaminação da amostra. Não coletar amostras Em caso de sintomas intestinais ou respiratórias. Mudar de luvas com freqüência, e, especialmente, depois de tocar as torneiras de água e outros itens que podem ser contaminado. </li><li> Rastreamento de informações em uma folha de dados de exemplo registro de amostra relevante. As informações relevantes incluem local e identificação da amostra, o nome de sampler, e modelos de equipamentos e números de série. </li><li> Abra a torneira de água para 2-3 min para limpar todos os detritos que se estabeleceu na linha. Se necessário, use uma mangueira de jardim ou tubulação para chegar a um dreno durante esta etapa. </li><li> Se os módulos estão ligados um aparelho de amostragem, desligá-los e proteger as extremidades abertas do módulo da caixa do cartucho com a folha estéril. Conecte o módulo de descarga para o módulo de entrada e então ligar tanto para a torneira da água. Conectar uma mangueira de jardim na extremidade do módulo de descarga e colocar a extremidade livre no recipiente de polipropileno de 1 L. </li><li> Abrir a torneira e passar pelo menos 75 L de água a ser amostrados através do aparelho. <ol><li> Meça e registre os parâmetros de qualidade da água durante o período de descarga da água que flui para o polipropileno recipiente de cloro residual, pH, temperatura, e turbidez. </li><li> Depois de desligar a água da torneira, desligar o módulo de descarga a partir do módulo de admissão e, em seguida, ligar o módulo de alojamento de cartucho para a saída do módulo de admissão e do módulo de descarga para a saída do módulo de alojamento de cartucho. Repor o totalizador a leitura para zero. </li></ol></li></ol> Coleta de Amostra 3. Campo <ol><li> Registre a leitura do totalizador inicial, juntamente com a data e hora e, em seguida, abrir lentamente a torneira da água. <ol><li> Certifique-se de que o alojamento do cartucho está em posição vertical e que se enche completamente com água. Algumas carcaças têm um botão de ventilação que pode ser pressionado para expelir o ar a partir do invólucro durante o processo de enchimento. </li><li> Abra a torneira completamente. Ajustar o fluxo de 10 L / min, utilizando a válvula globo de bronze e, em seguida, registrar a vazão inicial. </li></ol></li><li> Passar 300 L de água de superfície ou 1.500 a 1.800 L de água subterrânea através do aparelho usandoas leituras do totalizador (ajustados, se necessário). Se os tamancos de filtro antes de o volume necessário seja alcançado e mais de metade do volume tiver sido coletado, use um segundo módulo de caixa do filtro para recolher a amostra restante, se estiver disponível. </li><li> Observar o caudal como o volume da amostra se aproxima do fim do período de amostragem e, em seguida, desactivar o fluxo de água da torneira na amostra. Grave a taxa final de fluxo, data, hora do dia, a leitura final do totalizador, e o volume total da amostra. </li><li> Desligue o aparelho de amostragem filtro da torneira. Desligue o módulo habitacional cartucho dos outros módulos. <ol><li> Girar a caixa (s) de filtro de cabeça para baixo e permitir que o excesso de água se escoe para fora até não haver mais água for drenada ambas as portas de entrada e de saída. </li><li> Vire a habitação vertical e cobrir os conexões rápidas em cada extremidade com papel de alumínio esterilizado. Coloque a caixa em um ou mais sacos de plástico lacrado. </li><li> Escorra a água a partir da ingestão e dmódulos ischarge. Coloque os módulos em um ou mais sacos de plástico lacrado. </li></ol></li></ol> 4. O transporte de amostras de campo <ol><li> Coloque os módulos de aparelhos de amostragem filtro em um resfriador de armazenamento e transporte isolada. </li><li> Adicionar compressas de gelo congelados ou cubos de gelo double-ensacado para o armazenamento e transporte de mais frio para assegurar que a amostra permanece entre 1-10 ° C durante o transporte. Dois grandes ou 6-8 blocos de gelo pequenos deve ser suficiente. </li><li> Coloque um dispositivo registador da temperatura no armazenamento isolado e peito de transporte em um local sem contacto com compressas de gelo ou sacos de gelo. NOTA: O dispositivo de temperatura de gravação é opcional, se o laboratório de análises estará usando um termômetro infravermelho visual para medir a temperatura da caixa do cartucho imediatamente após a chegada e a abertura do recipiente. </li><li> Preencha qualquer espaço vazio com material de embalagem e coloque a folha de amostra de dados, protegido em um saco plástico lacrado, em top. Feche o armazenamento isolado e peito de transporte e fita-lo para impedir qualquer fuga de água. </li><li> Transporte ou enviar a amostra para o laboratório de análises. Certifique-se de que a amostra chega ao laboratório de análises, o mais tardar 24 horas após o início da coleta de amostra de campo (ou seja, o tempo registrado no passo 3.1). