Name: Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias funcionais de células cultivadas e tecido de camundongo usando centrifugação diferencial. Este método permite avaliar o potencial de membrana mitocondrial com o corante TMRE para estudar a saúde celular.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pela concessão NSF CHE-1229562 (VDGM), o Escritório de Pesquisa de Graduação da Elon University, o Departamento de Química Elon e o Prêmio Elon Lumen (TL e TAD), o Elon College Fellows Program (JAC) e o Elon College Honors Program (TAD).

Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos. 1. Modelos de Investigação <ol><li> Cultura celular <ol><li> Manter as células embrionárias de rim humano (HEK-T293) as células em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Cultivar células em frascos T75 e permitir-lhes chegar a 90% de confluência. </li><li> Levar a cabo a divisão celular através de tripsinização (0,25% de tripsina-EDTA) durante 3-5 min a 37 ° C em 5% de CO 2 </sub&gt;, A inactivação da tripsina com um volume igual de meio celular, e centrifugação das células durante 5 min a 700 xg a 4 ° C. </li><li> Aspirar a mídia e colocar o agregado de células em meios de cultura. </li><li> Semear as células em placa ou o frasco apropriado de 7 x 10 4 células para um frasco T75 48 h antes da citocina de tratamento. Isso deve dar ~ 70% de densidade no momento do tratamento. </li><li> Células morrem de fome de soro 24 horas mais tarde, aspirando a mídia e substituí-lo com o mesmo volume de meios livres de soro (DMEM, estéril). </li><li> Prepare o TNF-α, IL1-β, e IFN-γ, de pó liofilizado com água ultra-pura em concentrações úteis de 5 pg / mL, 10 ng / mL, e 10 ng / mL, respectivamente, e adicioná-los aos poços / frascos. </li><li> Soro mimo células fome pela adição de citocinas solubilizadas directamente ao meio de cultura de células de frascos apropriados. Os tratamentos consistiram de citocinas individuais, um cocktail de todos os 3 (designado por &quot;* 3&quot;), ou sterile água como um controlo (referido como &quot;0&quot;). </li><li> Incubar as células tratadas durante 24, 48 ou 72 horas antes da avaliação e colheita. </li></ol></li><li> Avaliação da viabilidade celular <ol><li> Adicione uma solução de 5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) em PBS 1x. </li><li> Para placas de 12 poços, adicionar 100 ul de solução de MTT a cada poço e agitar suavemente para assegurar uma distribuição uniforme. </li><li> Incubar as placas durante 15 min-1 hora a 37 ° C em 5% de CO 2, e verificar sob um microscópio para a presença de uma coloração púrpura. Se nenhum roxo está presente, agite novamente e permitir que as células para incubar em intervalos de 5 minutos até que roxo é observado. A quantidade de tempo necessária, deve ser determinada por cada investigador. </li><li> Usando uma pipeta de repetição, adicionar 700 ul de MTT solvente (HCl 4 mM e NP40 a 0,1% em isopropanol) a cada poço e agitar a placa (s) à temperatura ambiente durante 5-10 minutos, ou até toda a cor púrpura tinha deixado as células . Se o roxocor não sai das células, adicionar um adicional de 200 mL de solvente e continuar a girar. </li><li> Para a análise, levar 100 uL de cada poço e colocar numa placa de 96 poços e lidas num leitor de placas usando 570 nm e um comprimento de onda de referência de 630 nm, 595 nm no entanto também é aceitável, desde que as leituras são tomadas a configurações consistentes. </li></ol></li><li> Modelo Animal de ALS <ol><li> Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos. </li><li> Realizar genotipagem com primers padrão contra SOD1 mutante 25. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento de mitocôndrias ATENÇÃO: É importante trabalhar com rapidez e manter tudo em gelo durante todo o procedimento. <ol><li> Preparação de tampão de isolamento mitocondrial (MIB), tampão de isolamento da medula espinal (SC MIB) e tampão experimental (EB) <ol><li> Prepare as seguintes soluções de antecedência para MIB e EB. </li><li> Adicione 1 M Tris / MOPS por dissolução de 12,1 g de base Tris em 70 ml de H 2 O. Adicionar MOPS secos para obter o pH a 7,4. Ajustar o volume para 100 ml final. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li><li> Faça 1 M Kphos misturando 80,2 ml de K 2 HPO 4 e 19,8 ml de KH 2 PO 4. Guarde-o em temperatura ambiente. </li><li> Adicione 0,2 M de EGTA / Tris, adicionando 3,8 g de EGTA a 10 ml de H 2 O. Adicionar 1 M Tris / MOPS até dissolvidos, ~ 30-40 ml. Ajuste para 50 ml, filtro estéril e armazenar em temperatura ambiente. Note-se que o pH ser ~ 6,7. </li><li> Adicione 1 M glutamato, fazendo 10 ml de1 M de solução de ácido glutâmico. Esterilizar por filtração e armazenamento de 4 ° C. </li><li> Adicione 1 M Malato fazendo 10 ml de 1 M de solução de ácido málico. Adicionar Tris / MOPS a 50 mM. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione MIB a uma concentração de 200 mM de sacarose, 10 mM de Tris / MOPS, pH 7,4, e 1 mM de EGTA / Tris. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione MIB SC a uma concentração de 250 mM de sacarose, 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, e cocktail inibidor de protease. </li><li> Adicione EB, a uma concentração de KCl 125 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamato, 2,5 mM de malato, 1 mM de fosfato de K, pH 7,4, e 10 mM de EGTA / Tris. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equipamento de preparação, antes da colheita das células. <ol><li> Lavar um pequeno recipiente de vidro e homogeneização pilão três vezes com água estéril e colocar em gelo. </li><li> Reúna os itens necessários, como uma broca standard, scra celularpers, 1,5 ml, 15 ml e 50 ml de tubos e soluções. </li></ol></li><li> As mitocôndrias Isolation <ol><li> Células cultivadas <ol><li> Para cada tipo de amostra, use dois frascos T175 de células. </li><li> Certifique-se de que as células são ~ 90% confluentes e usar em experiências de controlo, ou a placa e tratar como acima descrito no passo 1.2. </li><li> No topo da bancada, meios de aspirado e lavar as células aderentes duas vezes com 15 ml de 1x PBS de cada vez. </li><li> Aspirar o tampão e raspar frascos para remover as células aderentes a partir do fundo do balão. </li><li> Adicionar 15 ml de PBS 1x a cada frasco, redemoinho, e transferir para cada 15 ml tubos cônicos e colocar no gelo. </li><li> Uma vez que é feito raspagem, centrifugar os tubos durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C utilizando uma mesa de centrífuga de topo, usando um rotor de balde oscilante. </li><li> Sobrenadantes Aspirar e ressuspender cada pellet em 1 ml de MIB. </li><li> Combine as duas suspensões e transferir para um pequeno recipiente de vidro para a homogeneização. </li><li> Adicionar MIBpara o reservatório até que atinja o tampão de primeira linha. Homogeneizar células com as pilão ligados a um misturador a velocidade média durante três passagens. Certifique-se que o navio está no gelo durante esta etapa, não para remover as pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passes contínuas. </li><li> Transferir a solução homogeneizada de um tubo cónico de 50 ml. </li><li> Desenhe a solução para uma seringa de 3 ml usando um calibre 18 1 ½ polegada de agulhas e expulsá-lo de volta para o tubo cônico no gelo com uma agulha de calibre 27 ½ polegadas. Cuidar para expelir a solução contra a parede interior do tubo como para utilizar a força de ruptura da membrana celular. </li><li> Repetir os passos de seringa para um total de cinco vezes. </li><li> Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 5 minutos a 600 xg, a 4 ° C numa centrífuga de topo de mesa utilizando um rotor de balde oscilante. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e distribuir entre três tubos de 1,5 ml. NOTA: Mitochondria são no sobrenadante após esta primeira, centrifugação de baixa velocidade, enquanto que as membranas celulares e as células não rompidas foram sedimentadas. </li><li> Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Sobrenadantes Aspirar e combinar as pelotas em 100 l MIB e coloque imediatamente em gelo. NOTA: As mitocôndrias são no sedimento após esta rotação de alta velocidade. As mitocôndrias será normalmente mantêm o seu potencial de membrana de ~ 2-3 de iões de gelo, depois do isolamento e são mais estáveis ​​como uma solução mãe concentrada no MIB. </li></ol></li><li> Isolamento mitocôndrias de tecido do mouse <ol><li> Anestesiar o mouse de acordo com o protocolo IACUC. Definir um vaporizador em 5,0% para induzir a anestesia. Confirmou que o animal é anestesiado por uma falta de reflexo para pitada pé ou reflexo de piscar quando o olho é abordado ou batido com um cotonete. Manter o rato sob anestesia por todo o procedimento cirúrgico, mantendo o vaporizador entre 1,5% e 2,0%. </li><li> Excise o fígado e da medula espinhal de cada animal e local separadamente no gelo frio 1x PBS - / - para enxaguar qualquer sangue. </li><li> Para o fígado, a transferência do tecido para um prato de pesagem em gelo e corte em pequenos pedaços utilizando uma lâmina de barbear fresco durante 1 min. </li><li> Adicionar