Name: Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a purificar segmentos externos de fotorreceptores de retina suína ou bovina usando ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método permite preparar grandes estoques para estudos de fagocitose em células epiteliais pigmentadas da retina.

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Este trabalho foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre e Fondation Bettencourt Schueller (Grants Jovem investigador EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, posição permanente para EFN) e The National Eye Institute dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EY13295 para SCF). Além disso, o Institut de la Visão é financiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique e do departamento de Paris.

Este experimento isolamento POS é demorado e pode precisar de até 12 horas para ser concluído se POS são rotulados antes do armazenamento. O protocolo foi adaptado de um artigo publicado pelo RS Molday e colegas em 1987, 31 e modificado por SC Finnemann e colegas em 1997 10. Os animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Charles Darwin Ética da Universidade Pierre e Marie Curie em Paris, 06 e Comitê Institucional Animal Care e Uso da Universidade Fordham. 1. Geral Set Up <ol><li> Obter 80 frescas de suíno ou de vaca olhos tão fresco, logo após o abate quanto possível e mantê-los refrigerados no escuro. Fornecer instruções para o provedor para que a empresa procede da mesma maneira. Este protocolo é otimizado para 80 olhos. Paraprosseguir com mais olhos e obter estoques maiores (por exemplo, a partir de 160 olhos), o dobro das quantidades de solução e realizar duas rodadas de ultracentrifugação; amostras de piscina mais tarde, na etapa de coleta (veja o passo 2.2.2). </li><li> Configure no banco a lâmpada safelight vermelho, absorventes, lenços (tabela de materiais). Prepare 15 centímetros pratos e sacos de risco biológico para a recolha de resíduos (partes do olho não utilizado, vítreo ...). Usar apertada labcoat, luvas, mangas de protecção e óculos de proteção. </li><li> Precauções: <ol><li> Pré-chill todas as soluções, em seguida, mantê-los frio durante todas as etapas. Manter os olhos e gradientes refrigeradas em gelo tanto quanto possível. </li><li> Manter os olhos e tecidos derivados no escuro, tanto quanto possível até que o passo de recolha após a ultracentrifugação a fim de evitar a fotodegradação de pigmentos visuais e perda da coloração laranja-rosa da forma activa dos photopigments. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo de Ações <ol><li> Preparar soluções e gradientes: <ol><li> Estoque taurina Thaw completamente através de um banho de água a 37 ° C. </li><li> Prepare todas as soluções de soluções de estoque (Tabela 1, soluções de reserva) e misture bem a sacarose com outros ingredientes, usando um agitador magnético para cada solução. <ol><li> Preparar 15 ml da solução de homogeneização a uma concentração final de 20% de sacarose, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM de MgCl 2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de sacarose a 25% para uma concentração final de sacarose a 25% (utilizando 70% de sacarose estoque), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de sacarose a 60% para uma concentração final de 60% de sacarose (usando pó de sacarose), 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, glicose 10 mM e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de lavagem para uma concentração final de 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de lavagem 2a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de lavagem de 3 a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de fosfato de sódio pH 7,2 e taurina 5 mM. </li></ol></li><li> Firmar o fabricante de gradiente com um agitador magnético e inserir uma barra de agitação na câmara mais próxima da saída, onde a solução de 60% será inserido. Usar uma pipeta de ponta P200 de corte colocado na saída da tubagem para alcançar velocidade de vazamento adequada. </li><li> Fundido gradientes lineares delicadamente por diluição e agitação da solução de sacarose a 60% com o um, 25% a partir de 12 ml de cada solução (isto é, o total de 6 tubos de 80 olhos) em tubos de ultracentrífuga previamente arrefecidos. Mexa bem a solução de sacarose gradualmente-diluição de 60%. Firmar a velocidade do fluxo de gradiente, derramando a solução de forma suave e não muito rápido. NOTA: De modo a obter um gradiente