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Diferentes tipos de filtros para a concentração de vírus de águas ambientais têm sido utilizados ao longo dos anos 26. Os métodos atuais empregam ultrafiltros 27, filtros electronegativos 13,28,29, filtros de lã de vidro, 23 e filtros electropositivos 30. Eletronegativos filtros foram amplamente utilizados durante muitos anos, mas um requisito para a adição de sal e o ajuste do pH da água no campo antes ou durante a amostragem limita a sua utilidade 13. A escolha do filtro mais prático para a amostragem de campo é filtros electropositivos. Estes filtros permitem a recolha de amostras de grandes volumes de água a taxas de fluxo elevadas e sem qualquer condicionamento da água. Filtros de lã de vidro são a opção mais barata, mas tem taxas de fluxo mais lento do que filtros electropositivos e não estão disponíveis comercialmente. Ultrafiltros fornecer os mais altos recuperações de vírus mais de uma grande variedade de qualidade da água, mas o equipamento necessário para sampling não é facilmente campo portátil e o tempo necessário para coletar amostras é muito mais longo 27. Os métodos foram desenvolvidos recentemente que o uso de filtros pré-condicionados eletronegativos para evitar a necessidade de ajustes no campo, mas estes não podem ser aplicáveis ​​para recolher grandes volumes de amostra 28,29. EPA Método 1615 usa filtros de cartucho electropositivos que obtêm sua carga positiva a partir de qualquer nanofibras de óxido de alumínio ou aminas quaternário. As vantagens da primeira sobre a segunda é que é menos dispendiosa e recolhe eficientemente o vírus a partir de águas mais de uma ampla gama de valores do pH natural 30,31; no entanto, cada cartucho, bem como os filtros de lã de vidro utilizados por Borchardt e colegas dão recuperações semelhantes de enterovírus e norovírus de água (23,31,32 Cashdollar, dados não publicados). Filtros de cartucho são colocados em um aparelho de amostragem simples, que é projetado para simplificar a coleta de amostrase reduzir a contaminação durante a amostragem. Métodos padrão são de valor inestimável quando grandes que sejam realizados com vários laboratórios analíticos. Método EPA 1615 apresenta os procedimentos e orientações para minimizar os dois principais problemas de coleta de amostras que podem afetar os dados recolhidos durante esses padrão estudos de resultados positivos falsos decorrentes de contaminação durante a coleta de amostra ou de componentes do aparelho inadequadamente desinfetados, e o entupimento dos poros do filtro por componentes em sendo a água amostrada. Assim como os vírus entéricos pode ser transmitida de pessoa para pessoa, devido à falta de higiene, os vírus podem ser introduzidas em amostras de mãos ou mãos mal lavados com luvas contaminadas 33. É essencial que amostradores compreender os potenciais vias de contaminação e utilizar uma técnica asséptica durante a amostragem. Amostradores deve entender que as luvas são utilizadas principalmente para proteger o amostrador da exposição e não a protect o aparelho de contaminação. As mãos devem ser lavadas antes do início da colheita e cuidados devem ser tomados durante a colocação de luvas para evitar a mão à luva contaminação. Samplers com gastroenterite ou sintomas respiratórios não devem coletar amostras, já que poderiam ser derramamento enterovírus ou norovírus em níveis elevados. Em segundo lugar, deve-se tomar cuidado para evitar a passagem do vírus a partir de amostragens anteriores. Para minimizar esta fonte potencial de contaminação, o aparelho de amostragem no Método 1615 foi modificado a partir do que o ICR, não incluindo um regulador de pressão e medidor de pressão entre a entrada e o módulo da caixa do cartucho. Esses componentes foram removidos porque as pressões observadas durante os eventos de amostragem foram sempre abaixo da classificação máxima de habitação (por exemplo, 125 psi para caixas de cartuchos de 5 polegadas) e porque eles eram difíceis de desinfetar. O último problema foi demonstrada através da utilização de equipamentos de controles em branco em rudies subseqüente ao ICR 6,20. O grau em que isso afetou os dados ICR é desconhecido, mas era provável pequeno; havia apenas duas amostras de avaliação de desempenho negativos falsos positivos durante o estudo (dados não mostrados). Para reduzir ainda mais a possibilidade de contaminações, também recomenda-se que o módulo de tubulação de entrada de ser substituído após cada evento de amostragem. É especialmente importante para garantir a desinfecção adequada, se o aparelho foi utilizado para uma qualidade de desempenho ou de controle que foi semeada com vírus. Antes de realizar a desinfecção, a concentração de cloro livre deve ser medido para qualquer perda durante o armazenamento. Para além das mudanças na configuração do aparelho descrito acima, é essencial que os esboços equipamento normal ser executado para demonstrar que a desinfecção é eficaz. Método de 1615 determina que os espaços em branco do equipamento ser realizadas utilizando aparelhos que tenham sido desinfectados após ser usado para controles de vírus-semeado, simplificando assimo procedimento, eliminando a necessidade de passar uma solução de vírus semeados através do aparelho antes da desinfecção. A concentração de desinfectante foi aumentada para 0,525% de hipoclorito para o Método 1615, como esta concentração é necessário tanto para inactivar quaisquer vírus viáveis ​​no equipamento e para degradar ácidos nucleicos. Portanto, blanks de aparelhos devem ser analisados ​​usando tanto a cultura celular e ensaios de qPCR. Ambos os tipos de filtros electropositivos estavam sujeitos a entupimento durante os estudos apresentados na Tabela 1. Um número desconhecido de amostras com volumes reduzidos pode ter sido devido a erros de amostragem, como uma leitura errada do totalizador ou uma parada precoce intencional de amostragem ao encontro de outro prazo, especialmente para águas com leituras de turbidez menos de 20 NTU. O grau de obstrução é dependente tanto sobre os parâmetros do tipo de filtro e de qualidade da água. Prefilters fornecer alguma medida de melhoria, mas se usados, devem ser processadas e analisadasseparadamente do filtro electropositivo. A recomendação atual para o UCMR3 é que a amostra ser recolhida sem prefilters usando filtros à base de nanofibras de óxido de alumínio dois se pelo menos metade do volume podem ser obtidas por meio do primeiro filtro.

