1.14: Eletroporação Murina In Utero

A eletroporação in utero é uma técnica fundamental para estudar os mecanismos moleculares que orientam o neurodesenvolvimento. Ao injetar DNA para alterar a expressão gênica em regiões específicas do cérebro de roedores em desenvolvimento, os pesquisadores podem estudar a proliferação, diferenciação, migração e maturação de células neurais no contexto de seu ambiente natural.

Este vídeo apresentará os princípios-chave por trás da eletroporação in utero, uma visão geral básica sobre como realizar a técnica e suas aplicações na pesquisa em neurobiologia.

Antes de nos aprofundarmos em como realizar este procedimento, vamos primeiro examinar alguns princípios da eletroporação. Este procedimento utiliza pulsos elétricos que criam poros transitórios nas membranas celulares, permitindo que o DNA entre na célula. Como o DNA carregado negativamente se moverá em direção ao eletrodo positivo, diferentes populações de células podem ser direcionadas dependendo do posicionamento do campo elétrico.

Embora a eletroporação tenha sido tradicionalmente usada em estudos in vitro, os avanços científicos ampliaram sua utilização para órgãos intactos, incluindo aqueles encontrados em embriões de camundongos que se desenvolvem no útero.

A eletroporação in utero, ao contrário das técnicas de cultura de células ou ex vivo, tem a vantagem de que as células transfectadas continuarão a ser expostas a todas as pistas fisiológicas que orientam o desenvolvimento normal. Isso é particularmente importante no cérebro, onde estruturas como axônios requerem pistas de orientação de outros tipos de células para se desenvolverem adequadamente.

O desenvolvimento do cérebro, em particular, envolve uma série programada de eventos de proliferação e migração, o que significa que diferentes camadas de tecido podem ser direcionadas com base no tempo de eletroporação.

Por fim, a disponibilidade de diferentes tipos de eletrodos permite que os pesquisadores acessem regiões próximas à superfície do cérebro, bem como áreas mais profundas. Os eletrodos de pá são usados para atingir partes superficiais do cérebro, como o córtex e o hipocampo, enquanto eletrodos de agulha menores são usados para atingir estruturas profundas como o tálamo e o hipotálamo.

Agora que discutimos alguns princípios básicos por trás da técnica, vamos tirar nossos preparativos do caminho para que possamos nos aprofundar no procedimento cirúrgico e na eletroporação in utero.

Primeiro, esterilize todos os instrumentos e limpe a área cirúrgica com etanol 70%. Em seguida, faça uma solução de injeção dissolvendo o DNA do plasmídeo em PBS estéril contendo 0,1% Fast Green. O Fast Green é adicionado para permitir a visualização da solução de injeção no embrião. Por fim, usando um extrator de agulha, uma agulha ultrafina deve ser criada para reduzir a perda de líquido amniótico e a subsequente mortalidade fetal.

Agora que temos tudo preparado, vamos examinar as etapas básicas para eletroporar o tecido cerebral em roedores em desenvolvimento. Comece anestesiando uma mãe grávida usando isoflurano a 5% e, em seguida, transferindo-o para um tubo respirador que forneça isoflurano a 2,25% durante todo o procedimento. Em seguida, para alívio da dor pós-operatória, administre um analgésico como a buprenorfina por via subcutânea. Em seguida, raspe o abdômen e esterilize o local da incisão.

Para expor cirurgicamente o útero, faça uma incisão vertical ao longo da linha média da pele e, usando uma tesoura, corte o peritônio. Para evitar que os embriões sequem, cubra a abertura com gaze embebida em solução salina estéril. Em seguida, puxe suavemente a cadeia embrionária para fora da cavidade abdominal, certificando-se de manter os embriões úmidos, cobrindo com solução salina pré-aquecida estéril.

Usando um microscópio de dissecação, identifique os embriões posicionados corretamente para facilitar o acesso ao cérebro. Usando os dedos ou fórceps, estabilize a cabeça do embrião e injete a solução de DNA através da parede uterina e no cérebro. Coloque um eletrodo em cada lado da cabeça, com o eletrodo positivo na direção em que deseja que o DNA seja eletroporado. Depois que todos os embriões posicionados adequadamente forem eletroporados, coloque cuidadosamente o corno uterino de volta na cavidade abdominal.

Antes de fechar a incisão, adicione 2 a 3 ml de solução salina morna na cavidade. Costure o peritônio com suturas absorvíveis e feche a pele com grampos. Por fim, transfira o mouse para uma gaiola com uma almofada de aquecimento e monitor.

Agora que vimos como realizar a eletroporação no útero, vamos examinar algumas aplicações a jusante dessa técnica.

A eletroporação in utero é uma ferramenta útil para investigar como genes específicos contribuem para o desenvolvimento neural. As construções eletroporadas podem orientar a superexpressão de proteínas selvagens ou mutantes ou bloquear completamente a expressão de proteínas. Os fenótipos neurológicos podem então ser avaliados no nível microscópico ou do organismo. Por exemplo, esses experimentadores determinaram que a superexpressão transitória do gene associado à esquizofrenia, DISC-1, no cérebro de camundongos em desenvolvimento, resultou em hipersensibilidade à anfetamina mais tarde na vida.

A eletroporação in utero também pode ser útil para visualizar populações de células específicas e as conexões que elas fazem, entregando sequências que codificam proteínas fluorescentes no tecido neural. Por exemplo, esses experimentadores eletroporaram o gene da proteína fluorescente verde em retinas E13.5 para estudar as células ganglionares da retina, ou RGCs, que transmitem informações visuais do olho para o cérebro. O exame das retinas em E18.5 mostra como essa técnica pode ser usada para traçar o caminho do axônio RGC através do nervo óptico, quiasma óptico e trato óptico.

Finalmente, muitos eventos importantes no desenvolvimento neural ocorrem após o nascimento, inspirando os cientistas a desenvolver uma técnica modificada chamada eletroporação in vivo. Este procedimento segue as mesmas etapas básicas da eletroporação no útero, mas geralmente é realizado nos primeiros dias após o nascimento. A manipulação genética pós-natal é particularmente útil para estudar tipos de células nascidas tardiamente, como as encontradas no bulbo olfatório mostrado aqui.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre eletroporação no útero. Este vídeo continha princípios-chave e uma visão geral básica sobre como realizar a eletroporação no útero, bem como algumas aplicações a jusante que permitem aos pesquisadores investigar os mecanismos moleculares que orientam o neurodesenvolvimento.

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