Eletroporação Murina In Utero
No útero a eletroporação é uma técnica importante para estudar os mecanismos moleculares que orientam a proliferação, diferenciação, migração e matura…
No útero a eletroporação é uma técnica fundamental para estudar os mecanismos moleculares que orientam o neurodesenvolvimento. Ao injetar DNA para alterar a expressão genética em regiões específicas do cérebro de roedores em desenvolvimento, os pesquisadores podem estudar a proliferação, diferenciação, migração e maturação de células neurais no contexto de seu ambiente natural.
Este vídeo introduzirá os princípios-chave por trás na eletroporação uterá, uma visão geral básica sobre como executar a técnica e suas aplicações em pesquisa neurobiológica.
Antes de nos aprofundarmos em como realizar este procedimento, vamos primeiro passar por cima de alguns princípios de eletroporação. Este procedimento utiliza pulsos elétricos que criam poros transitórios em membranas celulares, permitindo que o DNA entre na célula. Uma vez que o DNA carregado negativamente se moverá em direção ao eletrodo positivo, diferentes populações celulares podem ser alvo dependendo do posicionamento do campo elétrico.
Embora a eletroporação tenha sido tradicionalmente usada em estudos in vitro, os avanços científicos ampliaram sua utilização para órgãos intactos, incluindo aqueles encontrados em embriões de camundongos em desenvolvimento no útero.
No útero a eletroporação, ao contrário da cultura celular ou técnicas ex vivo, tem a vantagem de que as células transfeinadas continuarão expostas a todas as pistas fisiológicas que guiam o desenvolvimento normal. Isso é particularmente importante no cérebro, onde estruturas como axônios requerem sugestões de orientação de outros tipos de células para se desenvolverem adequadamente.
O desenvolvimento cerebral, em particular, envolve uma série programada de eventos de proliferação e migração, o que significa que diferentes camadas teciduais podem ser direcionadas com base no tempo da eletroporação.
Por fim, a disponibilidade de diferentes tipos de eletrodos permite que os pesquisadores acessem ambas as regiões próximas à superfície do cérebro, bem como áreas mais profundas. Eletrodos de remo são usados ao atingir partes superficiais do cérebro, como o córtex e o hipocampo, enquanto eletrodos de agulha menores são usados ao atingir estruturas profundas como o tálamo e o hipotálamo.
Agora que discutimos alguns princípios básicos por trás da técnica, vamos tirar nossos preparativos do caminho para que possamos nos aprofundar no procedimento cirúrgico e na eletroporação uterativa.
Primeiro, esterilize todos os instrumentos e limpe a área cirúrgica com 70% de etanol. Em seguida, faça uma solução de injeção dissolvendo DNA plasmídeo em PBS estéril contendo 0,1% Verde Rápido. O Fast Green é adicionado para permitir a visualização da solução de injeção no embrião. Por último, usando um puxador de agulha, uma agulha ultra fina deve ser criada para reduzir a perda de fluido amniótico e posterior mortalidade fetal.
Agora que temos tudo preparado, vamos passar os passos básicos para eletroporar tecido cerebral no desenvolvimento de roedores. Comece anestesiando uma represa grávida usando 5% de isoflurano e, em seguida, transferindo-a para um tubo respirador que fornece 2,25% de isoflurane durante todo o procedimento. Em seguida, para alívio da dor pós-operatório, entregue um analgésico como buprenorfina subcutâneamente. Em seguida, raspe o abdômen e esterilize o local da incisão.
Para expor cirurgicamente o útero, faça uma incisão vertical ao longo da linha média na pele e, usando uma tesoura, corte através do peritônio. Para evitar que os embriões sequem, cubra a abertura com gaze salina estéril encharcada. Em seguida, retire suavemente a cadeia embrionária da cavidade abdominal, com certeza manter os embriões molhados, cobrindo com soro fisiológico pré-aquecido estéril.
Usando um microscópio de dissecção, identifique embriões devidamente posicionados para fácil acesso ao cérebro. Usando seus dedos ou fórceps estabilizam a cabeça do embrião e injetam a solução de DNA através da parede uterina e no cérebro. Coloque um eletrodo em cada lado da cabeça, com o eletrodo positivo na direção para a qual você quer o DNA eletroporado. Uma vez que todos os embriões devidamente posicionados são eletroporados, coloque cuidadosamente o chifre uterino de volta na cavidade abdominal.
Antes de fechar a incisão, adicione 2 - 3 ml de soro fisiológico quente à cavidade. Costue o peritônio junto com suturas absorvíveis e feche a pele usando grampos. Por fim, transfira o mouse para uma gaiola com uma almofada de aquecimento e monitor.
Agora que passamos por cima de como atuar na eletroporação uterás, vamos examinar algumas aplicações a jusante desta técnica.