Vírus entéricos humanos replicar dentro do trato gastrointestinal e estão espalhados pela via fecal-oral. Estes vírus são freqüentemente encontrados em esgotos em altas concentrações 1-3. Eles podem persistir em efluentes de esgotos de 4,5, e em 6,7 superfície, solo 8-10, e tratou de beber 11 águas. Quando presente, a concentração de vírus no meio ambiente em águas tipicamente os EUA é demasiado baixo para a medição directa 12,13. Isto requer que os vírus ser concentrado a partir de grandes volumes de água. Durante a Recolha de Informação Rule (ICR) monitorização efectuada pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) 14, as concentrações de vírus de amostras positivas na água fonte de grandes empresas de serviços em todo o país variaram ,009-19,7 número mais provável de unidades infecciosas (NMP) / L. Concentrações medianas e médias de amostras positivas foram de 0,03 e 0,17 NMP / l para as águas de origem de ribeiros, 0,01a 0,07 NMP / L para aqueles de lagos e reservatórios, e 0,04-0,74 MPN / L para aqueles que utilizam as águas subterrâneas 11 (dados do banco de dados ICR Aux1 acesso 18 meses datado 2000/04/25). Concentrações do vírus de amostras positivas de um estudo USEPA das águas subterrâneas nacionais variou ,009-2,12 unidades infecciosas / L, com mediana e concentrações médias de 0,13 e 0,29 unidades infecciosas / L 8. A concentração de vírus em amostras de água subterrânea positivos foi maior do que aqueles em ribeiros. A maioria das instalações que utilizam águas subterrâneas nestes estudos obtidos água dos aqüíferos localizados em regiões cársticas. Estes, juntamente com aqueles localizados em calcário e cristalina configurações (formações rochosas fraturou) são propensos a ter concentrações de vírus mais elevados do que em outras configurações 8,15,16. Métodos de vírus USEPA especificar volumes de amostragem de 200 L (ICR) para 300 L (Método 1615) das águas superficiais e 1.000 L (ICR) para 1.500 L (Método 1615) das águas subterrâneas 17,18. No entanto, mesmo com o uso degrandes volumes de amostras, a maioria das amostras superficiais e subterrâneos são negativos para o vírus 8,11,19,20. Os vírus presentes nas águas de superfície representam um risco potencial para a saúde para os consumidores de água potável. O Surface Water Treatment regra exige que todas as estações de tratamento de água de superfície, utilizando para reduzir as concentrações de vírus por pelo menos 4-log. Mesmo com uma redução de 4-log, as concentrações de vírus infecciosos em água de fonte tão pequena quanto 0,0044 MPN / L pode levar a uma infecção por dia assumindo tais condições médias de exposição e de tratamento e os parâmetros de resposta de dose para o rotavírus 11,21. O risco de vírus não tratados em águas subterrâneas pode ser ainda maior, devido à falta de tratamento e ocorrência viral. Borchardt e colegas estimam que até 22% de gastroenterite aguda em adultos e 63% em crianças com menos de cinco anos poderia ser devido ao vírus na água potável em comunidades usando as águas subterrâneas não tratadas 19. USEPA Método 1615 foi desenvolvido para detectar enterovírus e norovírus durante o ciclo terceiro monitoramento do Regulamento de Acompanhamento Regulamentada Contaminantes (UCMR3) 22 como um nacional seguimento às conclusões da Borchardt e colegas 19,23. O método USEPA foi projetado principalmente para medir vírus em sistemas que utilizam as águas subterrâneas não tratadas, mas foi escrita de forma mais geral para incluir outros tipos de matriz de água. O novo método é um híbrido preservar muitos componentes do método anterior vírus utilizado durante o ICR 17, a adição de procedimentos moleculares com base no método de Borchardt et al. 19,23, e conjuntos de iniciadores adicionais para norovírus 24. O objetivo deste artigo é descrever o processo de amostragem e os passos necessários para manter a integridade da amostra durante a coleta e envio. Uma avaliação do método geral descrito no Cashdollar et ai. 25. Este protocolo abrange simples collectio campon de águas de superfície e subterrâneas, onde uma bomba de pré-filtro e não são necessárias e que não são necessários ajustamentos para o pH ou a presença de um desinfectante na água a ser amostrado. Os requisitos de amostragem mais complexos são descritos em Fout et al. 17,18.

