Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models
11 de novembro de 2014
Os modelos de proteinopatia de levedura são ferramentas valiosas para avaliar a toxicidade e a agregação de proteínas implicadas na doença. Aqui, apresentamos métodos para triagem de bibliotecas de variantes de Hsp104 para supressores de toxicidade. Este protocolo pode ser adaptado para rastrear qualquer biblioteca de proteínas em busca de supressores de toxicidade de qualquer proteína tóxica em leveduras.
O objetivo do experimento a seguir é rastrear bibliotecas HS P 1 0 4 para a seleção de variantes que suprimem a toxicidade das proteínas associadas a distúrbios de dobramento incorreto de proteínas. Isso é conseguido cotransformando as bibliotecas de variantes HSP 1 0 4 com um substrato associado à doença em levedura e coex expressando as duas proteínas como uma segunda etapa. A levedura selecionada é tratada com cinco ácidos fluorúticos ou cinco FOA para combater a seleção do plasmídeo HSP 1 0 4.
Em seguida, os acertos são sequenciados amplificando a região mutagênica por PCR de colônia ou identificação das mutações no gene HSP 1 0 4. Em última análise, a supressão da toxicidade do substrato associado à doença pode ser avaliada para identificar as variantes HS P 1 0 4 que são mais promissoras para caracterização posterior. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como seleções baseadas em ligação, é que esta técnica permite a seleção de variantes que suprimem a toxicidade do substrato associado à doença.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de dobramento de proteínas, identificando as proteínas que podem reverter o dobramento incorreto de proteínas. Embora este método possa fornecer informações sobre a potenciação do HS P 1 0 4, ele também pode ser aplicado à triagem de bibliotecas de qualquer proteína para a supressão da toxicidade de qualquer substrato tóxico em leveduras. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque muitas colônias podem precisar ser rastreadas para encontrar acertos válidos Para rastrear a supressão da toxicidade da protea, comece lavando as colônias HSP 1 0 4 das placas com meio de dropout suplementado com rafinose, uma pipeta sorológica e madeira estéril e os aplicadores transferem as lavagens líquidas para um tubo cônico de 50 mililitros e vórtice as colônias completamente para separar quaisquer aglomerados de células.
Em seguida, dilua a suspensão celular para uma cultura ligeiramente turva e cultive as células durante a noite em meio de gota de rafinose com agitação a 30 graus Celsius. Aumente o tipo selvagem HSP 1 0 4 e os controles vetoriais em paralelo neste momento também. Na placa da manhã seguinte, uma faixa de concentrações de células em placas individuais de galactose para gerar pelo menos uma placa por grupo com colônias únicas.
Normalize o vetor e as culturas do tipo de mundo HSP 1 0 4 para o OD 600 da biblioteca e da placa. Volumes iguais dessas células às concentrações de cepas experimentais para comparar o crescimento da biblioteca em relação aos controles para avaliar a seleção. Rigor também coloca a biblioteca em meios de repressão de glicose e, em seguida, incuba todas as placas por dois a três dias a 30 graus Celsius até que as colônias pareçam usar cinco FOA para seleção das células, que não mantêm mais plasmídeos que expressam HSP 1 0 4 em seguida, risque as colônias únicas de cada cepa em duplicata em placas de mídia de dropout duplo e simples por incubação noturna a 30 graus Celsius.
Essas placas serão usadas para sequenciamento posterior para evitar que as placas sequem. Enrole as placas SD hiss Euro em filme para e instale-as a quatro graus Celsius enquanto executa a tela de cinco FOA. Em seguida, risque as colônias das placas de chiado SD para colônias únicas em cinco placas FOA para uma incubação de um a dois dias a 30 graus Celsius até que as colônias únicas apareçam. Próximo.
De cada placa de cinco FOA, selecione e risque. Três colônias sobreviventes em um SD Euro e um SD em sua placa por colônia sobrevivente após outro um a dois dias de incubação a 30 graus Celsius. As colônias que perderam o plasmídeo HSP 1 0 4 crescerão em placas de chiado SD, mas não em placas SD Euro.
Aumente essas cepas até a saturação em meios de abandono de rafinose em 96. Poço profundo de dois mililitros durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Em seguida, para eliminar quaisquer falsos positivos, faça um ensaio de spotting.
