A visualização não-lítica exocitose de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a exocitose não lítica de cryptococcus neoformans de macrófagos neurônios primários da medula óssea. Isso é feito primeiro plaqueando e infectando neuromacrófagos ativados com células fúngicas para permitir a fagocitose e internalização de Xeomin. O segundo passo é remover as células fúngicas extracelulares para garantir uma monocamada clara de macrófagos infectados e não infectados.

Em seguida, os macrófagos são incubados em uma câmara de dióxido de carbono com temperatura controlada e registrados por 24 horas, a fim de capturar casos de exocitose não lítica e outras interações. A etapa final é criar um filme compactando todos os quadros feitos em um período de 24 horas. Em última análise, a visualização de macrófagos com microscopia de luz digital é usada para observar a variedade de tipos de exocitose não lítica que os macrófagos sofrem ao longo de uma infecção de 24 horas.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de interação patógeno hospedeiro, como tempo e quantificação de eventos celulares No dia anterior ao experimento, selecione uma colônia individual de capataz sênior que foi cultivada em uma placa de ágar sbarro e inocule. 10 mililitros de caldo de sbarro. Permita que a cultura cresça durante a noite a 37 graus Celsius, agitando a uma velocidade de 250 RPM após a eutanásia de camundongos, conforme descrito no protocolo escrito.

Esterilize todo o corpo com álcool etílico 70%. Remova os fêmures e a tíbia e coloque os ossos em duplas estéreis, meio de águia modificado ou DMEM. Em seguida, remova o excesso de tecido e músculo usando lenços delicados até que os ossos estejam completamente limpos.

Coloque apenas ossos intactos em uma placa de Petri contendo álcool etílico 70% e incube por três minutos para matar os microrganismos associados. Remova os ossos e coloque em uma placa de Petri com DMEM estéril. Em seguida, corte cuidadosamente as pontas dos ossos.

Segure o osso sobre um tubo cônico MT de 50 mililitros colocado no gelo e use uma agulha de calibre 25 para lavar cuidadosamente 10 mililitros de DMEM frio em cada osso. Em seguida, centrifugue a suspensão celular coletada à temperatura ambiente por 10 minutos a 650 vezes G. Durante esta centrifugação, prepare e filtre e esterilize os meios de alimentação de macrófagos da medula óssea conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, ressuspenda a paleta resultante com 10 mililitros de meio de alimentação.

Passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 micrômetros para interromper aglomerados de células e remover grandes detritos. Em seguida, coloque um mililitro da suspensão de células de cepa em 10 mililitros de meio de alimentação, placas de Petri especificadas para uso em cultura de tecidos. Deixe as células aderirem a 37 graus Celsius com 10% de dióxido de carbono por sete dias.

Alterar o meio de alimentação conforme descrito no protocolo de texto no dia anterior ao experimento. Separe os macrófagos da placa removendo o meio de alimentação e adicione cinco mililitros de um reagente de remoção de células suave à placa após a incubação das células por cinco a 10 minutos. A 37 graus Celsius, remova os macrófagos com uma pipetagem suave.

Granular as células por centrifugação a 650 vezes G durante 10 minutos antes de dobrar novamente o pellet num mililitro de meio de alimentação. Usando uma diluição de um a 20, calcule a concentração de macrófagos pipetando 10 microlitros da suspensão celular em um hemocitômetro usando 14 milímetros de fundo de vidro. As placas de Petri colocam uma concentração de um vezes 10 elevado ao quinto macrófagos diretamente no poço interno, que contém no máximo 200 microlitros.

Tome cuidado para não exceder este volume. Deixe as células aderirem à placa de Petri de vidro, colocando-as em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione um a dois mililitros de meio de alimentação suplementado com lipopolissacarídeo a um miligrama por mililitro e interferon gama.

A 500 unidades por mililitro, permita que as células incubem durante a noite no dia do experimento. Remova um mililitro de uma cultura de células G inoculada durante a noite e bata as células de levedura por centrifugação por cinco minutos de 420 vezes G.To remova o meio e os produtos criptocócicos extracelulares, lave as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato ou PBS seguido de centrifugação como antes. Depois de suspender o pellet de células de levedura em um mililitro de PBS estéril e fazer uma diluição de um a 100, pipetar 10 microlitros da diluição em um hemocitômetro e contar as células.

Calcule a concentração de células de levedura necessárias para uma multiplicidade de infecção de um a cinco. Adicionar o volume calculado de suspensão de células criptocócicas a um mililitro de meio de alimentação com o anticorpo monoclonal, 18 B sete, a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Incubar a suspensão celular à temperatura ambiente durante cinco minutos.

Em seguida, remova o meio de alimentação da placa de Petri de vidro e lave os macrófagos uma vez com PBS estéril. Em seguida, adicione 100 microlitros de opsonize cmin diretamente ao poço, seguido de incubação com a levedura por duas horas a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono. Após a co-incubação, verificou-se ao microscópio se os macrófagos internalizaram c eAs formas para serem consideradas células criptocócicas internalizadas devem ser claramente vistas dentro dos limites do macrófago, conforme indicado pela grande ponta da seta.

A ponta da seta menor indica um macrófago não infectado sem células fúngicas. Lave a placa de Petri três vezes com PBS estéril para remover toda e qualquer neoformana extracelular. Em seguida, adicione um a dois mililitros de meio de alimentação sem o anticorpo monoclonal para realizar esses experimentos.

Um microscópio equipado com uma câmara de incubação anexada que inclui a entrega de dióxido de carbono e uma unidade de aquecimento é necessário antes do experimento. Pré-aqueça a câmara de incubação por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius. Certifique-se de que a unidade de dióxido de carbono leia 5% no início do experimento.

Coloque a placa de Petri com fundo de vidro na tampa da plataforma do microscópio com um dióxido de carbono aceso e feche todas as portas para garantir que não haja fugas de calor usando a objetiva de 10 x com o microscópio em contraste de fase, concentre-se em um campo claro de macrófagos infectados configure o software do microscópio para tirar uma imagem a cada quatro minutos por um período de 24 horas. Após 24 horas, o experimento terá sido concluído e um total de 361 imagens terão sido coletadas. Exporte essas imagens como JPEGs com uma compactação de 5%.

Usando o software de imagem J, visualize as imagens como uma pilha visual a cinco quadros por segundo. O quadro inicial do filme mostra muitos macrófagos em todo o campo, alguns não infectados e outros com quantidades variadas de células criptocócicas. À medida que o filme avança, as células são todas mo e podem ser vistas se movendo pelo campo neste filme, é claro que as células criptocócicas estão dentro dos limites de um macrófago infectado.

O macrófago fica agitado e uma célula de levedura pode ser vista, mas dentro da zona FGA, as células criptocócicas são rapidamente expurgadas no ambiente circundante. Um segundo macrófago infectado sofre exocitose não lítica e mais células de levedura são liberadas no espaço extracelular. As células hospedeiras permanecem viáveis após a exocitose criptocócica, conforme indicado por sua capacidade de continuar se movendo.

Ocasionalmente, os macrófagos interagem de tal forma que facilita a transferência de células criptocócicas entre as células hospedeiras. As células de levedura não são expostas ao ambiente extracelular e as células hospedeiras permanecem viáveis. Neste filme, dois macrófagos infectados criam pontes célula a célula em duas ocasiões distintas para transportar células criptocócicas de um macrófago para outro.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar a microscopia de luz digital para visualizar macrófagos submetidos a exocitose não lítica e outras interações com patógenos hospedeiros.