<table><tbody><tr><td>Garrafa de polipropileno de 1 L</td><td>Nalgene</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>Quadrados de folha de alumínio</td><td>Cole-Parmer</td><td>06275-40</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Plástico bolha</td><td>U.S. Plastics</td><td>50776</td><td></td></tr><tr><td>Saco que pode ser fechado</td><td>Uline</td><td>S-12283</td><td></td></tr><tr><td>Saco que pode ser fechado</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S31798C</tr><tr><td>Pacotes de gelo comerciais</td><td>Cole-Parmer</td><td>06345-20</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de segurança fria</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado</td><td>Cole-Parmer</td><td>06135-90</td><td>4-L ou maior</td></tr><tr><td>Hype Wipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-412-56</td><td></td></tr><tr><td>Registrador de dados de temperatura</td><td>iButtons Maxim</td><td>DS1921G</td><td></td></tr><tr><td>Baú de armazenamento e transporte isolado</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-12</td><td></td></tr><tr><td>Fita de embalagem</td><td>U.S. Plastics</td><td>50083</td><td></td></tr><tr><td>Kit de teste de colorímetro de cloro portátil</td><td>II Hach</td><td>5870062</td><td></td></tr><tr><td>Sonda portátil de pH e temperatura</td><td>Omega</td><td>PHH-830</td><td></td></tr><tr><td>Portátil medidor de turbidez</td><td>Omega</td><td>TRB-2020-E</td><td></td></tr><tr><td>Fita de rosca PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>08270-34</td><td>Use em todas as conexões roscadas</td></tr><tr><td>Bomba, acionamento magnético centrífugo</td><td>Cole-Parmer</td><td>72010-20</td><td></td></tr><tr><td>Bico de redução</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-87</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio (NaClO)</td><td></td><td></td><td>Use alvejante doméstico disponível localmente</td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio (Na2S2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217247</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Marcador à prova d'água</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-290546</td><td></td></tr><tr><td>Composição</td><td></td><td></td><td>do meio</td></tr><tr><td>0,525% de hipoclorito de sódio (NaClO)</td><td>Prepare uma solução de NaClO a 0,525% diluindo alvejante doméstico 1:10 em dH2O.&nbsp; Armazene soluções de NaClO a 0,525% por até 1 semana em temperatura ambiente.</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1 M de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) pentahidratado</td><td>Preparar uma solução 1 M dissolvendo 248,2 g de Na2S2O3 em 1 L de dH2O.&nbsp; Armazene o tiossulfato de sódio por até 6 meses em temperatura ambiente.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

