Name: Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a isolar variantes potencializadas de Hsp104 usando modelos de proteinopatia em levedura. Este método permite selecionar variantes que suprimem a toxicidade de proteínas associadas a distúrbios de misfolding.

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Agradecemos a Sue Lindquist, Aaron Gitler e Martin Duennwald por gentilmente compartilharem os reagentes. Nossos estudos foram apoiados por: uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (MEJ); Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH DP2OD002177, o NIH concede R21NS067354, R21HD074510 e R01GM099836, um Prêmio de Pesquisa da Associação de Distrofia Muscular (MDA277268), Centro Packard para Pesquisa de ELA na Universidade Johns Hopkins, Target ALS e um Prêmio Novo Acadêmico em Envelhecimento da Fundação Médica Ellison (JS).

1. Biblioteca Generation <ol><li> Para construir bibliotecas de Hsp104 usando PCR propensa a erros de domínio específico, primeiro amplificar o domínio de interesse com um erro DNA polimerase propensas 20. </li><li> Purifica-se o produto de PCR por extracção de gel. </li><li> Realizar uma etapa de extensão megainiciador utilizando um protocolo padrão de mutagénese dirigida ao local: combinar 50 ng de plasmídeo, modelo, 250 megainiciador ng, 200 uM de dNTPs, e de alta fidelidade da polimerase de ADN em tampão de PCR, e diluir até 50 mL de volume total, com água de grau de PCR 20 . Execute um programa de PCR padrão. NOTA: Os primers específicos utilizados irá variar com base na região particular do gene que está a ser amplificado. <ol><li> Após a PCR, digerir ADN molde parental com 1 ul da enzima de restrição Dpnl durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Transformar a biblioteca por eletroporação ou outros meios em ultracompetent E. coli e purificá-lo por miniprep. NOTA: geração Bibliotecavaria substancialmente com base nos objetivos de um determinado experimento. Hsp104 é uma proteína muito grande, por isso é impraticável para embaralhar todo o gene, que é por isso que nós utilizamos erro específico do domínio propenso PCR. Além disso, a estrutura de Hsp104 permanece pouco compreendido, tornando o desenho de bibliotecas dirigidas 21 desafiantes. As bibliotecas podem ser construídas utilizando abordagens dirigidas ou aleatórias para mutagénese, com a única restrição que o plasmídeo de esqueleto modelo deve conter o gene URA3 para permitir 5-FOA contra-selecção em meios de dextrose. </li></ol> 2. Transformação da Biblioteca Hsp104 <ol><li> Integrar o substrato associado à doença em W303aΔ Hsp104 levedura usando um acetato de lítio padrão / PEG protocolo de transformação 22. Selecione colónias individuais e analisá-los em termos de toxicidade para isolar uma cepa com alta toxicidade da doença associada substrato 23. NOTA: Use uma tensão integrado e isolate uma única colônia de garantir a igualdade de expressão em todas as células. Clonar o substrato de doença num plasmídeo que permite a integração do gene em qualquer outro marcador de uracilo (usamos histidina) e a biblioteca de Hsp104 no plasmídeo pAG416GAL (marcador uracilo) 24. Para permitir o 5-FOA counterselection, assegurar que a biblioteca é expressa a partir de um plasmídeo com a marca de uracilo. Outras estirpes de levedura também podem ser empregues. Temos notado um fenótipo supressão toxicidade semelhante usando W303a e BY4741 cepas de leveduras em ambos WT e Δ Hsp104 fundos (MEJ e JS, observações não publicadas). </li><li> Transformar a biblioteca em Hsp104 esta estirpe usando o mesmo acetato de lítio / PEG protocolo de transformação 22. Dimensionar-se a transformação de forma adequada para manter o espaço de sequência da biblioteca e para preservar o tamanho da biblioteca previsto. </li><li> Placa da mistura de transformação