Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

O objetivo geral deste procedimento é isolar as mitocôndrias respiratórias de células cultivadas ou tecido de camundongo e, em seguida, avaliar a força de seu potencial de membrana como uma medida do status celular. Para células cultivadas, isso é feito primeiro plaqueando e depois tratando as células. Em seguida, as células são homogeneizadas e o homogenato é passado por uma agulha para liberar ainda mais as mitocôndrias das células.

Para o tecido do camundongo, o fígado é excisado do camundongo e depois homogeneizado em gelo com os dois tipos de material de partida. A centrifugação diferencial é então usada para isolar as mitocôndrias do resto do conteúdo celular. Depois que as mitocôndrias são submetidas a algum processamento, incluindo a adição do corante fluorescente sensível ao potencial de membrana, as medições de fluorescência TMRE são realizadas para calcular a força do potencial de membrana.

Em última análise, a função mitocondrial e as perturbações no potencial da membrana mitocondrial podem ser avaliadas usando um corante fluorescente sensível ao potencial da membrana em conjunto com um leitor de placa fluorescente Quando tratado com acopladores e inibidores mitocondriais comuns, embora este método possa fornecer informações sobre a apoptose induzida por citocinas e a disfunção mitocondrial em um LS.It também pode ser aplicado a qualquer outro sistema onde a comparação entre duas ou mais amostras diferentes de procurado, como saudável versus doença ou duas espécies diferentes de um animal com taxas metabólicas diferentes. A demonstração visual desse método é crítica. Como as etapas de isolamento das mitocôndrias são difíceis de aprender.

Isso ocorre porque há muitas nuances ao executar a técnica que podem ser negligenciadas nas seções de métodos tradicionais. Comece este procedimento com o crescimento de células renais embrionárias humanas, conforme descrito no protocolo de texto, 48 horas antes da placa de tratamento com citocinas, 160.000 células em um frasco T 1 75 para produzir cerca de 70% de densidade no momento do tratamento. Em seguida, o soro deixa as células famintas 24 horas depois, aspirando o meio e substituindo-o pelo mesmo volume de meio livre de soro.

Finalmente, trate as células carentes de soro pela adição de citocinas solubilizadas diretamente no meio de cultura celular para realizar o isolamento das mitocôndrias. Primeiro aspire o meio e lave as células de aderência duas vezes com 15 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. De cada vez após a lavagem, aspirar o tampão e raspar o balão para retirar as células aderentes do fundo.

Em seguida, adicione 15 mililitros de um XPBS a cada frasco, agite e transfira para tubos cônicos individuais de 15 mililitros no gelo. Uma vez feita a raspagem, centrifugue os tubos por cinco minutos a 700 vezes G quatro graus Celsius, usando uma centrífuga de mesa com um rotor de caçamba oscilante após a centrifugação, aspire os sobrenadantes e resus. Suspenda cada pellet em um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial.

Em seguida, combine as duas suspensões e transfira para um pequeno recipiente de vidro para homogeneização nas mitocôndrias ressuspensas e tampão de isolamento mitocondrial no recipiente de vidro até que a solução atinja a primeira linha Com o pilão preso a uma broca, prossiga para homogeneizar as células no gelo em velocidade média por três passagens. Deve-se tomar cuidado para remover bolhas de ar ao colocar o pilão na solução, não remover o pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passagens contínuas. Transferir a solução homogeneizada para um tubo cónico de 50 ml.

Em seguida, coloque a solução em uma seringa de três mililitros usando uma agulha de calibre 18, um em meia polegada e expulse-a de volta para o tubo cônico no gelo com uma agulha de calibre 27 de meia polegada. Tome cuidado para expelir a solução contra a parede interna do tubo para utilizar essa força para a ruptura da membrana celular. Repita as etapas da seringa um total de cinco vezes, depois transfira a solução para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 600 vezes G quatro graus Celsius em uma centrífuga de mesa usando um rotor de balde oscilante.

