Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela Aedes aegypti
30 de dezembro de 2014
O uso de dois métodos para estimar a expressão do gene nos principais apêndices gustativas de Aedes aegypti, identificamos o conjunto de genes putativamente subjacentes às respostas neuronais para compostos amargos e repulsivas, conforme determinado pelo exame eletrofisiológico.
O objetivo geral deste procedimento é observar as respostas dos neurônios gustativos em insetos e medir a expressão gênica em tecidos gustativos. Isso é feito registrando primeiro as respostas de cabelos gustativos específicos a vários gostos em diferentes concentrações. O segundo passo é dissecar cuidadosamente os tecidos gustativos.
Em seguida, separe as amostras por sexo e apêndice. Em seguida, isole o RNA total de cada amostra de tecido e crie preparações de CD NA para sequenciamento de próxima geração e QPCR. A etapa final é analisar os dados de expressão gênica e formar hipóteses, como a forma como os genes sensoriais de quimioterapia expressos medeiam respostas fisiológicas aos gostos dos insetos.
Em última análise, os registros eletrofisiológicos são usados para mostrar a faixa receptiva do sistema gustativo do inseto e o sequenciamento de RNA do tecido gustativo é usado para destacar os componentes genéticos mais importantes da recepção gustativa. Geralmente, os indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades devido ao pequeno tamanho da quimioterapia dos insetos. Apêndices sensoriais.
Seja dissecando ou registrando pequenos órgãos de insetos, a prática em pacientes é a chave para dominar essas técnicas. Para iniciar este procedimento, puxe um eletrodo de gravação de ponta fina em um extrator de pipeta com um capilar de vidro sob o microscópio de dissecação. Quebre cuidadosamente a ponta do eletrodo para que sua abertura seja larga o suficiente para envolver o centum-alvo, mas pequena o suficiente para evitar o contato com as estruturas vizinhas.
Em seguida, anestesie dois a quatro insetos adultos no freezer a menos 20 graus Celsius por 20 segundos. Depois disso, imobilize um dos insetos usando uma lamínula com pequenas tiras de fita celofane. Sob o microscópio.
Identificar a sensibilidade alvo pela sua morfologia e posição e orientar o animal de modo a permitir o livre acesso a ela a partir do ângulo de entrada do eléctrodo. Em seguida, insira um fio de tungstênio em seu tórax dorsal. Para servir como eletrodo de aterramento, encha o eletrodo de vidro da ponta com uma solução estimulante de interesse.
Retire as bolhas de ar enquanto mantém a ponta para baixo. Insira um fio de prata no eletrodo para servir como eletrodo de gravação e estimulação. Depois disso, conecte os eletrodos a um pré-amplificador, o que permite a redução do tempo de estabilização para captar a atividade neuronal.
O pré-amplificador é conectado a um computador equipado com software de gravação de pico para coletar, armazenar e analisar sinais elétricos. Agora estimule o centum com uma solução de controle para garantir sua funcionalidade. Conte os picos começando 200 milissegundos após o artefato de estímulo.
Para obter os resultados da resposta à dose. Expor o centum a concentrações crescentes do produto químico experimental e permitir intervalos mínimos de três minutos entre as estimulações para assegurar uma recuperação adequada. Neste procedimento, prepare um refrigerador raso com gelo seco.
Para os tubos de coleta de tecido, rotule os tubos de tampa de pressão sem RNA de 1,5 mililitro para a coleta de diferentes tipos de tecido. Mantenha os tubos fechados para evitar excesso de condensação. Em seguida, anestesiar 30 a 40 mosquitos no freezer de 20 graus Celsius negativos por 15 a 30 segundos.
Em seguida, transfira os mosquitos anestesiados para um estágio frio e classifique por sexo. Vire o lado dorsal dos insetos para baixo segurando suas asas, tomando cuidado para não danificar os apêndices gustativos. Sob um microscópio de dissecação, disseque o rótulo emparelhado Bella ou tarso de machos ou fêmeas, segurando suavemente o mosquito pro Bois logo proximal ao rótulo.
Bella com um par de pinças para expor o estilete interno e remover a etiqueta com o outro par de pinças. Em seguida, coloque o tecido no tubo de coleta a frio para o tecido do tarso. Segure suavemente a perna do mosquito na junção da tíbia e do primeiro segmento do tarso e remova o tarso.