para noninducing, placas seletivas (por exemplo SD-His-Ura) usando placas suficientes paraassegurar o crescimento de um grande número de colónias. Use grandes placas de Petri (150 mm) para minimizar o número de placas necessárias. Recuperando transformantes utilizando placas permite eficiência de transformação para ser avaliado. </li><li> Transforme Hsp104 WT e controles negativos vetor em paralelo. </li></ol> 3. Triagem para Supressão de Proteotoxicity <ol><li> Lave as colônias fora as placas usando rafinose complementada media de abandono (por exemplo SRaff-His-URA). Usar uma pipeta serológica estéril e aplicadores de madeira para soltar as colónias das placas. Transferir as lavagens líquidos para um tubo cónico de 50 ml e cuidadosamente vórtice para separar quaisquer aglomerações de células. Diluir a uma cultura um pouco nublado, OD 600 ~ 0,025. NOTA: Aqui rafinose serve para aliviar as células de repressão mediada por glicose de indução, priming assim que as células de indução mediada por galactose. </li><li> Incubar a cultura diluído durante a noite em meio de abandono rafinose com agitação a 30 ºC. Crescer a Hsp104 WT e controle de vetores em paralelo. </li><li> Na manhã seguinte, chapear uma gama de concentrações de galactose Onto individual (por exemplo SGAL-His-Ura) placas (1 ul a 2 ml da cultura concentradas em 400 ul de volume total). Chapeamento de uma ampla gama de concentrações vai garantir que uma placa vai ter colónias isoladas. A concentração real necessário depende da toxicidade do substrato doença de interesse. </li><li> Normalizar o vector e culturas Hsp104 WT para o OD 600 da biblioteca e placa volumes iguais para comparar o crescimento da biblioteca em relação aos controlos. </li><li> Para avaliar a seleção rigor, placa da biblioteca em glicose (reprimir) mídia. Incubar as placas durante 2-3 dias a 30 ° C, até que colónias aparecem (Figura 2). Avaliar as colônias resultantes e comparar com os controles. NOTA: Muitas vezes pequenos e grandes colônias são obtidos, mas nenhuma correlação entre o tamanho da colônia e agirivity é observado. Tela estes potenciais sucessos usando uma técnica de contra-selecção 5-FOA (Passo 4) para minimizar os falsos positivos transitados para sequenciação. </li></ol> 4. 5-FOA Counterselection e Spotting para eliminar falsos positivos <ol><li> Streak fora colónias isoladas em duplicata em suporte de casal e solteiro abandono (por exemplo SD-His-Ura e-Seus SD placas) e crescer durante a noite a 30 ºC. Repita a operação com controle de vetores e Hsp104 WT. Plaqueamento em SD-His antes da 5-FOA aumenta a eficiência do passo 5-FOA, aumentando a probabilidade de que as células terão perdido o plasmídeo Hsp104 quando são semeadas em 5-FOA. </li><li> Para evitar que as placas de secar, enrole a placas em parafilm Seus-SD-Ura e armazenar a 4 ºC durante a realização da tela de 5 FOA. Estas placas venham a ser utilizados para a sequenciação. </li><li> Streak as colônias do SD-Suas placas de colónias isoladas em placas 5-FOA (YPD media + 1g / L 5-FOA) e incubar durante 1-2 dias a 30 &amp;# 186; C até as colónias individuais aparecem. Aqui, 5-FOA é convertido num produto tóxico (5-fluorodesoxiuridina) em células que contêm o gene URA3. Assim, destacando as células portadoras do plasmídeo Hsp104 morrerá. </li><li> Streak as colónias individuais das placas 5-FOA em duplicar em SD-Ura e-Seus SD placas. Teste 3 colónias para cada batida para aumentar a probabilidade de que pelo menos uma colónia de cada um batido terá perdido o plasmídeo de Hsp104. Incubar durante 1-2 dias a 30 ° C. As colónias que perderam o plasmídeo Hsp104 vai crescer em SD-His placas mas não placas de SD-Ura. </li><li> Crescer as tensões que perderam os plasmídeos Hsp104 para detectar ensaios. Crescer as tensões à saturação em rafinose