epa método 1615. medição de enterovirus e norovirus ocorrência na água pela cultura e rt-qpcr. i. recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

O método EPA 1615 foi desenvolvido com o objetivo de fornecer um método padrão para medir enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. O componente de amostragem padronizado do método concentra os vírus que podem estar presentes na água pela passagem de um volume mínimo especificado de água através de um filtro de cartucho eletropositivo. Os volumes mínimos especificados para águas superficiais e acabadas/subterrâneas são de 300 L e 1.500 L, respectivamente. Uma das principais limitações do método é a tendência de os filtros entupirem antes de atender ao requisito de volume de amostra. Estudos usando duas opções de filtro de cartucho diferentes, mas equivalentes, mostraram que o entupimento do filtro era um problema com 10% das amostras com um dos tipos de filtro em comparação com 6% com o outro tipo de filtro. O entupimento tende a aumentar com a turbidez, mas não pode ser previsto com base apenas nas medições de turbidez. Do ponto de vista do custo, uma das opções de filtro é preferível à outra, mas a qualidade da água e a experiência com o sistema de água a ser amostrado devem ser levadas em consideração ao fazer as seleções de filtro.

Filtrar o entupimento é um grande problema potencial que pode ser encontrada com o Método 1615. O entupimento diminui a taxa de fluxo de água através do filtro. Em alguns casos isto pode ser superado através da abertura da válvula de globo para permitir um maior fluxo. Em outros casos, o filtro irá ficar completamente obstruído antes o volume requerido tenha passado através dele. A Tabela 1 mostra a percentagem de amostras com volumes reduzidos, em função do tipo de filtro, tipo de água, e a turbidez. Entupimento ocorreu com amostras tanto águas subterrâneas e superficiais, com o filtro com base em nanofibras de óxido de alumínio superando o filtro à base de amina quaternária para amostras de água subterrânea, enquanto o inverso foi o caso de amostras de água de superfície. No geral, 6% das amostras coletadas usando o filtro com base em amina quaternária eram deficientes em volume, enquanto 10% das amostras coletadas com os filtros à base de nanofibras de óxido de alumínio não conseguiu cumprir o volume mínimo especificado necessário devido ao entupimento. Em gênerosl, entupindo aumentou com a turbidez, mas um número de componentes diferentes contribuir para turbidez e alguns deles não levam ao entupimento. Por exemplo, 43% de todos os eventos que ocorrem durante o entupimento estudo ICR foram confinados a dois sistemas de rio (dados não mostrados). Durante o ICR o volume meta mínima para as águas de superfície era de 200 L. O volume médio coletado durante o estudo foi de 217 ± 32 L, com um volume médio de 208 L (dados do banco de dados de acesso ICR Aux1 18 meses datado de 2000/04/25) . Assim, o volume total pode ser coletado de muitas águas, mesmo com altas turbidez. O ICR necessário samplers de usar um pré-filtro quando turbidez foram mais de 75 NTU, mas mesmo com um pré-filtro, 34% das amostras coletadas em águas com turbidez mais de 75 NTU entupido. Método 1615 recomenda a utilização de um pré-filtro com mais de 50 NTU águas; No entanto, desde a publicação do Método 1615, várias opções de pré-filtro diferentes, além das que constam do método ter sidotestado. Nenhum destes resultou numa melhoria significativa no volume da amostra (dados não mostrados). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52067/52067fig1.jpg"> Figura 1. Os aparelhos Filtro padrão. O aparelho de filtro padrão consiste de módulos de descarga (ver Materiais Complementares para uma descrição de cada módulo) ingestão, carcaça do filtro, e. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52067/52067fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Total de amostras a </td><td> Número de deficientes Amostras b </td><td> A percentagem de amostras deficientes </td><td> Turbidez (NTU) </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> As águas subterrâneas utilizando NanoCeram Filtros c </td></tr><tr><td> 113 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> Superfície de água usando filtros NanoCeram c </td></tr><tr><td> 83 </td><td> 12 </td><td> 14 </td><td> &lt;20 d </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 20 - &lt;50 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 83 </td><td> ≥ 50 d </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="230px" style="text-align:center"> Total de NanoCeram c </td></tr><tr><td> 210 </td><td> 22 </td><td> 10 </td><td> ≥ 0 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> As águas subterrâneas utilizando 1MDS Filtros c </td></tr><tr><td> 374 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr>ext-align: center "&gt; Superfície de água usando 1MDS Filtros c </tr><tr><td> 2.693 </td><td> 27 </td><td> 1 e </td><td> &lt;20 e </td></tr><tr><td> 505 </td><td> 36 </td><td> 7 f </td><td> 20 - &lt;50 f </td></tr><tr><td> 122 </td><td> 19 </td><td> 16 e </td><td> 50 - &lt;75 g </td></tr><tr><td> 175 </td><td> 60 </td><td> 34 e, f </td><td> ≥ 75 e, f, g </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="240px" style="text-align:center"> Total de 1MDS c </td></tr><tr><td> 3869 </td><td> 217 </td><td> 6 </td><td> ≥ 0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. capacidade do filtro de amostras são dos seguintes estudos a partir do qual os dados de volume e de turbidez estão disponíveis:. 1) estudo ICR da USEPA (dados do banco de dados de acesso 18 meses ICR Aux1 datado de 02/045/2000), 2) estudo USEPA águas subterrâneas 8, 3) e USEPA Lawrence Lowell, MA estudo (dados não publicados), 4) estudo USEPA Mississippi River (dados não publicados), 5) estudo USEPA beber estação de tratamento de água (dados não publicados), 6) Método USEPA 1615 estudo de avaliação de 25, e 7) os três primeiros meses da monitorização UCMR3 (dados não publicados). Amostras b onde o filtro entupido antes de o volume mínimo de água especificada para cada estudo foram recolhidos. Este foi de 200 L para as águas superficiais e 1.500 L para as águas subterrâneas, mas foi de 200 l para as águas de origem que eram águas subterrâneas sob a USEPA ICR e 1893 L para o estudo das águas subterrâneas USEPA. C A capacidade de coletar o mínimo integral volume especificado é significativamente diferente para Amostras coletadas usando NanoCeram e filtros 1MDS (p = 0,002) e entre as águas superficiais e subterrâneas tanto em termos globais (P &lt;0,001) e para cada tipo de filtro (P &lt;0,001), utilizando o teste de Mann-Whitney Rank Sum. d &amp; #8211; g grupos com o mesmo valor expoente são significativamente diferentes (P &lt;0,05) de acordo com o teste de Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance em teste Ranks e Pairwise Multiple procedimento de comparação de Dunn. Para todos os testes a variável dependente é o volume passado através do filtro como uma fracção do volume mínimo especificado, mas com um valor máximo de 1,0.

