Name: In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda técnicas de criação in vivo e in vitro de nematoides entomopatogênicos usando larvas de traça da cera e placas de ágar. Este método permite estabelecer culturas de EPN para pesquisa em controle biológico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson e Sam-Kyu Kim por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão da National Science Foundation IOS-0840932 e 0724978 para IOS-SP da

1. vivo criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias Symboitic <ol><li> Inverta a 100 x 15 mm de plástico placa de Petri e colocar dois discos de papel de filtro (90 mm) na tampa da cápsula. </li><li> Distribuir uniformemente 1 ml da suspensão de água IJ (juvenis infectantes) (a uma concentração de 1000-2000 IJ / ml) no papel de filtro. NOTA: IJs não precisa ser esterilizada por superfície. </li><li> Adicionar 10 último larvas do maior mellonella waxmoth Galleria para o prato. O objetivo é fornecer cerca de 100-200 IJs / larva. </li><li> Cobrir a tampa com a parte inferior da placa de Petri (Figura 1) e a placa de Petri rotular. Mencione as seguintes informações: nome da espécie de nematóides (se conhecida); isolar código / designação; armadilha infecção data foi definida. </li><li> Coloque o prato dentro de um saco plástico selado livremente (para conservar a umidade) e mantê-lo no escuro a qualquer temperatura ambiente ou em estufa entre 20-25 ° C. Confira pratos diariamente NOTA: Darkness facilita a infecção por nematóides, uma vez que imita condições de infecção natural no solo. </li><li> Depois de 3-5 dias, remover cadáveres com sinais de infecção de nematóides para uma armadilha Branco modificado 7. Nota: Se o cheiro pútrido cadáveres, isso pode ser uma indicação de que a cultura não foi bem sucedida e / ou houve contaminação. Definir uma nova câmara de infecção com um novo lote de nematóides e insetos. </li></ol> 2 In vitro criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias simbióticas <ol><li> Fígado e rim Agar Método 9,19 <ol><li> Pique fígado e rim em pedaços pequenos (2 cm de 3 ou menor) e colocar dentro de uma misturadora com NaCl, ágar e 300 ml de água e misturar até que a carne torna-se uma polpa de líquido, pasta grossa ou puré. Em seguida, transferir mistura para um balão de Erlenmeyer de 1 L. </li><li> Adicionar os últimos 200 mL de água para o recipiente misturador e decanta-se quaisquer meios de comunicação para a restanteErlenmeyer. Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C. Após autoclavagem permitir agar para esfriar a tocar antes de derramar. NOTA: Pipetting do meio não é recomendado porque este meio tende a ter pedaços de carne. </li><li> Despeje ~ 20 ml de agar para 5 (ou 6) cm placas de Petri, enquanto agitação mão ou agitando o Erlenmeyer entre derrama para uma mídia mais homogênea. Permitir agar para solidificar e armazenar pratos a 4 ° C até ser necessário NOTA: Use uma espátula de metal esterilizado-chama para quebrar qualquer grandes pedaços de carne derramado na placa de Petri. </li></ol></li><li> Lipid Agar Método 9,19 <ol><li> Prepare ágar lipídico pela mistura de caldo nutriente, ágar e extrato de levedura e despeje a mistura em um frasco de 2 L Erlenmeyer. Adicionar H2O destilada e MgCl2 • 6H 2 O e em autoclave durante 15 minutos a 121 ° C. </li><li> Adicione a mistura estéril de óleo e mistura de xarope de milho de milho e mexa ou agite vigorosamente e, muitas vezes para dispersar as gotículas de óleo uniformemente. <br/&gt; NOTA: Esterilizar o óleo de milho e xarope de colocar o volume necessário em um reticulador de UV. O óleo não se dissolver no líquido, mas certifique-se que está em gotículas. </li><li> Despeje ~ 20 ml de ágar sobre a 5 (ou 6) cm placas de Petri e permitir agar solidificar e armazenar em pratos 4 ° C até ser necessário. </li><li> Raia a bactérias simbióticas desejado na placa de agar de lípidos e incubar as placas a 28 ° C durante 24-48 horas. NOTA: Espalhe 100-200 mL de noite (12-16 horas) LB subcultura. </li><li> No dia seguinte, adicionar cerca de 0,4 ml de suspensão de nemátodos esterilizados à superfície (ovos ou juvenis infectantes) e incuba-se as placas à temperatura ambiente, no escuro ou dentro de uma incubadora a 22 ± 3 ° C. NOTA: Não adicionar mais de 0,4 ml de suspensão de nematóides, uma vez que pode criar um ambiente excessivamente úmido que é desfavorável ao crescimento de nematóides. </li><li> Monitorar culturas diária. As culturas deverão produzir uma nova geração de IJ &#39;s em cerca de 12 dias (Figura 2).