As mitocôndrias estão no sobrenadante após este primeiro giro de baixa velocidade, enquanto algumas membranas e células intactas são peletizadas, remova cuidadosamente o sobrenadante e distribua entre três tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue os três tubos em um rotor de ângulo fixo a 10.000 vezes G quatro graus Celsius por cinco minutos. As mitocôndrias das células cultivadas parecem esbranquiçadas.

Extirpar o fígado de cada animal e colocar um XPBS gelado sem cálcio ou magnésio para enxaguar o sangue. Transfira o tecido do fígado para um prato distante no gelo e pique-o em pedaços finos usando uma lâmina de barbear nova por um minuto. Em seguida, adicione tecido e o tampão apropriado ao vaso até que o tampão atinja a primeira linha.

Prossiga para homogeneizar o tecido no gelo com o pilão à mão por cinco passagens. Deve-se tomar cuidado para remover bolhas de ar ao colocar o pilão na solução, não remover o pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passagens contínuas. Continue a processar as amostras com centrifugação e homogeneização conforme solicitado no protocolo de texto.

Depois de combinar os novos sobrenadantes com o primeiro sobrenadante de cada amostra, centrifugar os tubos num rotor de ângulo fixo a 10 000 vezes G quatro graus Celsius durante cinco minutos. Aspire cuidadosamente a camada fofa branca superior usando uma ponta de pipeta e/ou empurrando-a para os lados do tubo. Em seguida, despeje suavemente o resto do sobrenadante e resus.

Suspenda os pellets de mitocôndrias hepáticas em 500 microlitros de isolamento mitocondrial. As mitocôndrias tampão do fígado são marrons. Coloque rapidamente as amostras no gelo imediatamente antes que as reações sejam configuradas.

Dilua as mitocôndrias a 0,5 miligramas por mililitro. Concentração de trabalho com tampão experimental. Adicione tratamentos apropriados, conforme listado no protocolo de texto, para separar os tubos em um décimo do volume total de mitocôndrias diluídas.

Em seguida, coloque as mitocôndrias diluídas em cada tubo de reação e agite suavemente cada tubo para garantir a mistura adequada. Incube as reações na bancada por sete minutos. Em seguida, adicione um volume igual de dois tetraetil, bastonete, éster etílico micromolar, abreviado TMRE ao volume da reação mitocondrial.

Novamente, agitando suavemente cada tubo para garantir a mistura adequada. Depois de incubar as reações na bancada por mais sete minutos, pelete as mitocôndrias por centrifugação em um rotor de ângulo fixo a 10.000 vezes G quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, carregar metade do volume sobrenadante de cada amostra num 3 84.

A placa do poço prossegue para ler a fluorescência das amostras e, em seguida, calcula a diferença de dobra na fluorescência entre o controle e cada tratamento, conforme descrito no protocolo de texto, o tratamento de células T HEK 2 93 com TNF alfa IL um beta e IFN gama por 24 a 48 horas leva a quantidades progressivas de morte celular. A viabilidade celular foi avaliada usando ensaios de MTT que demonstram consistentemente que há uma diminuição aproximada de 10% na viabilidade celular com tratamento de 24 horas e uma diminuição aproximada de 20%. Com tratamento de 48 horas, as células tratadas com concentrações semelhantes produzem resultados semelhantes de morte celular em 48 horas.

E o tratamento com citocinas individuais revela que a diminuição da viabilidade se deve a efeitos combinatórios. Os dados de viabilidade representam o desvio padrão médio de três experimentos separados. Cada execução em triplicado e o aperto das barras de erro demonstram a reprodutibilidade dos dados.

A diminuição percentual no potencial de membrana em mitocôndrias isoladas de células tratadas com citocinas significa que a saúde mitocondrial foi afetada por tratamentos com citocinas, corroborando os dados de viabilidade após este procedimento. Outros métodos, como a avaliação de um total de geração de TP, um TP ou consumo de oxigênio, podem ser formados para avaliar questões adicionais, como quais diferenças de energia e respiração entre as diferentes amostras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias funcionais intactas e avaliar a força de seu potencial de membrana como um reflexo do estado celular.