mídia abandono (por exemplo SRaff-His) em 96 Deepwell 2 placas ml durante a noite a 30 ºC com agitação. Certifique-se de incluir as estirpes de controlo 5-FOA tratados. </li><li> Prepare placas para detectar ensaio. Usando uma pipeta de canais múltiplos, alíquota de 200 ul rafinose meios de abandono (por exemplo SRaff-His) porpoço de uma placa de 96 poços, reservando colunas 1 e 7 para as culturas puras. Alíquota de 250 mL de cada uma das 16 culturas saturadas em colunas 1 e 7 da placa. </li><li> Serialmente dilua as culturas de 5 vezes em cada coluna da placa, misturar cuidadosamente com uma pipeta de canais múltiplos. Retirar 50 mL da cultura diluída a partir de colunas 6 e 12 para garantir o volume final de cada poço é 200 ul. Isto é essencial para garantir uma identificação. </li><li> Usando uma ferramenta replicador de 96 parafuso (Frogger), identificar as culturas em duplicado para-Seus SD e SGAL-Seus pratos. Incubar as placas a 30 ºC durante 2-3 dias. </li><li> Selecione para sequenciar cepas que apresentam toxicidade nas SGAL-Suas placas semelhantes aos dos controles. Descarte cepas como falsos positivos que não são tão tóxico como os controles. 5-FOA é também muitas vezes tóxico por si próprio, então descartar cepas que apresentam um defeito de crescimento em-seu SD ou placas que exibem substancialmente maior toxicidade do que o substrato doença sozinho ( <strong&gt; A Figura 3). </li></ol> 5. O seqüenciamento do Hsp104 Variantes por Colony PCR <ol><li> Raspe ~ 10 ul de levedura a partir das placas de SD-His-Ura em NaOH 3 ul 20 mM em tubos de PCR de tira e lisar as células por congelação-descongelação. Colocar os tubos em um congelador tira -80 ºC durante 10 min ou em azoto líquido, depois incubar a 99 ° C num termociclador durante 10 min. Dilui-se as estirpes para 100 ul com água de grau de PCR. </li><li> Prepare reações de PCR: 5 jul modelo PCR, 0,5 ul 100? M de cada iniciador, 0,5 mL de 10 mM dNTPs, 0,25 mL DNA polimerase em tampão PCR, e fazer até 25 mL volume total com PCR água grau. Design Os iniciadores para amplificar a região mais ao acaso, aproximadamente 100 pb em cada extremidade. Minimizar o tamanho da região amplificada para aumentar a probabilidade de uma amplificação bem sucedida. Execute um programa de PCR padrão. </li><li> Analisar amostras por electroforese em gel de agarose para confirmar a amplificação de um produto de PCR do siz adequadoe. Repita PCR se nenhum produto está presente. NOTA: A falha PCR é geralmente devido ao excesso de levedura a ser utilizado na etapa 5.1. </li><li> Preparar amostras para seqüenciamento de DNA. Remover os iniciadores de PCR quer através de purificação de PCR ou utilizando um reagente de limpeza do produto de PCR, tais como a Exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão enzima (ExoSAP-TI) para degradar o ADN de cadeia simples. Este reagente enzimático degrada primers não incorporados e dNTPs, permitindo maior rendimento. </li><li> Sequenciar os produtos de PCR. Certifique-se de analisar cuidadosamente cromatogramas de sequenciamento de mutações. As mutações podem ser observadas como uma mistura de dois nucleótidos em um dado local (Figura 4), ​​como de levedura muitas vezes abrigam os plasmídeos múltiplos. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui apresentamos nossa abordagem para isolar variantes Hsp104 potencializadas que suprimem a toxicidade de substratos associados à doença, utilizando modelos de levedura proteinopathy. Utilizando esta abordagem, bibliotecas grandes de variantes pode ser rastreada em elevado rendimento, com a única limitação é o número de variantes que passam o ecrã secundário 5-FOA. Ao realizar estes passos em formato de 96 poços, que rotineiramente tela até 200 batidas de cada vez no passo 5-FOA ao longo de 1-2 semanas. O número de ac...