tecido e tampão apropriado (MIB para o fígado ou SC MIB para a medula espinhal) para o reservatório até que atinja o tampão de primeira linha. Homogeneizar o tecido com o pilão à mão por cinco passes. Certifique-se que o navio está no gelo durante esta etapa, não para remover as pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passes contínuas. </li><li> Transferir os homogeneizados para limpar tubos de 15 ml. </li><li> Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 750 xg, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Salve os sobrenadantes para tubos limpos e colocá-los no gelo. NOTA: As mitocôndrias são no sobrenadante após esta primeira, centrifugação de baixa velocidade, enquanto que as membranas celulares e as células não rompidas foram sedimentadas. </li><li> Re-suspender as pelotas da medula espinhal in 500 ul de SC MIB. </li><li> Re-homogeneizar cada três vezes, só enchendo o recipiente com meio caminho SC MIB neste momento. </li><li> Transferir o novo homogeneizado para um tubo fresco. </li><li> Centrifugar a num rotor de ângulo fixo a 750 xg, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Combinar estes novos sobrenadantes, os quais contêm mais mitocôndrias, com o primeiro sobrenadante de cada amostra. </li><li> Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar os sobrenadantes e ressuspender as pastilhas de fígado em 500 ul de MIB e as pelotas medulares em 50 ul SC MIB e colocar imediatamente em gelo. NOTA: As mitocôndrias são no sedimento após esta rotação de alta velocidade. As mitocôndrias será normalmente mantêm o seu potencial de membrana de ~ 2-3 de iões de gelo, depois do isolamento e são mais estáveis ​​como uma solução mãe concentrada no MIB. </li><li> Realizar um ensaio de concentração de proteína para estimar a concentração de mitocôndrias em solução. Seguir as instruçõess para usando um Kit de Ensaio de Proteínas comerciais ou método semelhante 26. As concentrações típicas são de mitocôndrias: 2 frascos T175 rendimentos ~ 2 mg / mL, 1 de fígado de rato ~ 3-5 mg / ml, e um rato medula espinhal ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> Ensaio citocromo c usando um R &amp; D Rat / Mouse citocromo c Quantikine ELISA Kit (adaptado do protocolo fornecido pelo fabricante). <ol><li> Imediatamente antes de configurar as reações, diluir mitocôndrias a 0,5 mg / ml concentração trabalhar com EB e distribuir mitocôndrias diluídos em tubos de 1,5 ml para as reações (tipicamente 30-50 mL de mitocôndrias por tubo). </li><li> Adicionar ou EB ou DMSO, a 1% do volume total, para as mitocôndrias diluído e incuba-se as reacções no cimo da bancada durante 7-10 min. Estas reacções são estáveis ​​durante até 30 minutos à temperatura ambiente, se for necessário um período de tempo mais longo. </li><li> Mitocôndrias pelete por centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, a 4 ° C durante 5 min e cuidadosaly separar o sobrenadante e colocar em cada uma separada tubos de 1,5 ml. NOTA: Os tubos podem ser congeladas a -20 ° C para posterior análise ou utilizado imediatamente. </li><li> Determinar a libertação de citocromo c por uma comparação da concentração de citocromo c no sedimento e sobrenadante 27. <ol><li> Preparar as amostras por solubilização dos peletes no volume original da reacção com 0,5% de Tx-100 em PBS 1x. </li><li> Para cada amostra, preparar dois poços na placa de ELISA, uma para o sedimento agora solubilizado e um para o sobrenadante a partir da reacção por adição de 100 ul de conjugado de citocromo c (pode ser usado imediatamente para fora do frasco) mais 100 ul de 0,5% Tx 100 em 1x PBS, e então todo o sedimento ou sobrenadante da amostra. </li><li> Gentilmente vortex a placa um nível baixo (nível 2-4) por 20 segundos para misturar, tampa e incubar durante 1 hora, 37 ° C. </li><li> Em seguida, lava-se a placa quatro vezes com tampão de lavagem diluído de acordo com o FABRICAÇÃOinstruções de pronto-socorro. Remova qualquer excesso de solução tocando os poços em papel toalha. </li><li> Em seguida, adicionar 150 ul de 1: 1 de A + B Solução de desenvolvimento a cada poço e incubar a placa durante 20-30 minutos no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Finalmente, adicione 50 ml de solução de parada em cada poço e fazer leituras de absorbância a 540 nm usando um leitor de microplacas. Calcular a quantidade de libertação de citocromo c por comparação da quantidade de citocromo c na pelete vs sobrenadante para cada reacção. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Avaliação da função mitocondrial (Dys) <ol><li> Imediatamente antes de reacções são configurados, diluir mitocôndrias a 0,5 mg / ml de concentração de trabalho com EB e colocado em tubos de 1,5 ml para as reacções (tipicamente 30-50 ul de mitocôndrias são utilizados por tubo). </li><li> Tratamentos mitocondriais <ol><li> Adicionar tratamentos apropriados (controlo EB, 1 uM FCCP misturado com 50 nM de valinomicina, 10 uM rotenona, 5 uM oligomicina, KCN 2 mM, ou 200 uM de ADP, as concentrações finais) para separar as reacções em 1/10 do volume total de mitocôndrias diluído. Incubar as reações na bancada para 7 min. NOTA: É preciso ter cuidado ao manusear estas substâncias como a ingestão ou absorção acidental através da pele pode ser prejudicial. </li><li> Diluir TMRE, reconstituído em água estéril a uma concentração de trabalho de 100 uM e armazenadas a -20 ° C, a 2 uM e adicionar um volume igual ao volume de reacção mitocondrial. </li><li> Incubar as reações na bancada para 7 min. </li><li> Mitocôndrias pelete por centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Carga de metade do volume de sobrenadante de cada amostra para uma placa de 396 poços e ler a fluorescência. NOTA: excitação e de emissão de comprimentos de onda TMRE deve ser optimizado de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o volume e a placa que irá ser utilizado parao ensaio. Usando uma placa de 384 poços padrão preto com 25 ul de 1 uM TMRE (concentração final da reacção) o sinal mais forte foi obtido utilizando comprimentos de onda de excitação / emissão &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Calcula-se a diferença em prega-fluorescência entre o controlo (EB) e cada tratamento dividindo o valor da fluorescência relativa (RFU), obtida a partir do leitor de placas para a amostra experimental pela RFU na amostra de controlo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O tratamento de células HEK-293T com citocinas recombinantes provoca quantidades moderadas de morte de células ao longo de 48 horas (Figura 1). A quantidade de morte celular induzida por tratamento TNF-alfa é semelhante aos estudos previamente relatados 30 e a viabilidade celular diminui após a co-administração de várias citocinas que são maiores do que as quantidades aditivas com qualquer citocina sozinha também é consistente com a literatura 31,32. A capacidade de ajustar as quan...

As células vivas depositar energia metabólica sob a forma de gorduras e hidratos de carbono e utilizar esta energia para a biossíntese, transporte de membrana e movimento. Alguma energia é obtida no citossol através da conversão dos açúcares alimentares directamente em ATP durante a glicólise. No entanto, a principal fonte de produção de ATP numa célula é aproveitada dentro das mitocôndrias através da cadeia respiratória mitocondrial 1. A arquitectura de mitocôndrias proporciona a orientação espacial necessária para a produção de ATP efectiva e eficiente. As mitocôndrias possuem uma membrana dupla separados por um espaço intermembranar e em conjunto com a matriz, o compartimento mitocondrial mais interna, a casa dos componentes e coordenar as reacções químicas envolvidas na geração de ATP. A membrana interna contém uma série de complexos de proteínas ligadas a membranas que compreendem a cadeia respiratória, assim como o ATP sintase, o complexo de proteína que traz ADP e Pi juntos para a formação de ATP. A pousadamembrana er é dobrada em cristas e os elétrons são passados ​​ao longo dos complexos da cadeia respiratória através do citocromo c, uma transportadora de electrões solúvel que se move entre os complexos dentro do espaço intermembranar. Como electrões mover, a oxidação de equivalentes redutores ocorre e os iões de hidrogénio são bombeados da matriz para o espaço intermembranar. Como consequência da elevada concentração de iões no interior do espaço intermembranar, um gradiente electroquímico constrói resultando em um potencial de membrana, através da membrana mitocondrial interna (Δψ) 2. O oxigênio é o receptor de elétrons final da cadeia de transporte de elétrons e íons de hidrogênio fluir através das sintases ATP do espaço intermembranar de volta para a matriz, e ao fazê-lo diretamente causar a formação de ATP. Este processo tal como descrito na sua totalidade, é conhecida como a fosforilação oxidativa. As dobras do cristas aumentar a área de superfície da membrana interior, permitindo o transporte de electrões máxima e a produção de ATP dentrocada mitocôndria. As proteínas, enzimas e outras moléculas envolvidas na fosforilação oxidativa são derivadas de ambos os genes