</li><li> Transferir prato inferior com ágar quando nemátodos são vistos rastejando os lados do prato (Figura 3A) para uma armadilha branco modificado (ver Orozco et al. 12) para colher IJ &#39;s (Figura 3B). Execute esta etapa sob uma capela de fluxo laminar para reduzir a contaminação da mídia. </li><li> Colete IJs da armadilha Branco modificado a emergência e enxaguar IJ suspensão para remover qualquer resíduo médio. Loja IJ em água destilada esterilizada, a 10 ° C (numa incubadora a temperatura fria ou ambiente frio) ou utilizar de imediato, se necessário. NOTA: Dependendo do objetivo do estudo, semear as placas com tanto nematóides colonizado-simbiontes ou aposymbiotic. </li></ol></li></ol> 3 In vitro criação de Aposymbiotic (Symbiont-free) entomopatogênicos Nematóides <ol><li> Infect 10-20 G. larvas mellonella com IJs das espécies de nematóides desejados (ver secção 1). Após 3 ou 4 dias (neste momento IJ &#39;s deveriam ter amadurecidopara adultos de primeira geração) recolher cadáveres. NOTA: O tempo até o vencimento e número de fêmeas necessários para obter um número suficiente de ovos varia de acordo com as espécies. Infectar mais G. mellonella larvas se necessário e começar a dissecções, logo no 48 horas após a infecção para avaliar se eles estão em fase de desenvolvimento direita. </li><li> Colocar cada cadáver individualmente em uma caixa de Petri com solução salina (tampão M9 18). Dissecar um cadáver, puxando sua cabeça com uma pinça fina ponta. </li><li> Coletar pelo menos 20 grávidas (com ovos dentro) do sexo feminino, com uma agulha fina (em forma de L, de preferência) e coloque-os em um vidro de relógio contendo 10 ml de tampão M9 (Figura 4A). </li><li> Prepara-se uma solução axenizing, considerando os seguintes ingredientes: 6,75 ml de água destilada, 1,25 ml de NaOH 5 N, e 2,25 ml de solução alcalina disponível comercialmente diluída até 3% de hipoclorito. NOTA: NaOH é uma base de soluções de luvas, óculos e outros adequados de proteçãoroupa deve ser usado. NOTA: Preparar a solução axenizing fresco de cada vez, como água sanitária degrada à luz. Prepare vários lotes de solução axenizing e realizar a esterilização superficial e colheita de ovos em vários vidros de relógio. </li><li> Lavar as fêmeas, pelo menos três vezes com tampão M9 enchimento relógio de vidro com solução tampão e sugando tampão com uma pipeta. Certifique-se que as fêmeas permanecem no vidro de relógio. Repita este passo mais duas vezes. </li><li> Adicionar imediatamente a solução axenizing e permitir que as fêmeas que permanecem nesta solução por não mais de 10-15 minutos. Observar os tecidos de nematóides que começam a desintegrar-se, enquanto os ovos (que são resistentes à solução axenizing) permanecem intactas. </li><li> Interromper manualmente órgãos femininos para acelerar o processo, cortando-as com uma agulha ou um escalpelo (Figura 4B, C). Retire os ovos pipetando-los em 1,5 ml microtubos, evitando a adição de qualquer tecido não dissolvido. NOTA: Use como mquaisquer microtubos como necessário para recolher ovos e trabalhar rapidamente, como na viabilidade dos ovos irá diminuir ao longo de um período prolongado de exposição à solução axenizing. </li><li> Tubos de vórtice por 15 segundos usando o &quot;ajuste de alta velocidade&quot; para remover tecidos mais nematóides anexados aos ovos. Alternativamente, se um vórtice não estiver disponível, pipete subir e descer as soluções várias vezes. </li><li> Ovos de pelotas por centrifugação a cerca de 18.000 g durante 2 min. Aumente a velocidade se os ovos não são suficientes para pellet. Retirar solução axenizing e lavar duas vezes através do enchimento do tubo de microcentrífuga com água destilada estéril e centrifugar mais uma vez a 900 xg durante 1 min. </li><li> Após a última lavagem, ressuspender ovos em 300-500 mL de água destilada estéril e colocá-los em um estéril 3 centímetros de Petri ou esterilizados vidro de relógio. Lembre-se que os ovos já estão esterilizados-superfície, por isso use pipetas estéreis e / ou dicas pippetter e água para manter a limpeza dos ovos. </li><li>Examine os ovos sob um microscópio de dissecação (ampliação 30-50X) para confirmar se eles estão intactos (Figura 4D) e transferi-los para uma placa de 5 cm com agar fígado-rim (ver secção 2.1) NOTA: Não adicionar mais de 400 mL da suspensão de ovos nas placas como ele vai fazer o agar excessivamente molhado. </li><li> Placas de etiqueta com informações adequadas e armazená-los em pé no escuro, a 28 ° C. Eclosão dos ovos deve ser durante a noite evidente. NOTA: A água pode se condensar na tampa do prato, mas ele vai evaporar depois de 1 ou 2 dias. Neste momento, colocar a cápsula no saco de plástico para reter a humidade do agar e evitar a sua secagem. </li><li> Observe pratos periodicamente e descartar todos os pratos que apresentam sinais de fungos ou contaminação bacteriana. Depois de IJ &#39;s são vistas migrar para cima da parede da placa de Petri, remover a tampa e transferir o fundo da placa com agar para uma armadilha branco modificado 12. Considere condições estéreis ao transferir o prato na modified Branco armadilha para evitar a contaminação da mídia exposta. </li><li> Continue monitorando as Armadilhas brancas e colheita IJ, conforme necessário. NOTA: nemátodos Aposymbiotic irá continuar a migrar para dentro da água do colector de branco durante muitos dias e mesmo semanas. </li></ol>