Perto do final da incubação está uma pipeta multicanal para alíquota de 200 microlitros de meios de eliminação de rafinose por poço para uma nova placa de 96 poços, reservando as colunas um e sete para as culturas puras. Em seguida, alíquota de 250 microlitros de cada uma das 16 culturas saturadas nas colunas um e sete da placa e diluir em série as culturas cinco vezes em cada coluna da placa, misturando bem com a pipeta multicanal. Em seguida, para garantir uma mancha uniforme, remova 50 microlitros da cultura diluída das colunas seis e 12 para garantir que o volume final de cada poço seja de 200 microlitros.
Em seguida, use uma ferramenta replicadora de 96 volts para detectar as culturas em duplicata nas placas de chiado SD e escalonamento. Após uma incubação de dois a três dias a 30 graus Celsius, selecione as cepas de sequenciamento que exibem toxicidade nas placas de escalonamento. Semelhante ao dos controles, cepas falsos positivas, que não são tão tóxicas quanto os controles, podem ser descartadas.
Descarte também as cepas que apresentam um defeito de crescimento no sd. Suas placas ou que exibem toxicidade substancialmente maior do que o substrato da doença sozinho. Para sequenciar as variantes HSP 1 0 4 por PCR de colônia, primeiro raspe aproximadamente 10 microlitros de levedura das placas SD sibilantes Euro em três microlitros de 20 mili hidróxido de sódio em tubos removidos por PCR para colocar as células por congelamento e descongelamento.
Primeiro coloque as tiras em um freezer de 80 graus Celsius negativos. Após 10 minutos no freezer, incube os tubos a 99 graus Celsius no termociclador por 10 minutos e, em seguida, dilua as cepas para 100 microlitros com água de grau PCR usando uma alta concentração de primer. Em seguida, execute um programa de PCR padrão nas amostras e, em seguida, analise as amostras por eletroforese em gel para confirmar a amplificação de um produto de PCR do tamanho apropriado.
Finalmente, sequencie os produtos de PCR tendo o cuidado de analisar minuciosamente os cromatogramas de sequenciamento para mutações. As mutações podem ser observadas como uma mistura de dois nucleotídeos em um determinado local, pois as leveduras geralmente abrigam vários plasmídeos. Neste experimento representativo, após a construção de uma biblioteca de variantes de HSP 1 0 4 randomizadas no domínio médio, a biblioteca foi transformada em levedura contendo um plasmídeo para a expressão de TDP 43 induzível por galactose.
Os transformantes foram então recuperados e plaqueados em placas de glicose e galactose para avaliar o rigor da tela. Após cinco ensaios de detecção de tratamento FOA de um subconjunto das variantes selecionadas na triagem inicial. Indicou que das quatro colônias selecionadas, duas apresentaram supressão de toxicidade HSP 1 0 4, mediada por TDP 43.
Um era um falso positivo e o outro exibia toxicidade aumentada. Após o tratamento com cinco FOA, os dois verdadeiros acertos foram sequenciados por PCR de colônia para identificar as mutações de domínio médio. Essas mutações HS P 1 0 4 podem então ser feitas no plasmídeo HSP 1 0 4 parental por mutagênese dirigida ao local para confirmar sua supressão de toxicidade Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para rastrear até 200 acertos por vez nos cinco FO, uma etapa ao longo de uma a duas semanas se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante analisar cuidadosamente os resultados do sequenciamento, pois as misturas de plasmídeos são frequentemente obtidas após este procedimento. Outros métodos, como a microscopia de fluorescência, podem ser realizados para ajudar a responder a perguntas adicionais, como: como as variantes HSP 1 0 4 afetam a agregação do substrato associado à doença? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear bibliotecas de variantes HSP 1 0 4 para a seleção de supressores de toxicidade.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para triagem de bibliotecas de variantes de Hsp104 com o objetivo de identificar supressores da toxicidade proteica associada a distúrbios de desdobramento. A abordagem utiliza modelos de levedura para avaliar a eficácia dessas variantes na redução da toxicidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Doenças por Desdobramento Incorreto de Proteínas
- Modelos em Levedura
Antecedentes
- Distúrbios por desdobramento incorreto de proteínas estão associados à agregação proteica tóxica.
- Hsp104 é uma proteína chaperona que pode influenciar a agregação proteica.
- A identificação de variantes que suprimem a toxicidade pode fornecer insights sobre estratégias terapêuticas.
- Modelos em levedura são eficazes para estudar toxicidade e agregação proteica.
Objetivo do Estudo
- Para triar bibliotecas de variantes de Hsp104 em busca de variantes que suprimam a toxicidade proteica.
- Para avaliar a eficácia dessas variantes em um modelo de levedura.
- Para aprimorar a compreensão dos distúrbios de desdobramento proteico.
Métodos Utilizados
- Co-transformar bibliotecas de variantes de Hsp104 com substratos associados a doenças em levedura.