nucleares e mitocondriais. A mitocôndria contém seu próprio DNA circular, de codificação para 13 proteínas, bem como tRNAs e mRNAs necessárias para a produção de ATP 3. No entanto, muitas mais proteínas são necessárias e, portanto, são nuclear codificado. A maior parte destas proteínas nucleares codificados são direccionadas para a matriz mitocondrial pelo uso de pré-sequências na extremidade N-terminal da proteína precursora, e a sua importação é impulsionado em parte por Δψ 4,5. Além de contribuir para a bioenergética da célula, as mitocôndrias também influenciar principais processos metabólicos, tais como o TCA e beta-oxidação, a sinalização celular através da regulação de cálcio, bem como um papel-chave na apoptose 6. Especificamente, durante períodos de estresse celular, proteínas BCL-2 familiares que residem em ou interagir na membrana externa mitocondrial pode causar mitocondriala permeabilidade da membrana externa (MOMP) 7,8. Durante MOMP, citocromo c e outras proteínas são libertadas no citosol, e, juntamente com várias proteínas citosólicas formar um complexo denominado apoptossomo 9,10. O apoptossomo ativa caspases que transitam para a decompor as proteínas celulares e DNA durante a fase de execução da apoptose. Assim como ocorre MOMP, ΔΨ é recolhido e produção de ATP interrompida. Assim, a função mitocondrial, tal como apoptose é iniciada é comprometida e mudanças na ΔΨ pode ser correlacionada com mitocondrial e célula de saúde 12. Enquanto a apoptose é um ponto final em muitos modelos de doenças, a função mitocondrial e mudanças para ΔΨ também pode fornecer informações valiosas sobre a origem e / ou progressão da doença. Por exemplo, as alterações estruturais e funcionais mitocondriais foram documentadas durante o decurso de doenças neurodegenerativas 13,14. Na primeira parte do protocolo, isolação de mitocôndrias intactas que conservam a sua ΔΨ é descrito. As células HEK-293T foram expostas a diferentes concentrações e combinações de recombinante de TNF-α, IL1-β e IFN-γ para induzir apoptose. Estas citocinas foram escolhidos porque eles são frequentemente relatada como sendo elevada em amostras sépticas humanos primários 15 e a via extrínseca da apoptose pode ser desencadeada pela interacção de ligação ao seu receptor de TNF-α 6. Uma vez que existem variações subtis necessárias para isolar mitocôndrias funcionais de tecidos primários, em comparação com células cultivadas, e porque muita pesquisa utiliza animais, o protocolo também descreve como isolar mitocôndrias de fígado e de medula espinal de anterior esclerose lateral (ALS) modelo de ratinho. A segunda parte do protocolo foi desenvolvido para controlar as perturbações do potencial de membrana mitocondrial utilizando um corante fluorescente sensível ao potencial com um leitor de placa fluorescente. Diferenças entre o estado celular (isto é, saudáveis ​​vs insalubre) são diferenciados por quantificação da força de ΔΨ de mitocôndrias isoladas em conjunto com agentes de desacoplamento, inibidores da cadeia respiratória, inibidores do complexo e ionóforos, os quais causam a dissipação do potencial da membrana mitocondrial. Quanto mais saudável as mitocôndrias, quanto maior for a alteração na ΔΨ aquando do tratamento com inibidores mitocondriais, por conseguinte, a resposta das mitocôndrias podem ser utilizadas como um indicador da função mitocondrial (dis). Uso de mitocôndrias isoladas em vez de na avaliação in situ da função oferece uma evidência definitiva de que o tratamento de uma patologia ou modula alterações directamente para o organelo 16-18. Embora existam métodos na literatura para isolar mitocôndrias de células cultivadas, eles são vagos 17 e / ou utilizar equipamentos especializados 16. Este protocolo descreve em pormenor o método de isolamento e éfacilmente adaptável a outras linhas celulares, incluindo o tecido primário e culturas 13,14,19,20. Muitos estudos mitocôndrias isoladas utilizar as mesmas desacopladores mitocondriais e inibidores utilizados neste protocolo, mas com um eletrodo de Clark (21 é um exemplo representativo de muitos trabalhos na literatura), que por sua vez é uma peça muito específica e especializada de equipamentos. Além disso, este método tradicional tem limitações tais como baixo rendimento e alta complexidade 22,23 e requer uma quantidade substancial de mitocôndrias (~ 500 ng / reacção). Neste protocolo, o potencial fluorescente TMRE sonda de detecção de membrana é utilizado em conjunto com um leitor de placas fluorescente, que é uma máquina padrão em muitos laboratórios. TMRE é amplamente