<ol><li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.%2C+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes%2C+Neoaplectana+and+Heterorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li>
<li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Nematol%22%5BJournal%5D)">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li>
<li>Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+N+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Prokaryotes%22">The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).</li>
<li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+%28Diptera%29+and+Galleria+mellonella+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control.+Boca%22">Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca</a>. , CRC Press. Raton, FL. (1990).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Manual of techniques in insect pathology</a>. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoppenh%C3%B6fer%2C+H+%22Entomopathogenic+Nematodes%3A+Systematics%2C+Phylogeny+and+Bacterial+Symbionts%22">Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts</a>. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).</li>
<li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li>
<li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae%2C+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+%28Steinernematidae%3A+Nematoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li>
<li>Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+%28Achromobacteriaceae%3A+Eubacteriales%29+associated+with+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Bull.+Bacteriol.+Nomencl.+Taxon%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li>
<li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila%2C+its+nematode+vector%2C+and+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li>
<li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernema%29+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+%28Xenorhabdus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li>
<li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando um hospedeiro adequado é um fator chave para o sucesso na criação vivo da EPN. Normalmente, ambos os steinernematids e heterorhabditids podem se reproduzir e concluir com êxito o ciclo de vida das larvas da traça da cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). No entanto, outras espécies de insetos de diferentes famílias e / ou encomendas podem ser considerados. Algumas das espécies nematóides actualmente descritos são conhecidos por ter especificidade para um hospedeiro insecto ...