O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma abordagem padronizada para amostragem de águas ambientais e potáveis para ocorrência de vírus entéricos com base no método EPA 1615. Isso é feito primeiro montando um aparelho de amostragem, esterilizando os módulos de entrada e invólucro do cartucho do aparelho e, em seguida, adicionando assepticamente um filtro de cartucho eletropositivo estéril. Em seguida, um volume definido de água é passado através de um filtro eletropositivo contido no aparelho de amostragem.Em seguida, o excesso de água é drenado do aparelho e da carcaça do filtro do cartucho, e o volume amostrado é registrado em uma folha de dados de amostra. Finalmente, os componentes do aparelho de amostragem são embalados em um contêiner mais frio mantido de um a 10 graus Celsius e entregues a um laboratório analítico. Em última análise, enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis são medidos usando este procedimento de amostragem como parte de um método geral.Este procedimento usa filtro eletropositivo para concentrar vírus, algumas águas potáveis ambientais. Existem vários outros tipos de filtro que podem ser usados para fazer este procedimento. Um é o ultrafiltro e outro é um filtro carregado negativamente.A vantagem do filtro eletro Posy sobre o ultrafiltro é que a amostragem é cerca de duas vezes e meia mais rápida. A coleta de vírus usando filtros carregados negativamente requer ajuste de pH na adição de sais. A vantagem de carregar positivamente os filtros é que nenhum ajuste é necessário antes da coleta da amostra.Geralmente, os indivíduos novos neste procedimento terão dificuldade em manter a esterilidade e com condições inesperadas, como a ausência de uma torneira conveniente para a coleta de amostras. Demonstrando o procedimento hoje serei eu, sha out, Jennifer Cash dollar e Eunice VER gansos. Somos todos membros profissionais da equipe do Laboratório Nacional de Pesquisa de Exposição da EPA em Cincinnati, Ohio.Para se preparar para a coleta de amostras, monte um aparelho de filtro padrão, conforme mostrado aqui, consistindo em um módulo de entrada, um módulo de invólucro de cartucho e um módulo de descarga, conforme descrito nos materiais suplementares do protocolo de texto. Usando as taxas de fluxo para amostragem. Calibre o totalizador do medidor de vazão antes do primeiro uso, conectando um módulo de descarga a um módulo de entrada e, em seguida, conectando o módulo de entrada a uma torneira.Abra a torneira completamente e use a válvula globo de bronze para ajustar a vazão para 10 litros por minuto. Quando a vazão estiver estável em 10 litros por minuto, reinicie o totalizador do medidor de vazão para ler o volume total. Em seguida, coloque a saída do módulo de descarga em um cilindro graduado de quatro litros ou maior e, simultaneamente, redefina o totalizador para zero.Meça a leitura do totalizador na marca de quatro litros e o temporizador necessário para atingir a marca de quatro litros no cilindro. Se a leitura do totalizador for inferior a 3,96 ou superior a 4,04 litros, calcule um fator de correção necessário para ajustar a diferença observada. Por exemplo, se o totalizador do medidor de vazão ler 3.9 litros na marca de quatro litros no cilindro graduado, o fator de correção seria 1.026 ou quatro dividido por 3.9 Para esterilizar o aparelho de filtro padrão e prepará-lo para coleta de amostras, use hipoclorito de sódio a 0.525% para imergir completamente os módulos de admissão e carcaça do cartucho e deixe de molho por pelo menos 30 minutos.Como alternativa, use uma bomba para circular a solução pelos módulos. Use DH estéril dois O para enxaguar os módulos e, em seguida, use uma solução estéril de 50 mililitros de tiossulfato de sódio molar por litro de água reagente estéril para desclorar por cinco minutos. Em seguida, use papel alumínio estéril para cobrir o aparelho de amostragem do filtro.O módulo termina assepticamente. Adicione um filtro de cartucho eletropositivo ao módulo de alojamento do cartucho, cuidando para que ele esteja encaixado corretamente. Nos invólucros, registre um número de amostra exclusivo em uma folha de dados de amostra e, em seguida, leve ou envie o aparelho de amostragem de filtro, a folha de dados de amostra e quaisquer instruções necessárias sobre a coleta de amostra para o indivíduo que coletará a amostra de campo Na chegada ao local de coleta e após lavar as mãos, use luvas cirúrgicas para minimizar a contaminação da amostra.Troque as luvas com frequência, especialmente depois de tocar nas torneiras e outros itens que possam estar contaminados. Use uma almofada contendo hipoclorito de sódio para esterilizar a torneira do aparelho de amostragem e as roscas internas de uma mangueira de jardim. Registre informações relevantes de rastreamento de amostras em uma folha de dados de amostra, incluindo identificação do local e da amostra, nome do amostrador, modelos de equipamentos e