No útero a eletroporação é uma ferramenta útil para investigar como genes específicos contribuem para o desenvolvimento neural. Construtos eletroporados podem guiar a superexpressão de proteínas selvagens ou mutantes ou bloquear completamente a expressão proteica. Fenótipos neurológicos podem então ser avaliados no nível microscópico ou organismo. Por exemplo, esses experimentadores determinaram que a superexpressão transitória do gene associado à esquizofrenia, DISC-1 no cérebro do camundongo em desenvolvimento, resultou em hipersensibilidade à anfetamina mais tarde na vida.
No útero a eletroporação também pode ser útil para visualizar populações celulares específicas e as conexões que fazem, fornecendo sequências codificando proteínas fluorescentes em tecido neural. Por exemplo, esses experimentadores eletroporaram o gene da proteína fluorescente verde em retinas E13,5 para estudar células gânglios da retina, ou RGCs, que transmitem informações visuais do olho para o cérebro. O exame das retinas em E18.5 mostra como essa técnica pode ser usada para traçar o caminho do axônio RGC através do nervo óptico, quiasmo óptico e trato óptico.
Finalmente, muitos eventos importantes no desenvolvimento neural ocorrem após o nascimento, inspirando os cientistas a desenvolver uma técnica modificada chamada eletroporação in vivo. Este procedimento segue os mesmos passos básicos da eletroporação uterativa, mas geralmente é realizado nos primeiros dias após o nascimento. A manipulação genética pós-natal é particularmente útil para estudar tipos de células nascidas posteriormente, como as encontradas dentro da lâmpada olfativa mostrada aqui.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE na eletroporação uterativa. Este vídeo continha princípios-chave e uma visão geral básica sobre como se apresentar na eletroporação uteria, bem como algumas aplicações a jusante que permitem aos pesquisadores investigar os mecanismos moleculares que orientam o neurodesenvolvimento.
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No útero a eletroporação é uma técnica fundamental para estudar os mecanismos moleculares que orientam o neurodesenvolvimento. Ao injetar DNA para alterar a expressão genética em regiões específicas do cérebro de roedores em desenvolvimento, os pesquisadores podem estudar a proliferação, diferenciação, migração e maturação de células neurais no contexto de seu ambiente natural.
Este vídeo introduzirá os princípios-chave por trás na eletroporação uterá, uma visão geral básica sobre como executar a técnica e suas aplicações em pesquisa neurobiológica.
Antes de nos aprofundarmos em como realizar este procedimento, vamos primeiro passar por cima de alguns princípios de eletroporação. Este procedimento utiliza pulsos elétricos que criam poros transitórios em membranas celulares, permitindo que o DNA entre na célula. Uma vez que o DNA carregado negativamente se moverá em direção ao eletrodo positivo, diferentes populações celulares podem ser alvo dependendo do posicionamento do campo elétrico.
Embora a eletroporação tenha sido tradicionalmente usada em estudos in vitro, os avanços científicos ampliaram sua utilização para órgãos intactos, incluindo aqueles encontrados em embriões de camundongos em desenvolvimento no útero.
No útero a eletroporação, ao contrário da cultura celular ou técnicas ex vivo, tem a vantagem de que as células transfeinadas continuarão expostas a todas as pistas fisiológicas que guiam o desenvolvimento normal. Isso é particularmente importante no cérebro, onde estruturas como axônios requerem sugestões de orientação de outros tipos de células para se desenvolverem adequadamente.
O desenvolvimento cerebral, em particular, envolve uma série programada de eventos de proliferação e migração, o que significa que diferentes camadas teciduais podem ser direcionadas com base no tempo da eletroporação.
Por fim, a disponibilidade de diferentes tipos de eletrodos permite que os pesquisadores acessem ambas as regiões próximas à superfície do cérebro, bem como áreas mais profundas. Eletrodos de remo são usados ao atingir partes superficiais do cérebro, como o córtex e o hipocampo, enquanto eletrodos de agulha menores são usados ao atingir estruturas profundas como o tálamo e o hipotálamo.
Agora que discutimos alguns princípios básicos por trás da técnica, vamos tirar nossos preparativos do caminho para que possamos nos aprofundar no procedimento cirúrgico e na eletroporação uterativa.
Primeiro, esterilize todos os instrumentos e limpe a área cirúrgica com 70% de etanol. Em seguida, faça uma solução de injeção dissolvendo DNA plasmídeo em PBS estéril contendo 0,1% Verde Rápido. O Fast Green é adicionado para permitir a visualização da solução de injeção no embrião. Por último, usando um puxador de agulha, uma agulha ultra fina deve ser criada para reduzir a perda de fluido amniótico e posterior mortalidade fetal.
Agora que temos tudo preparado, vamos passar os passos básicos para eletroporar tecido cerebral no desenvolvimento de roedores. Comece anestesiando uma represa grávida usando 5% de isoflurano e, em seguida, transferindo-a para um tubo respirador que fornece 2,25% de isoflurane durante todo o procedimento. Em seguida, para alívio da dor pós-operatório, entregue um analgésico como buprenorfina subcutâneamente. Em seguida, raspe o abdômen e esterilize o local da incisão.