Levedura proteinopathy modelos têm sido desenvolvidos para distúrbios-misfolding proteína incluindo a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a doença de Parkinson (DP) 1-3. Expressão das proteínas TDP-43 e FUS, que misfold em pacientes de ELA, são tóxicos e mislocalize para formar agregados citoplasmáticos em levedura 1,2. Do mesmo modo, a expressão de α-sinucleína (α-syn), que está implicado na doença de Parkinson, é tóxico e mislocalizes para formar agregados citoplasmáticos em 3 de levedura. Esses recursos recapitular fenótipos em pacientes com esses transtornos 4,5. Assim, os modelos de levedura fornecer uma plataforma útil para o rastreio de proteínas ou moléculas pequenas que impedem ou invertem estes fenótipos 2,6-13. Estamos interessados ​​no desenvolvimento de proteínas que são capazes de inverter a agregação e toxicidade devido a TDP-43, FUS, e α-syn. Nós nos concentramos em Hsp104, um AAA + proteína de levedura que é o único capaz de desagregar proteínas tanto fragregados amorfos om e amilóide em leveduras, ainda não tem homólogo humano 14,15. Hsp104 é afinado para desagregar prions levedura endógenos e tem apenas capacidade limitada para desagregar substratos implicados em doenças neurodegenerativas humanas, que nunca encontra ordinariamente 16,17. Assim, nosso objetivo é projetar versões aprimoradas de Hsp104 que são capazes de desagregar eficazmente estes substratos humanos. Para isso, construímos grandes bibliotecas de Hsp104 variantes utilizando PCR propenso a erros; essas bibliotecas podem ser rastreados usando os modelos de levedura proteinopathy 17. Adotamos uma abordagem orientada-domínio para construção e pesquisa de bibliotecas, como Hsp104 é muito grande 17. Nós centrou-se inicialmente no domínio médio (DM) de Hsp104 17, embora as abordagens semelhantes podem ser empregues para o rastreio de outros domínios. Esses modelos permitem o rastreio de actividade disaggregase directamente, ao contrário de técnicas alternativas, tais como exposição de superfície, que é restoricted usar para monitorar a ligação 18. O protocolo baseia-se em dois passos de triagem (Figura 1). Em primeiro lugar, as variantes de Hsp104 que suprimem a toxicidade do substrato doença em levedura são seleccionados. Para fazê-lo, a Hsp104 variantes e associado à doença substrato são co-transformados em levedura Δ Hsp104. Nós empregamos Δ Hsp104 levedura para explorar Hsp104 seqüência espaço na ausência de tipo selvagem (WT) Hsp104 17. Importante, supressão de Hsp104 não afecta α-syn, FUS, ou TDP-43 toxicidade em levedura, e expressão de Hsp104 WT fornece salvamento mínima 1,13,17. A levedura é então plaqueadas em meios de indução para induzir a expressão de ambas as proteínas. Levedura abrigar variantes Hsp104 que suprimem a toxicidade do associado à doença de crescimento substrato conferem da colônia. Estas variantes são seleccionados para posterior análise, mantendo ao mesmo tempo as colónias variantes que não suprimem a toxicidade da matriz. No entanto,falsos positivos são um problema substancial na tela. Expressão de TDP-43, FUS, e α-syn são altamente tóxicos, o que cria uma forte pressão selectiva para o aparecimento de supressores genéticas espontâneas de toxicidade relacionada com a variante Hsp104 ser expresso. Assim, temos utilizado uma tela secundária que também é relativamente alto rendimento para eliminar esses supressores de toxicidade inespecíficos 17. Nesta tela secundária, leveduras selecionadas são tratados com 5-Fluorootic ácido (5-FOA) para combater a seleção para o plasmídeo Hsp104 19. As estirpes são então avaliadas para substrato (TDP-43, FUS, ou α-sin) toxicidade via ensaio de mancha para assegurar que a toxicidade do substrato é restaurada após a perda do plasmídeo Hsp104. Assim, de levedura, em que a toxicidade é restaurada neste ecrã secundário originalmente apresentado presumivelmente supressão de toxicidade devido à presença da variante da Hsp104. Estas leveduras são designados como &#39;hits&#39; e do plasmídeo Hsp104 deve, então, serrecuperados e sequenciados para identificar as mutações no gene de Hsp104 17 (Figura 1). Qualquer resultado deve ser reconfirmada em seguida, através da construção da mutação, independentemente, utilizando mutagénese dirigida ao local e, em seguida, para a supressão de novo teste de toxicidade. As potenciais aplicações para este protocolo são amplas. Usando estes métodos, bibliotecas de qualquer tipo de proteína pode ser rastreada para as variantes que suprimem a toxicidade da proteína de qualquer substrato que é tóxico em levedura.