Em seguida, coloque o tecido no tubo rotulado a frio. Gire os tubos de coleta por um minuto em uma centrífuga de zero grau Celsius a 9.000 vezes a gravidade para manter o tecido no fundo do tubo. Se a umidade se acumular nos tubos de coleta durante a dissecção, adicione 50 microlitros de reagente de triol frio para cobrir e proteger o tecido coletado.
Congele os tubos no rack de tubos de 1,5 mililitro contendo nitrogênio líquido. Depois disso, prepare os pilões livres de RNA bem ajustados, resfriando-os em gelo seco antes da ruptura do tecido. Em seguida, triture o tecido em pó fino e repita mais uma vez.
Traga o volume total de triol para um mililitro e resus. Suspenda o tecido fundamental por vórtice. Depois disso, adicione 200 microlitros de clorofórmio ao tecido moído e misture bem.
Após cinco minutos à temperatura ambiente, gire-o na centrífuga a quatro graus Celsius a 11.000 vezes a gravidade por 15 minutos. Adicione cuidadosamente a camada aquosa diretamente a uma coluna de filtro de DNA genômico. Em seguida, gire-o a 11.000 vezes a gravidade por cinco minutos.
Adicione um volume igual de RNAs livres de 70% de etanol ao fluxo e misture por pipetagem. Transfira o líquido para uma coluna de coleta de RNA e continue a extração de RNA. Depois disso, quantifique e avalie a pureza do RNA total em um espectrofotômetro de precisão e prossiga com qualquer método de sequenciamento de RNA padrão.
Os registros de traços de potenciais de ação da illa gustativa E GTI do auxiliar demonstram a eficácia da estimulação direta com a gama de produtos químicos. Essa técnica pode ser usada para quantificar as respostas a qualquer produto químico estimulante, contando os picos de uma determinada amplitude e duração em um intervalo de tempo razoável de menos de 500 milissegundos. Esses três picos correspondem a três subtipos de neurônios sensoriais com diferentes sensibilidades.
As réplicas biológicas para conjuntos de dados de RNA-Seq podem ser limitadas pelo custo ou dificuldade de coleta de tecido. Q-R-T-P-C-R oferece a capacidade de validar pequenos subconjuntos de expressão gênica total a um custo menor e requer menos fonte. O RNA mostrado no painel esquerdo lado a lado é uma comparação entre a expressão relativa determinada pelo RN Aeq e a expressão relativa determinada pelo Q-R-T-P-C-R.
Esses dois métodos dependem de diferentes químicas para a estimativa da abundância de genes. As funções de equivalência estatística exibidas graficamente no painel direito demonstram os limites de certeza em cada caso. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar o tecido do inseto para isolamento de RNA e registrar sinais neurais dos pêlos gustativos de insetos vivos.
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Visão Geral
Este estudo investiga as respostas de neurônios gustativos em Aedes aegypti a diversos sabores e mede a expressão gênica em tecidos gustativos. Ao empregar técnicas eletrofisiológicas, a pesquisa identifica genes associados às respostas neuronais a compostos amargos e repelentes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Entomologia
- Expressão Gênica
Antecedentes
- O sistema gustativo em insetos desempenha um papel crucial na percepção do sabor.
- Aedes aegypti serve como organismo modelo para o estudo de respostas sensoriais.
- A compreensão da expressão gênica pode revelar mecanismos da percepção do sabor.
- Os métodos eletrofisiológicos são essenciais para medir a atividade neuronal.
Objetivo do Estudo
- Observar as respostas dos neurônios gustativos a diferentes compostos gustativos.
- Medir a expressão gênica em tecidos gustativos de Aedes aegypti.
- Formular hipóteses sobre como os genes quimiossensoriais influenciam as respostas fisiológicas aos sabores.
Métodos Utilizados
- Registrar as respostas dos pelos gustativos a diferentes sabores em várias concentrações.
- Dissecar tecidos gustativos e separar as amostras por sexo e apêndice.
- Isolar o RNA total de cada amostra de tecido.
- Preparar cDNA para sequenciamento de nova geração e QPCR.
Resultados Principais
- Identificação de genes relacionados às respostas neuronais a compostos amargos.
- Informações sobre a base genética da percepção do sabor em Aedes aegypti.