números de série.Conecte a mangueira de jardim à torneira. Coloque a saída da mangueira em um local onde a água possa ser drenada com segurança e, em seguida, ligue a água. Toque por dois a três minutos para limpar quaisquer detritos que tenham se depositado na linha.Conecte o módulo de descarga ao módulo de entrada e, em seguida, conecte ambos à torneira da água. Conecte uma mangueira de jardim à extremidade do módulo de descarga e coloque a extremidade livre no recipiente de propileno de um litro. Em seguida, abra a torneira e passe pelo menos 75 litros da água a ser amostrada pelo aparelho.Meça e registre os seguintes parâmetros de qualidade da água durante o período de descarga na água que flui para o recipiente de propileno, pH residual de cloro, temperatura e turbidez. Depois de desligar a água da torneira, desconecte o módulo de descarga do módulo de entrada e, em seguida, conecte o módulo de alojamento do cartucho à saída do módulo de entrada e o módulo de descarga à saída do módulo de alojamento do cartucho. Em seguida, redefina a leitura do totalizador para zero.Para iniciar a coleta de amostras de campo. Registre a leitura inicial do totalizador junto com a data e a hora e, em seguida, abra lentamente a torneira da água. Certifique-se de que o invólucro do cartucho esteja na posição vertical e que esteja completamente cheio de água.Agora, abra a torneira completamente e use a válvula globo de bronze para ajustar a vazão para 10 litros por minuto Antes de registrar a vazão inicial. Usando as leituras do totalizador, passe 300 litros de água superficial ou 1500 a 1800 litros de água subterrânea pelo aparelho. Observe a vazão à medida que o volume da amostra se aproxima do final do período de amostragem e, em seguida, desligue o fluxo de água na torneira da amostra, registre a vazão final, a data, a hora do dia, a leitura final do totalizador e o volume total da amostra.Desligue o filtro sampaparelho da torneira. Desconecte o módulo de invólucro do cartucho dos outros módulos. Vire as carcaças dos filtros de cabeça para baixo e deixe o excesso de água fluir até que não haja mais água drenada das portas de entrada e saída.Vire a caixa na vertical e use papel alumínio estéril para cobrir as conexões rápidas em cada extremidade. Coloque a caixa em um ou mais sacos plásticos lacráveis. Drene a água dos módulos de entrada e descarga.Coloque os módulos em um ou mais sacos plásticos seláveis para preparar as amostras para envio. Coloque os módulos do aparelho de amostragem do filtro em um refrigerador isolado de armazenamento e transporte. Adicione bolsas de gelo congeladas ou cubos de gelo ensacados duas vezes ao refrigerador de armazenamento e transporte para garantir que a amostra permaneça entre um a 10 graus Celsius.Durante o envio. Preencha qualquer espaço vazio com material de embalagem e, em seguida, coloque a folha de dados da amostra em um saco plástico lacrado e coloque-a em cima do material de embalagem. Feche o armazenamento isolado e transporte o transporte do baú ou envie a amostra para o laboratório analítico.Se o baú for enviado, sele-o com fita adesiva para evitar vazamentos. Certifique-se de que a amostra chegue ao laboratório analítico o mais tardar 24 horas após o início da coleta de campo. O entupimento do filtro é um grande problema potencial que pode ser encontrado com o Método 1615, pois diminui a vazão da água.Esta tabela mostra a porcentagem de amostras com volumes reduzidos em função do tipo de filtro, tipo de água e turbidez. Ao filtrar amostras de águas subterrâneas, o filtro contendo fibras nano Illumina superou um filtro à base de amina quaternária. O filtro à base de amina foi melhor para filtrar amostras de água superficial.No geral, 6% das amostras coletadas usando o filtro baseado na média quaternária eram deficientes em volume. Enquanto 10% das amostras coletadas com óxido de alumínio, os filtros à base de nanofibra não atenderam ao volume mínimo especificado exigido devido ao entupimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter condições estéreis.Este é apenas o primeiro procedimento de um método global. Após este procedimento, haverá eluição por filtro, concentração secundária e ensaios como vírus cultural total, ensaio e ensaios moleculares. Esses ensaios posteriores são necessários para realmente medir a ocorrência e a concentração do vírus.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar amostras de vírus de águas ambientais e potáveis. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos virais pode ser perigoso e você deve sempre tomar precauções como o uso de luvas ao realizar este procedimento.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Aqui apresentamos um procedimento para medir o total de vírus cultiváveis usando a linha de células renais Buffalo Green Monkey. O procedimento fornece uma ferramenta padronizada para medir a ocorrência de vírus infecciosos em águas ambientais e potáveis.

EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Uma metodologia de amostragem baseada em macroespuma foi desenvolvida e avaliada para a detecção e quantificação de norovírus em superfícies duras ambientais.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.

Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água

Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Um protocolo para a extração e pré-concentração de estradiol de amostras de água usando um sistema automatizado e miniaturizado é apresentado.

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

Descrevemos um protocolo para filtração de amostras de água com um cartucho de filtro e extração de DNA ambiental (eDNA) sem ter que abrir a caixa para remover o filtro. Este protocolo é desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável a eDNA de outros organismos.

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

O artigo descreve um método que aumenta o rendimento enquanto equilibra esforço e precisão para a extração de lipídios das membranas celulares de microorganismos para uso na caracterização de lipídios totais e abundância relativa de lípidos indicadores para determinar a estrutura da comunidade microbiana do solo em estudos com muitas amostras.

Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente é um método utilizado em estudos de saúde ocupacional para identificar riscos para a saúde. Este protocolo descreve a extração de DNA de amostras de ar ocupacional para amplificação e sequenciamento de regiões ITS fúngicas. Esta abordagem detecta muitas espécies de fungos que podem ser negligenciados pelos métodos tradicionais de avaliação.

Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

Aprenda a coletar amostras de enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando o método EPA 1615 com filtro eletropositivo. Este procedimento padronizado garante resultados precisos para monitoramento de vírus.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

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