<table><tbody><tr><td>Kit de mutagênese de domínio GeneMorphII EZClone</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 150 mm</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootic Acid</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Placas</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 ferramenta replicadora em negrito</td><td>V& P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolando potencializado hsp104 variantes usando levedura proteinopathy models

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Muitos distúrbios de desdobramento de proteínas podem ser modelados na levedura de brotamento Saccharomyces cerevisiae. Proteínas como TDP-43 e FUS, implicadas na esclerose lateral amiotrófica, e α-sinucleína, implicadas na doença de Parkinson, são tóxicas e formam agregados citoplasmáticos em leveduras. Essas características recapitulam patologias proteicas observadas em pacientes com esses distúrbios. Assim, as leveduras são uma plataforma ideal para isolar supressores de toxicidade de bibliotecas de variantes de proteínas. Estamos interessados em aplicar desagregações de proteínas para eliminar conformadores de proteínas tóxicas mal dobradas. Especificamente, estamos projetando Hsp104, uma proteína AAA + hexamérica de levedura que é capaz de solubilizar agregados desordenados e amilóide e retornar as proteínas às suas conformações nativas. Embora a Hsp104 seja altamente conservada em eucariotos e eubactérias, ela não tem homólogo metazoário conhecido. Hsp104 tem apenas capacidade limitada de eliminar agregados desordenados e fibras amilóides implicadas em doenças humanas. Assim, pretendemos projetar variantes de Hsp104 para reverter o desdobramento de proteínas implicado em distúrbios neurodegenerativos. Desenvolvemos métodos para rastrear grandes bibliotecas de variantes de Hsp104 para supressão de proteotoxicidade em leveduras. Como as leveduras são propensas à supressão espontânea e inespecífica da toxicidade, um processo de triagem em duas etapas foi desenvolvido para eliminar falsos positivos. Usando esses métodos, identificamos uma série de variantes potencializadas de Hsp104 que suprimem potentemente a toxicidade e agregação de TDP-43, FUS e α-sinucleína. Aqui, descrevemos este protocolo otimizado, que pode ser adaptado para bibliotecas de tela construídas usando qualquer estrutura de proteína para supressão da toxicidade de qualquer proteína tóxica em leveduras.

Construímos uma biblioteca de variantes de Hsp104 randomizados no domínio médio e rastreados-lo para a supressão de TDP-43 toxicidade. A biblioteca foi transformada e plaqueada em placas de glicose e galactose (Figura 2) para avaliar a severidade da tela. Colónias individuais foram seleccionadas e as estirpes foram contra-seleccionadas utilizando 5-FOA para eliminar o plasmídeo Hsp104. Estas estirpes foram então avaliadas para confirmar que a toxicidade foi devido a TDP-43 sozinho, sem as variantes Hsp1...