- A análise de dados apoia hipóteses sobre as funções de genes quimiossensoriais.
- Os resultados eletrofisiológicos correlacionam-se com os achados de expressão gênica.
Conclusões
- O estudo aprimora a compreensão da função dos neurônios gustativos em insetos.
- Os achados contribuem para o conhecimento mais amplo da biologia sensorial.
- Pesquisas futuras podem explorar aplicações em estratégias de controle de pragas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a base molecular da percepção quimiossensorial em vetores de doenças, como Aedes aegypti, permite a validação de alvos para o desenvolvimento de novos repelentes. O perfil eletrofisiológico e transcriptômico de tecidos gustativos fornece uma redução de riscos mecanicista ao associar a expressão gênica a respostas comportamentais, como a interrupção da procura pelo hospedeiro. Essa abordagem integrada reforça a confiança preditiva na triagem de compostos que interferem nas vias sensoriais do mosquito, orientando estratégias precoces de controle de vetores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Identifica neurônios receptores gustativos responsivos ao DEET e quinina, permitindo a investigação de vias sensoriais amargas em vetores de doenças.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura fisiológica validada para triagem de compostos que modulam os neurônios quimiossensoriais de mosquitos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: O sequenciamento de RNA de tecidos labelares e tarsos revela perfis de expressão gênica de quimiorrecepção, apoiando o desenvolvimento de ensaios alinhados a biomarcadores.
- Valor Operacional: A validação por qRT-PCR garante reprodutibilidade e precisão quantitativa para comparações de expressão gênica entre plataformas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a expressão de genes quimiossensoriais à percepção de repelentes, permitindo a triagem baseada em alvos para a interrupção do comportamento de busca do hospedeiro.
- Valor Operacional: A coleta de amostras específica por tecido (tarsos pro-, meso- e metatorácicos) apoia modelos escalonáveis de triagem estratificados por sexo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método conecta a descoberta precoce de alvos por meio de triagem fenotípica à validação pré-clínica, vinculando a atividade neuronal a alvos moleculares em tecidos quimiossensoriais.
- Biologia da Descoberta: Os registros eletrofisiológicos permitem testar hipóteses sobre os efeitos de compostos nas taxas de disparo e na sensibilidade dos neurônios gustativos.
- Triagem: Os resultados de RNA-seq e qRT-PCR fornecem leituras padronizadas e quantitativas da expressão gênica para avaliação do engajamento do alvo.
- Análise: A contagem de potenciais de ação e os testes estatísticos de equivalência permitem comparar as respostas neuronais e a expressão gênica entre diferentes condições e métodos.
- Pesquisa Translacional: A validação de genes quimiossensoriais apoia o alinhamento de biomarcadores para prever a eficácia de repelentes in vivo.
- Reutilização Corporativa: O fluxo de trabalho combinado de eletrofisiologia e transcriptômica pode ser reutilizado em diferentes espécies de insetos e bibliotecas químicas para reduzir riscos em alvos de controle de vetores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicista de alvos repelentes por meio da correlação direta entre atividade neuronal e expressão gênica.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de dissecação de tecidos, isolamento de RNA e eletrofisiologia garantem reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Permite decisões precoces de avanço ou interrupção de candidatos a repelentes ao validar o engajamento do alvo em tecidos quimiossensoriais relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que modulam vias específicas de receptores gustativos associadas ao comportamento de busca do hospedeiro.
Considerações sobre a Implementação
- É necessária experiência em eletrofisiologia de insetos e dissecação de tecidos sob microscopia para obter gravações confiáveis de cerdas gustativas.
- É necessário ter acesso a equipamentos livres de RNase, centrífugas e espectrofotometria para isolamento de RNA de alta qualidade a partir de pequenas amostras de tecido.
- A padronização entre equipes exige sexagem consistente dos tecidos, separação de apêndices e manuseio em cadeia fria para prevenir a degradação do RNA.
- A adaptação a outras espécies de mosquitos ou tecidos pode exigir otimização da colocação dos eletrodos e das técnicas de dissecação devido à variação morfológica.
- Os limites no número de replicatas biológicas em RNA-seq, decorrentes da escassez de tecido, podem ser atenuados mediante validação por qRT-PCR de alvos principais, conforme demonstrado no estudo.