considerada, uma vez que rapidamente entra nas células e mitocôndrias isoladas e podem ser usadas em baixas concentrações 24. Várias reações podem ser rapidamente configurado em conjunto e em lotes analisados ​​usando esse protocolo. Além disso, a reacçãos requer uma pequena quantidade muito de mitocôndrias isoladas (~ 10 ug / reacção). Ao exigir menos material, amostras de tecido ou de cultura de células mais pequenas pode ser utilizada como um ponto de partida para o isolamento de mitocôndrias, mais repetições ou as reacções podem ser configurados, e material potencialmente suficiente para outras experiências mitocôndrias isoladas, tais como a produção de ATP, o consumo de oxigénio, ou importação Os ensaios são possíveis.

<table><tbody><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td>Pode usar o sal de potássio em seu lugar.</td></tr><tr><td>ácido málico</td><td>Sigma</td><td>M8304</td><td>Pode usar o sal de potássio em vez disso.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Base Trisma</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Diluir até 100&nbsp; &#956; M como estoque de trabalho em etanol e armazenar a -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Faça em DMSO e use como um 5&nbsp; &#956; M estoque de trabalho. Armazenar em -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mallinckrodt</td><td>6379</td><td>Faça um estoque concentrado em etanol e depois dilua com água&nbsp;</td></tr><tr><td>rotenona</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Altamente tóxico. Feito em etanol.</td></tr><tr><td>oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Altamente tóxico. Feito em etanol.</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25mg</td><td>Diluído 100&nbsp; &#956; M estoque com EB imediatamente antes de usar.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1x regular (glicose alta).</td></tr><tr><td>Caneta/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher</td><td>SH3002101</td><td>Armazene alíquotas em -20&nbsp; &#176; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td>Origem americana, qualidade premium. Inative o calor e armazene alíquotas a -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Corante de ensaio de tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Protien (5x)</td> <td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Qualquer ensaio de proteína pode substituir.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Faça 2 mg / ml de estoque em água para ensaio de proteína.</td></tr><tr><td>MTT em pó</td><td>Sigma</td><td>M2128</td><td>Filtro esterilizar 5 mg/ml estoque feito em PBS. Armazene alíquotas em -20&nbsp; &#176; C; loja em 4&nbsp; &#176; C por até 1 semana.</td></tr><tr><td>Solução de tergitol (NP-40)</td> <td>Sigma</td><td>NP40S</td><td></td></tr><tr><td>IL-1B Gibco humano recombinante</td><td></td><td>PCH08014</td><td>Uma vez aberta, alíquotas de loja em -20&nbsp; &#176; C</td></tr><tr><td>TNF-alfa Gibco Humano Recombinante</td><td></td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gama Gibco Humano Recombinante</td><td></td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (-/-)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Certifique-se de que não contém íons Mg2+ e Ca2+.</td></tr><tr><td>Cytochrom c kit ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DTC0</td><td>Humano para células HEK-293T.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolamento e análise funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse tissue

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

A comparação entre dois ou mais grupos distintos, como saudável vs. doença, é necessária para determinar o estado celular. As mitocôndrias estão no nexo da saúde celular devido ao seu papel no metabolismo celular e na produção de energia, bem como no controle da apoptose. Portanto, a avaliação direta de mitocôndrias isoladas e perturbações mitocondriais oferece a capacidade de determinar se a (dis)função específica da organela está ocorrendo. Os métodos descritos neste protocolo incluem o isolamento de mitocôndrias intactas e funcionais de células cultivadas HEK e fígado e medula espinhal de camundongos, mas podem ser facilmente adaptados para uso com outras células cultivadas ou tecidos animais. A função mitocondrial avaliada pelo TMRE e o uso de desacopladores e inibidores mitocondriais comuns em conjunto com um leitor de placas fluorescentes permitem que este protocolo não apenas seja versátil e acessível à maioria dos laboratórios de pesquisa, mas também ofereça alto rendimento.