Os modelos de proteinopatia de levedura são ferramentas valiosas para avaliar a toxicidade e a agregação de proteínas implicadas na doença. Aqui, apresentamos métodos para triagem de bibliotecas de variantes de Hsp104 para supressores de toxicidade. Este protocolo pode ser adaptado para rastrear qualquer biblioteca de proteínas em busca de supressores de toxicidade de qualquer proteína tóxica em leveduras.

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

O objetivo do experimento a seguir é rastrear bibliotecas HS P 1 0 4 para a seleção de variantes que suprimem a toxicidade das proteínas associadas a distúrbios de dobramento incorreto de proteínas. Isso é conseguido cotransformando as bibliotecas de variantes HSP 1 0 4 com um substrato associado à doença em levedura e coex expressando as duas proteínas como uma segunda etapa. A levedura selecionada é tratada com cinco ácidos fluorúticos ou cinco FOA para combater a seleção do plasmídeo HSP 1 0 4.Em seguida, os acertos são sequenciados amplificando a região mutagênica por PCR de colônia ou identificação das mutações no gene HSP 1 0 4. Em última análise, a supressão da toxicidade do substrato associado à doença pode ser avaliada para identificar as variantes HS P 1 0 4 que são mais promissoras para caracterização posterior. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como seleções baseadas em ligação, é que esta técnica permite a seleção de variantes que suprimem a toxicidade do substrato associado à doença.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de dobramento de proteínas, identificando as proteínas que podem reverter o dobramento incorreto de proteínas. Embora este método possa fornecer informações sobre a potenciação do HS P 1 0 4, ele também pode ser aplicado à triagem de bibliotecas de qualquer proteína para a supressão da toxicidade de qualquer substrato tóxico em leveduras. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque muitas colônias podem precisar ser rastreadas para encontrar acertos válidos Para rastrear a supressão da toxicidade da protea, comece lavando as colônias HSP 1 0 4 das placas com meio de dropout suplementado com rafinose, uma pipeta sorológica e madeira estéril e os aplicadores transferem as lavagens líquidas para um tubo cônico de 50 mililitros e vórtice as colônias completamente para separar quaisquer aglomerados de células.Em seguida, dilua a suspensão celular para uma cultura ligeiramente turva e cultive as células durante a noite em meio de gota de rafinose com agitação a 30 graus Celsius. Aumente o tipo selvagem HSP 1 0 4 e os controles vetoriais em paralelo neste momento também. Na placa da manhã seguinte, uma faixa de concentrações de células em placas individuais de galactose para gerar pelo menos uma placa por grupo com colônias únicas.Normalize o vetor e as culturas do tipo de mundo HSP 1 0 4 para o OD 600 da biblioteca e da placa. Volumes iguais dessas células às concentrações de cepas experimentais para comparar o crescimento da biblioteca em relação aos controles para avaliar a seleção. Rigor também coloca a biblioteca em meios de repressão de glicose e, em seguida, incuba todas as placas por dois a três dias a 30 graus Celsius até que as colônias pareçam usar cinco FOA para seleção das células, que não mantêm mais plasmídeos que expressam HSP 1 0 4 em seguida, risque as colônias únicas de cada cepa em duplicata em placas de mídia de dropout duplo e simples por incubação noturna a 30 graus Celsius.Essas placas serão usadas para sequenciamento posterior para evitar que as placas sequem. Enrole as placas SD hiss Euro em filme para e instale-as a quatro graus Celsius enquanto executa a tela de cinco FOA. Em seguida, risque as colônias das placas de chiado SD para colônias únicas em cinco placas FOA para uma incubação de um a dois dias a 30 graus Celsius até que as colônias únicas apareçam. Próximo.De cada placa de cinco FOA, selecione e risque. Três colônias sobreviventes em um SD Euro e um SD em sua placa por colônia sobrevivente após outro um a dois dias de incubação a 30 graus Celsius. As colônias que perderam o plasmídeo HSP 1 0 4 crescerão em placas de chiado SD, mas não em placas SD Euro.Aumente essas