1.13: Cultura de explante de tecido neural

As culturas de explantes servem como uma técnica para investigar o desenvolvimento de populações celulares e estruturas neurais específicas. Em experimentos de neurociência do desenvolvimento, os explantes são tecidos neurais extirpados de um embrião para desenvolvimento contínuo in vitro. Essas culturas dão aos pesquisadores a capacidade de manipular e visualizar os tecidos em desenvolvimento de maneiras que não são possíveis in vivo. Este vídeo apresentará alguns princípios importantes por trás do trabalho com tecidos explantados, procedimentos passo a passo para duas abordagens de cultura de explante, bem como aplicações dessa técnica.

Antes de nos aprofundarmos nos métodos, vamos examinar alguns princípios básicos. Os explantes podem ser estabelecidos a partir de vários organismos modelo e uma variedade de tipos de tecidos. Geralmente, as culturas são criadas removendo cuidadosamente o tecido neural de um embrião, dissecando uma região de interesse e colocando-a em um ambiente artificial.

Os tecidos também podem ser seccionados em folhas finas e cultivados em "cultura de fatias". Como o ambiente de cultura é projetado para imitar as condições in vivo de todo o órgão, essa estratégia de cultura é freqüentemente chamada de "organotípica".

Antes de começar, certifique-se de esterilizar seus instrumentos com etanol a 70%. Em seguida, eutanasiar uma rata grávida usando o método preferido do seu laboratório. Em seguida, excise cirurgicamente o útero e coloque em tampão gelado. Transfira a placa para um microscópio de dissecção e remova os embriões individuais do saco vitelino. Em seguida, isole o cérebro, disseque cuidadosamente sua região de interesse e transfira para um prato de cultura contendo meio de cultura. Os explantes podem ser mantidos em um 37 ? C contendo 5% de CO2 por algumas semanas, substituindo 50% do meio a cada 2 - 3 dias.

A cultura de fatias de tecido cerebral requer algumas etapas extras. Antes da secção, o tecido é embebido em agarose, que fornece suporte ao tecido para que permaneça intacto enquanto está sendo fatiado. Para fazer isso, uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% é aquecida até que a agarose se dissolva. Em seguida, a agarose é transferida para moldes de incorporação e deixada esfriar um pouco para evitar danos ao tecido.

O tecido pode então ser cuidadosamente submerso e a agarose deixada para endurecer. Os blocos resultantes são aparados e depois colados a um estágio de amostra e seccionados usando um vibratome, que é um instrumento que usa uma lâmina vibratória para cortar fatias finas de tecido vivo. À medida que as fatias são geradas, elas são cuidadosamente transferidas para uma placa revestida contendo meios de cultura e cultivadas conforme mencionado anteriormente.

Há uma série de vantagens em usar culturas de explantes em relação aos métodos in vivo e outros métodos in vitro. Primeiro, as células no tecido explantado são mais acessíveis a ferramentas experimentais. Em segundo lugar, o fato de os explantes manterem a complexa arquitetura celular do tecido neural em desenvolvimento significa que as interações célula-célula podem ser estudadas. Terceiro, uma vez que podem controlar a composição química do meio de cultura, os cientistas podem usar explantes para testar o efeito de compostos específicos no desenvolvimento do tecido.

No entanto, uma vez que está sendo removido de seu ambiente natural, cuidados especiais devem ser tomados para manter o tecido feliz e saudável in vitro. Por exemplo, a presença de matriz extracelular, ou ECM, tem um impacto significativo no comportamento celular, portanto, proteínas ECM purificadas são frequentemente usadas para revestir placas de cultura. Outra consideração importante é a solução em que os explantes são banhados. Embora os meios tradicionais de cultura de células sejam frequentemente usados, alguns experimentos exigem soluções que se assemelham muito ao fluido que circula no sistema nervoso central: o líquido cefalorraquidiano, que é um reagente crítico em experimentos como os que você está prestes a ver.

Agora que examinamos os métodos de cultura de explante, vamos ver como essas técnicas são usadas.

Os ensaios de migração celular usam tecido explantado para examinar os sinais repulsivos e atraentes envolvidos no movimento das células neurais. Neste experimento, grânulos que foram previamente embebidos em fatores de crescimento são implantados em explantes de rombencéfalo para examinar a migração de células neurais. Após 3 a 4 dias de exposição, os neurônios foram fotografados usando um microscópio confocal. Os resultados mostram que os neurônios motores migram para grânulos embebidos em fator de crescimento endotelial vascular, mas não controlam grânulos embebidos em tampão.

Os ensaios de co-cultura são frequentemente usados para investigar as interações célula-célula durante o desenvolvimento. Neste exemplo, segmentos da medula espinhal foram cultivados em cima de uma camada de células musculares para estudar como as conexões são feitas entre os neurônios motores espinhais e o músculo esquelético. Já 2 dias após a incubação, projeções dos neurônios, também conhecidas como neurites, são vistas emergindo do explante. Em 5 dias, a inervação funcional é observada pela contração da camada de células musculares.

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os neurônios devem alongar seus axônios para estabelecer uma conexão entre o tecido-alvo e o sistema nervoso central. Uma maneira de estudar esse processo complexo é por meio de ensaios de orientação de axônios. Os pesquisadores usam tecidos explantados para examinar os fatores dentro dos neurônios e no ambiente circundante que ajudam a guiar o axônio para sua localização adequada.

Você acabou de assistir ao guia de JoVE para cultura de explante de tecido neural. Este vídeo abordou uma visão geral das vantagens das culturas de explante, estratégias de cultivo, protocolos passo a passo de dois procedimentos de explante comumente usados e como essas técnicas são usadas no laboratório hoje.

Obrigado por assistir!