O tratamento de células HEK-293T com 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, e 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 h, conduz a quantidades progressivas de morte celular (Figura 1A ). A viabilidade celular foi avaliada utilizando ensaios de MTT e consistentemente demonstra que existe ~ diminuição de 10% na viabilidade celular com o tratamento com 24 ~ hr e diminuição de 20% com o tratamento de 48 horas. As células tratadas com concentrações semelhantes (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, e...

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar as mitocôndrias respiratórias de células cultivadas ou tecido de camundongo e, em seguida, avaliar a força de seu potencial de membrana como uma medida do status celular. Para células cultivadas, isso é feito primeiro plaqueando e depois tratando as células. Em seguida, as células são homogeneizadas e o homogenato é passado por uma agulha para liberar ainda mais as mitocôndrias das células.Para o tecido do camundongo, o fígado é excisado do camundongo e depois homogeneizado em gelo com os dois tipos de material de partida. A centrifugação diferencial é então usada para isolar as mitocôndrias do resto do conteúdo celular. Depois que as mitocôndrias são submetidas a algum processamento, incluindo a adição do corante fluorescente sensível ao potencial de membrana, as medições de fluorescência TMRE são realizadas para calcular a força do potencial de membrana.Em última análise, a função mitocondrial e as perturbações no potencial da membrana mitocondrial podem ser avaliadas usando um corante fluorescente sensível ao potencial da membrana em conjunto com um leitor de placa fluorescente Quando tratado com acopladores e inibidores mitocondriais comuns, embora este método possa fornecer informações sobre a apoptose induzida por citocinas e a disfunção mitocondrial em um LS.It também pode ser aplicado a qualquer outro sistema onde a comparação entre duas ou mais amostras diferentes de procurado, como saudável versus doença ou duas espécies diferentes de um animal com taxas metabólicas diferentes. A demonstração visual desse método é crítica. Como as etapas de isolamento das mitocôndrias são difíceis de aprender.Isso ocorre porque há muitas nuances ao executar a técnica que podem ser negligenciadas nas seções de métodos tradicionais. Comece este procedimento com o crescimento de células renais embrionárias humanas, conforme descrito no protocolo de texto, 48 horas antes da placa de tratamento com citocinas, 160.000 células em um frasco T 1 75 para produzir cerca de 70% de densidade no momento do tratamento. Em seguida, o soro deixa as células famintas 24 horas depois, aspirando o meio e substituindo-o pelo mesmo volume de meio livre de soro.Finalmente, trate as células carentes de soro pela adição de citocinas solubilizadas diretamente no meio de cultura celular para realizar o isolamento das mitocôndrias. Primeiro aspire o meio e lave as células de aderência duas vezes com 15 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. De cada vez após a lavagem, aspirar o tampão e raspar o balão para retirar as células aderentes do fundo.Em seguida, adicione 15 mililitros de um XPBS a cada frasco, agite e transfira para tubos cônicos individuais de 15 mililitros no gelo. Uma vez feita a raspagem, centrifugue os tubos por cinco minutos a 700 vezes G quatro graus Celsius, usando uma centrífuga de mesa com um rotor de caçamba oscilante após a centrifugação, aspire os sobrenadantes e resus. Suspenda cada pellet em um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial.Em seguida, combine as duas suspensões e transfira para um pequeno recipiente de vidro para homogeneização nas mitocôndrias ressuspensas e tampão de isolamento mitocondrial no recipiente de vidro até que a solução atinja a primeira linha Com o pilão preso a uma broca, prossiga para homogeneizar as células no gelo em velocidade média por três passagens. Deve-se tomar cuidado para remover bolhas de ar ao colocar o pilão na solução, não remover o pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passagens contínuas. Transferir a solução homogeneizada para um tubo cónico de 50 ml.Em seguida, coloque a solução em uma seringa de três mililitros usando uma agulha de calibre 18, um em meia polegada e expulse-a de volta para o tubo cônico no gelo com uma agulha de calibre 27 de meia polegada. Tome cuidado para expelir a solução contra a parede interna do tubo para utilizar essa força para a ruptura da membrana celular. Repita as etapas da seringa um total de cinco vezes, depois transfira a solução