Para expor cirurgicamente o útero, faça uma incisão vertical ao longo da linha média na pele e, usando uma tesoura, corte através do peritônio. Para evitar que os embriões sequem, cubra a abertura com gaze salina estéril encharcada. Em seguida, retire suavemente a cadeia embrionária da cavidade abdominal, com certeza manter os embriões molhados, cobrindo com soro fisiológico pré-aquecido estéril.
Usando um microscópio de dissecção, identifique embriões devidamente posicionados para fácil acesso ao cérebro. Usando seus dedos ou fórceps estabilizam a cabeça do embrião e injetam a solução de DNA através da parede uterina e no cérebro. Coloque um eletrodo em cada lado da cabeça, com o eletrodo positivo na direção para a qual você quer o DNA eletroporado. Uma vez que todos os embriões devidamente posicionados são eletroporados, coloque cuidadosamente o chifre uterino de volta na cavidade abdominal.
Antes de fechar a incisão, adicione 2 - 3 ml de soro fisiológico quente à cavidade. Costue o peritônio junto com suturas absorvíveis e feche a pele usando grampos. Por fim, transfira o mouse para uma gaiola com uma almofada de aquecimento e monitor.
Agora que passamos por cima de como atuar na eletroporação uterás, vamos examinar algumas aplicações a jusante desta técnica.
No útero a eletroporação é uma ferramenta útil para investigar como genes específicos contribuem para o desenvolvimento neural. Construtos eletroporados podem guiar a superexpressão de proteínas selvagens ou mutantes ou bloquear completamente a expressão proteica. Fenótipos neurológicos podem então ser avaliados no nível microscópico ou organismo. Por exemplo, esses experimentadores determinaram que a superexpressão transitória do gene associado à esquizofrenia, DISC-1 no cérebro do camundongo em desenvolvimento, resultou em hipersensibilidade à anfetamina mais tarde na vida.
No útero a eletroporação também pode ser útil para visualizar populações celulares específicas e as conexões que fazem, fornecendo sequências codificando proteínas fluorescentes em tecido neural. Por exemplo, esses experimentadores eletroporaram o gene da proteína fluorescente verde em retinas E13,5 para estudar células gânglios da retina, ou RGCs, que transmitem informações visuais do olho para o cérebro. O exame das retinas em E18.5 mostra como essa técnica pode ser usada para traçar o caminho do axônio RGC através do nervo óptico, quiasmo óptico e trato óptico.
Finalmente, muitos eventos importantes no desenvolvimento neural ocorrem após o nascimento, inspirando os cientistas a desenvolver uma técnica modificada chamada eletroporação in vivo. Este procedimento segue os mesmos passos básicos da eletroporação uterativa, mas geralmente é realizado nos primeiros dias após o nascimento. A manipulação genética pós-natal é particularmente útil para estudar tipos de células nascidas posteriormente, como as encontradas dentro da lâmpada olfativa mostrada aqui.
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Q1: How does electroporation create transient pores in cell membranes?
Electroporation uses electrical pulses to temporarily disrupt cell membranes, creating transient pores that allow DNA to enter cells. Since negatively charged DNA moves toward the positive electrode, researchers can target specific cell populations by positioning the electric field appropriately. This mechanism enables precise gene delivery to desired brain regions during development.
Q2: Why is in utero electroporation better than in vitro techniques for studying neural development?
In utero electroporation allows transfected cells to remain exposed to physiological cues that guide normal development, unlike cell culture or ex vivo techniques. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types to develop properly. Studying cells in their natural environment provides more accurate insights into developmental mechanisms.
Q3: What is the purpose of Fast Green in the injection solution?
Fast Green is added to the plasmid DNA injection solution at 0.1% concentration to allow visualization of the injection solution within the embryo. This dye enables researchers to confirm accurate DNA delivery to the target brain region during the surgical procedure, ensuring successful transfection of the desired neural tissue.
Q4: How do paddle electrodes and needle electrodes differ in their applications?
Paddle electrodes target superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes access deeper structures like the thalamus and hypothalamus. The choice of electrode type depends on the location of the target tissue within the developing brain, allowing researchers to deliver genes to specific neural populations based on their anatomical position.
Q5: What are the main applications of in utero electroporation in neurobiology research?
In utero electroporation enables investigation of how specific genes contribute to neural development by overexpressing wildtype or mutant proteins or blocking protein expression. Researchers can also visualize specific cell populations and their connections by delivering fluorescent protein sequences into neural tissue. Additionally, neurological phenotypes can be assessed at microscopic or organismal levels to understand gene function in development.
Q6: How does the timing of electroporation allow targeting of different neural cell populations?
Brain development involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning different tissue layers can be targeted based on when electroporation is performed. By timing the procedure to coincide with specific developmental stages, researchers can selectively transfect neural progenitors, migrating neurons, or other cell types present at particular embryonic ages, enabling stage-specific genetic manipulation.
Q7: What is in vivo electroporation and how does it extend in utero electroporation research?
In vivo electroporation follows the same basic steps as in utero electroporation but is performed within the first few days after birth. This modified technique is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb, allowing researchers to investigate neural development events that occur after birth when in utero manipulation is no longer possible.