Nematóides entomopatogênicos (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e suas bactérias simbiontes, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) são considerados um modelo emergente de animal terrestre-micróbio relações simbióticas 2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. são abrigados como simbiontes no intestino da única etapa de vida livre dos nematóides, também conhecido como o juvenil infecciosa (IJ) ou 3a etapa infecciosa juvenil 8,10,13. O par bactéria nematóide é patogênico para uma ampla gama de insetos e tem sido implementado com sucesso no controle biológico e manejo integrado de pragas em todo o mundo 6,8. Aqui vamos mostrar uma seleção de in vivo e in vitro técnicas que são frequentemente exercidos com a criação de EPN em condições de laboratório. Eun métodos in vivo contemplar um inseto hospedeiro para a criação dos nematóides. Normalmente, estágios imaturos de várias ordens de insetos (ou seja, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) São considerados hospedeiros apropriados. Métodos in vivo são geralmente considerados para a manutenção de culturas de nematóides no laboratório. Este método pode não ser apropriado quando se considera a produção em massa dos nematóides. Grandes quantidades de insetos hospedeiros podem ser necessários para este fim exigindo mais tempo e os custos adicionais relacionados com o inseto criação. Nematóides podem também ser cultivadas in vitro em vários meios de comunicação. Dependendo do objetivo do estudo, métodos in vitro podem ou considerar a incorporação das bactérias simbióticas na mídia. Nesta apresentação, descrevemos dois métodos comumente utilizados para a propagação de EPN. Os componentes dos meios fornecer uma fonte de nutrientes para a bactéria simbiótica umnd uma fonte de esteróis para os nematóides. métodos in vitro oferecem a vantagem da criação de EPN sem um inseto hospedeiro. Originalmente, muitos dos meios de comunicação in vitro desenvolvido foram utilizados para a multiplicação de EPN quando insetos hospedeiros adequados não estão disponíveis. No entanto, ao longo dos últimos anos, in vitro métodos de criação tornaram-se amplamente utilizados em pesquisas com o objetivo de entender a relação de mutualismo entre EPN e suas bactérias simbióticas 17,19. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinados pelo Banco Laboratory, da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Para In vivo Infecções</td></tr><tr><td>100 x 15 Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro, 9 cm de celulose de grau 1</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Papel de filtro de grau 1 recomendado</td></tr><tr><td>Hospedeiros de insetos</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Galleria mellonella são recommended</td></tr><tr><td colspan="4">Para ágar-fígado-rim (para 500 ml)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Fígado bovino, 50 g</td><td>De origem local; talho ou supermercado</td><td></td><td>O restante pode ser armazenado congelado e descongelado para uso futuro</td></tr><tr><td>Rim bovino, 50 g</td><td>De origem local; açougueiro ou supermercado</td><td></td><td>O restante pode ser armazenado congelado e descongelado para uso futuro</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio 2,5 g (concentração final de 0,5%)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>pode ser usado qualquer NaCl de grau de pesquisa pode ser usado</td></tr><tr><td>Ágar, 7,5 g (ágar 1,5%, concentração final)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>qualquer ágar de grau de mídia pode ser usado</td></tr><tr><td>500 ml destilado H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Para ágar lipídico (para 1 L)</td></tr><tr><td>100 x 15 placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Caldo nutritivo, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado 10 ml (0,2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de milho, 4 ml</td><td>Qualquer marca</td><td>Fonte local; supermercado</td><td>Qualquer marca de óleo de milho pode ser usada</td></tr><tr><td>Xarope de milho, 96 ml combine 7 ml de xarope de milho em 89 ml de H2O aquecido e agite para homogeneidade</td><td>Karo</td><td>de origem local; ágar de supermercado</td><td></td></tr><tr><td>, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>qualquer ágar de grau de mídia pode ser usado</td></tr> H<tr><td>2O destilado, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo e in vitro criação de nematóides entomopatogênicos (steinernematidae e heterorhabditidae)