para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 600 vezes G quatro graus Celsius em uma centrífuga de mesa usando um rotor de balde oscilante.As mitocôndrias estão no sobrenadante após este primeiro giro de baixa velocidade, enquanto algumas membranas e células intactas são peletizadas, remova cuidadosamente o sobrenadante e distribua entre três tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue os três tubos em um rotor de ângulo fixo a 10.000 vezes G quatro graus Celsius por cinco minutos. As mitocôndrias das células cultivadas parecem esbranquiçadas.Extirpar o fígado de cada animal e colocar um XPBS gelado sem cálcio ou magnésio para enxaguar o sangue. Transfira o tecido do fígado para um prato distante no gelo e pique-o em pedaços finos usando uma lâmina de barbear nova por um minuto. Em seguida, adicione tecido e o tampão apropriado ao vaso até que o tampão atinja a primeira linha.Prossiga para homogeneizar o tecido no gelo com o pilão à mão por cinco passagens. Deve-se tomar cuidado para remover bolhas de ar ao colocar o pilão na solução, não remover o pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passagens contínuas. Continue a processar as amostras com centrifugação e homogeneização conforme solicitado no protocolo de texto.Depois de combinar os novos sobrenadantes com o primeiro sobrenadante de cada amostra, centrifugar os tubos num rotor de ângulo fixo a 10 000 vezes G quatro graus Celsius durante cinco minutos. Aspire cuidadosamente a camada fofa branca superior usando uma ponta de pipeta e/ou empurrando-a para os lados do tubo. Em seguida, despeje suavemente o resto do sobrenadante e resus.Suspenda os pellets de mitocôndrias hepáticas em 500 microlitros de isolamento mitocondrial. As mitocôndrias tampão do fígado são marrons. Coloque rapidamente as amostras no gelo imediatamente antes que as reações sejam configuradas.Dilua as mitocôndrias a 0,5 miligramas por mililitro. Concentração de trabalho com tampão experimental. Adicione tratamentos apropriados, conforme listado no protocolo de texto, para separar os tubos em um décimo do volume total de mitocôndrias diluídas.Em seguida, coloque as mitocôndrias diluídas em cada tubo de reação e agite suavemente cada tubo para garantir a mistura adequada. Incube as reações na bancada por sete minutos. Em seguida, adicione um volume igual de dois tetraetil, bastonete, éster etílico micromolar, abreviado TMRE ao volume da reação mitocondrial.Novamente, agitando suavemente cada tubo para garantir a mistura adequada. Depois de incubar as reações na bancada por mais sete minutos, pelete as mitocôndrias por centrifugação em um rotor de ângulo fixo a 10.000 vezes G quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, carregar metade do volume sobrenadante de cada amostra num 3 84.A placa do poço prossegue para ler a fluorescência das amostras e, em seguida, calcula a diferença de dobra na fluorescência entre o controle e cada tratamento, conforme descrito no protocolo de texto, o tratamento de células T HEK 2 93 com TNF alfa IL um beta e IFN gama por 24 a 48 horas leva a quantidades progressivas de morte celular. A viabilidade celular foi avaliada usando ensaios de MTT que demonstram consistentemente que há uma diminuição aproximada de 10% na viabilidade celular com tratamento de 24 horas e uma diminuição aproximada de 20%. Com tratamento de 48 horas, as células tratadas com concentrações semelhantes produzem resultados semelhantes de morte celular em 48 horas.E o tratamento com citocinas individuais revela que a diminuição da viabilidade se deve a efeitos combinatórios. Os dados de viabilidade representam o desvio padrão médio de três experimentos separados. Cada execução em triplicado e o aperto das barras de erro demonstram a reprodutibilidade dos dados.A diminuição percentual no potencial de membrana em mitocôndrias isoladas de células tratadas com citocinas significa que a saúde mitocondrial foi afetada por tratamentos com citocinas, corroborando os dados de viabilidade após este procedimento. Outros métodos, como a avaliação de um total de geração de TP, um TP ou consumo de oxigênio, podem ser formados para avaliar questões adicionais, como quais diferenças de energia e respiração entre as diferentes amostras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias funcionais intactas e avaliar a força de seu potencial de membrana como um reflexo do estado celular.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

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Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

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