- Co-expressar as duas proteínas para avaliar interações.
- Tratar leveduras selecionadas com ácido fluoracético para realizar contra-seleção do plasmídeo de Hsp104.
- Sequenciar os acertos para identificar mutações no gene Hsp104.
Resultados Principais
- Identificação de variantes de Hsp104 que suprimem eficazmente a toxicidade.
- Avaliação da supressão da toxicidade em modelos de levedura.
- Compreensão dos mecanismos dos distúrbios de desdobramento proteico.
- Comparação deste método com seleções baseadas em ligação existentes.
Conclusões
- O método permite a seleção de variantes que suprimem a toxicidade.
- Ele fornece uma abordagem promissora para a caracterização adicional de variantes da Hsp104.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão dos distúrbios por desdobramento incorreto de proteínas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite que equipes de P&D biofarmacêutica identifiquem variantes de desagregases proteicas projetadas que suprimem a toxicidade em modelos de doenças neurodegenerativas, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas. Ao utilizar modelos de proteinopatia em levedura para triar bibliotecas de Hsp104, a abordagem fornece um sistema escalonável e geneticamente manipulável para avaliar a recuperação funcional de proteínas proteotóxicas como TDP-43, FUS e α-sinucleína. O processo de triagem em duas etapas reduz os falsos positivos, aumentando a confiança na seleção de hits para avaliação pré-clínica subsequente.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a funcionalidade de variantes de Hsp104 na supressão da toxicidade e agregação de TDP-43, FUS e α-sinucleína em levedura.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao distinguir supressores verdadeiros de supressores espontâneos por meio da seleção negativa com 5-FOA.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas baseadas no crescimento em meios seletivos para avaliar a supressão da toxicidade mediada por variantes.
- Valor Operacional: Padroniza a triagem de bibliotecas por meio de co-transformação, expressão induzível e seleção por perda de plasmídeo para identificação reprodutível de hits.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza modelos de levedura que recapitulam a agregação citoplasmática de proteínas associadas a doenças humanas, permitindo triagem fenotípica relevante para a patologia da ELA e da doença de Parkinson.
- Valor Operacional: Facilita a progressão de alvos promissores a candidatos a fármacos ao associar supressão genética à recuperação conformacional da proteína, apoiando estudos mecanicistas em sistemas de mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, permitindo a identificação de compostos ativos por meio da triagem funcional de bibliotecas de variantes de Hsp104 antes da validação mecanicista e pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao avaliar se variantes da Hsp104 podem reverter a proteotoxicidade associada a substratos ligados a doenças.
- Triagem: Fornece linhagens de levedura prontas para ensaio, com expressão induzível e contra-seleção, para avaliação em alta escala de variantes.
- Análises: Permite PCR de colônia e sequenciamento para correlacionar mutações genéticas com supressão funcional, orientando a análise estrutura-função.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de supressão baseados em levedura a fenótipos relevantes para o ser humano de desdobramento incorreto de proteínas, informando o grau de confiança no alvo.
- Reutilização Empresarial: O protocolo pode ser adaptado a qualquer estrutura proteica e substrato tóxico, permitindo a reutilização da plataforma em múltiplos alvos de neurodegeneração.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modulação do alvo ao validar a supressão funcional da agregação e da toxicidade.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de ensaios padronizados de contra-seleção e deposição para eliminar falsos positivos.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não ao priorizar variantes com eficácia demonstrada em modelos relevantes para a doença.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco de variantes da Hsp104 como candidatas terapêuticas potenciais para distúrbios de desdobramento proteico.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em genética de leveduras, transformação de plasmídeos e manipulação de meios seletivos.
- Depende de sistemas de expressão induzíveis (por exemplo, promotores de galactose) e marcadores de contra-seleção (por exemplo, sensibilidade ao 5-FOA).
- Necessita de fluxos de trabalho padronizados para transformação de bibliotecas, plaqueamento e triagem fenotípica em réplicas.
- A adaptação a outros esqueletos proteicos exige validação de expressão, dobramento e toxicidade em leveduras.
- Limitação prática: a eficiência da triagem depende do tamanho da biblioteca e da taxa de falsos positivos, exigindo uma validação em duas etapas para garantir a qualidade dos acertos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:47
Screening for Supression of Proteotoxicity
3:04
5–FOA Counter–selection and Spotting to Eliminate False Positives
5:41
Sequencing Hsp104 Variants by Colony PCR
6:45
Results: Representative Hsp104 Toxicity Suppresstion Screening
7:53
Conclusion