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

Nematóides entomopatogênicos (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) têm uma parceria de mutualismo com Gram-negativo proteobactérias gama da família Enterobacteriaceae bactérias. Xenorhabdus estão associados com steinernematids nematóides enquanto Photorhabdus são simbiontes de heterorhabditids. Juntos nemátodos e bactérias formam um complexo insecticida potente que mata uma ampla gama de espécies de insectos numa íntima e específica. Aqui, demonstramos in vivo e in vitro de técnicas vulgarmente utilizadas na criação desses nemátodos em condições de laboratório. Além disso, estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN e também servir de base para outros bioensaios que utilizam esses organismos de investigação. A produção de aposymbiotic nematóides (free-simbiontes) muitas vezes é fundamental para uma profunda e abordagem multifacetada para o estudo da simbiose. Esteprotocolo não requer a adição de antibióticos e pode ser realizada num curto período de tempo com equipamento de laboratório standard. Nemátodos produzidos deste modo são relativamente robusta, embora a sua sobrevivência na armazenagem pode variar dependendo da espécie utilizada. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinado pelo Laboratório de P. da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.

O método in vivo criação usa insetos vivos como hospedeiros para o crescimento e reprodução do nematóide. Câmaras de infecção são um método eficiente para expor insetos IJs. Esta é a única etapa no ciclo de vida dos nematóides que os vetores de bactérias simbiontes de um inseto hospedeiro para outro. Figura 1 mostra a configuração para uma câmara de infecção, bem como os materiais necessários para construir esta câmara. In vitro métodos de criação permitir EPN a crescer sem um insecto ...

O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar técnicas in vivo e in vitro para a criação de nematóides enteropatogênicos. O método in vivo é realizado pela primeira incubação de larvas de ínstar do melanoma garia da mariposa-da-cera maior com suspensão juvenil infecciosa ou IJ. Em seguida, os cadáveres infectados com nematóides são transferidos para uma armadilha branca modificada para que possam ser coletados.O método de cultura in vitro é realizado reparando primeiro placas de fígado, rim ou ágar lipídico, e as bactérias simbióticas desejadas são eliminadas. Em seguida, a suspensão IJ é adicionada às placas e os nematóides podem se desenvolver. Finalmente, a placa de ágar é transferida para uma armadilha branca modificada para a colheita dos nematóides.Em última análise, essas técnicas estabelecem com sucesso culturas de NEP e também formam a base para outros bioensaios que utilizam esses organismos para pesquisa. Os métodos in vitro e in vitro mostrados nesta apresentação podem ser usados não apenas para pesquisas com nematóides patogênicos, mas também para uma ampla gama de experimentos que visam a compreensão do ProCard e das interações aéreas. Demonstrando os procedimentos

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Os nematoides de Caenorhabditis selvagens estão associados a muitos micróbios, muitas vezes no lúmen intestinal ou infectando o intestino. Este protocolo detalha um método para enriquecer micróbios não culturais colonizando o intestino, aproveitando a resistência da cutícula dauer.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Este artigo demonstra a engenharia genômica mediada por CRISPR-Cas9 em Steinernema hermaphroditum, um nematoide entomopatogênico (EPN: parasita inseto) e um modelo genético emergente. A tecnologia descrita é útil para criar mutantes, permitindo a elucidação das funções gênicas na biologia dos nematoides relevantes para simbiose mutualista e parasitária.

Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes

Apresentamos dois métodos para que agricultores propaguem em massa nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. O primeiro método utiliza gel de poliacrilamida como substrato de cultivo do nematoide, enquanto o segundo utiliza algodão revestido com polímero como substrato de cultivo. Ambos os métodos dependem da propagação in vivo de nematoides dentro de cadáveres de insetos.

Propagação In Vivo de Nematoides Entomopatogênicos Baseada em Cultivadores

Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

A construção completa de um costume, sistema de imagens em tempo real confocal de varredura é descrito. Este sistema, que pode ser facilmente utilizado para vídeo-microscopia e taxa de microendoscopy, permite uma variedade de geometrias de imagem e aplicações que não sejam acessíveis usando o padrão comercial sistemas confocal, em uma fração do custo.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

Aprenda técnicas de criação in vivo e in vitro de nematoides entomopatogênicos usando larvas de traça da cera e placas de ágar. Este método permite estabelecer culturas de EPN para pesquisa em controle biológico.

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Explorar mais vídeos