cepas até a saturação em meios de abandono de rafinose em 96. Poço profundo de dois mililitros durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Em seguida, para eliminar quaisquer falsos positivos, faça um ensaio de spotting.Perto do final da incubação está uma pipeta multicanal para alíquota de 200 microlitros de meios de eliminação de rafinose por poço para uma nova placa de 96 poços, reservando as colunas um e sete para as culturas puras. Em seguida, alíquota de 250 microlitros de cada uma das 16 culturas saturadas nas colunas um e sete da placa e diluir em série as culturas cinco vezes em cada coluna da placa, misturando bem com a pipeta multicanal. Em seguida, para garantir uma mancha uniforme, remova 50 microlitros da cultura diluída das colunas seis e 12 para garantir que o volume final de cada poço seja de 200 microlitros.Em seguida, use uma ferramenta replicadora de 96 volts para detectar as culturas em duplicata nas placas de chiado SD e escalonamento. Após uma incubação de dois a três dias a 30 graus Celsius, selecione as cepas de sequenciamento que exibem toxicidade nas placas de escalonamento. Semelhante ao dos controles, cepas falsos positivas, que não são tão tóxicas quanto os controles, podem ser descartadas.Descarte também as cepas que apresentam um defeito de crescimento no sd. Suas placas ou que exibem toxicidade substancialmente maior do que o substrato da doença sozinho. Para sequenciar as variantes HSP 1 0 4 por PCR de colônia, primeiro raspe aproximadamente 10 microlitros de levedura das placas SD sibilantes Euro em três microlitros de 20 mili hidróxido de sódio em tubos removidos por PCR para colocar as células por congelamento e descongelamento.Primeiro coloque as tiras em um freezer de 80 graus Celsius negativos. Após 10 minutos no freezer, incube os tubos a 99 graus Celsius no termociclador por 10 minutos e, em seguida, dilua as cepas para 100 microlitros com água de grau PCR usando uma alta concentração de primer. Em seguida, execute um programa de PCR padrão nas amostras e, em seguida, analise as amostras por eletroforese em gel para confirmar a amplificação de um produto de PCR do tamanho apropriado.Finalmente, sequencie os produtos de PCR tendo o cuidado de analisar minuciosamente os cromatogramas de sequenciamento para mutações. As mutações podem ser observadas como uma mistura de dois nucleotídeos em um determinado local, pois as leveduras geralmente abrigam vários plasmídeos. Neste experimento representativo, após a construção de uma biblioteca de variantes de HSP 1 0 4 randomizadas no domínio médio, a biblioteca foi transformada em levedura contendo um plasmídeo para a expressão de TDP 43 induzível por galactose.Os transformantes foram então recuperados e plaqueados em placas de glicose e galactose para avaliar o rigor da tela. Após cinco ensaios de detecção de tratamento FOA de um subconjunto das variantes selecionadas na triagem inicial. Indicou que das quatro colônias selecionadas, duas apresentaram supressão de toxicidade HSP 1 0 4, mediada por TDP 43.Um era um falso positivo e o outro exibia toxicidade aumentada. Após o tratamento com cinco FOA, os dois verdadeiros acertos foram sequenciados por PCR de colônia para identificar as mutações de domínio médio. Essas mutações HS P 1 0 4 podem então ser feitas no plasmídeo HSP 1 0 4 parental por mutagênese dirigida ao local para confirmar sua supressão de toxicidade Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para rastrear até 200 acertos por vez nos cinco FO, uma etapa ao longo de uma a duas semanas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante analisar cuidadosamente os resultados do sequenciamento, pois as misturas de plasmídeos são frequentemente obtidas após este procedimento. Outros métodos, como a microscopia de fluorescência, podem ser realizados para ajudar a responder a perguntas adicionais, como: como as variantes HSP 1 0 4 afetam a agregação do substrato associado à doença? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear bibliotecas de variantes HSP 1 0 4 para a seleção de supressores de toxicidade.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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