contínuo, linear, manter a ponta da pipeta de abertura à direita na superfície da solução durante todo o gradiente formation. </li><li> Deixe os gradientes de sentar no gelo por cerca de 1 hora para a estabilização. Mantenha os gradientes refrigeradas até carregado. Não agite os tubos para evitar a interrupção do gradiente. </li></ol></li><li> Coleta de tecido: <ol><li> Recolha tecidos sob luz vermelha ofuscante. Tome um olho em uma das mãos e picar a frente com borda de lâmina de barbear, mantendo o olho longe (para evitar respingos; Figura 1). Use a lâmina de barbear para cortar o globo ocular anterior em duas metades (córnea, além de pelo menos 5 mm no esclera). Retire a lente e virar o ocular dentro para fora, de modo que ele pode ser realizada através da ponta de um dedo expondo assim a retina. </li><li> Usando a lâmina em ângulo, raspe a retina, separando facilmente e aparecendo como uma camada rosada, fora da superfície das células do tapete e cortado na cabeça do nervo óptico (Figura 1). Recolha todas as retinas em 2 x 50 ml bisnagas contendo 15 ml de solução de homogeneização sobre gelo. </li><li> Homo Retinahomoge-: <ol><li> Agitar a suspensão vigorosamente à mão durante 2 minutos a fim de interromper as diferentes camadas de células, quebrar POS fora do resto da célula PR, POS fragmento e homogeneizar a suspensão retina. </li><li> Filtrar através de um 3x dupla camada de gaze para remover os fragmentos de tecido grandes e recolher o fluxo de passagem em tubos de 50 ml limpos (Figura 1). A suspensão da retina de ser bastante espessa, para maximizar o rendimento, pressionar suavemente sobre a gaze para libertar restantes tecidos fragmentadas após cada filtração. </li></ol></li></ol></li><li> Fotorreceptores exterior fragmento segmento (POS) de isolamento: <ol><li> Cuidadosamente, coloque o prep retina bruto, cerca de 6-7 ml por tubo, mais de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga, cada uma contendo 24 ml de frescas, refrigeradas contínua 25-60% gradiente de sacarose (Figura 1). Equilibrar os tubos opostos, conforme apropriado para o rotor a ser utilizado. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Remover a maior parte da solução acima da banda laranja-rosa no terço superior do gradiente por aspiração (Figura 2A). Colher a faixa laranja-rosa com um P1000 ponta de corte para um copo. Descartar o resto depois neutralizar o uso de alvejante (resíduos biológicos). </li><li> Dilui-se com ~ 4 - 5 volumes de gelado de lavagem uma solução. Separa-se em tantos tubos de 30 ml, conforme necessário. Centrifugar a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Ressuspender as pelotas em 10 ml de solução de lavagem 2 e centrifugação a 3000 xg durante 10 min como descrito acima. Ressuspender as pelotas em 15 ml Lavar 3 e roda de novo a 3000 xg durante 10 min. Combinar suspensões de vários peletes para reduzir o número de tubos necessários antes da centrifugação em 2 de lavagem e lava-se três soluções. </li></ol></li><li> POS alíquotas sem rotulagem: <ol><li> Ressuspender POS em 10-20 ml DMEM. Pré-diluir 10 ml em 490 DMEM ul (1:50) e contagem alongados, bem como POS girou em umcâmara de contagem celular (Figura 2B). Calcule o rendimento e concentração em partículas POS por mL. NOTA: O rendimento varia, dependendo principalmente da idade e da estirpe de porcos e vacas / tamanho dos olhos, por exemplo, uma boa preparação varia 5-8 x 10 9 a partir de POS 80 olhos de porco. </li><li> Decidir sobre o volume final de DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e adicionar sacarose para se obter uma concentração final de 2,5% de sacarose. </li><li> Preparar alíquotas do tamanho desejado, por exemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para um volume de 2 ml para a ressuspensão de 96 poços de ensaio a 40 ul / poço. Gire uma alíquota de 5 min a 2.300 xg à temperatura ambiente e avaliar o tamanho da pelota. Prepare vários tamanhos alíquotas para diferentes volumes de aplicação como POS não devem ser congeladas e descongeladas duas vezes. </li><li> Congelar alíquotas POS a -80 ° C até à sua utilização. NOTA: As aliquotas são estáveis ​​durante muitos meses. Em nossas mãos, sem rótulo ou rotulados POS podem ser armazenados por pelo menos um ano. </li></ol></li><li> Rotulagem POS e alíquotas: NOTA: De modo geral, utilizar FITC para marcar POS para a quantificação de ensaios de fagocitose, mas outros corantes podem ser usados ​​também em função das necessidades. <ol><li> Ressuspender 1 10 mg de FITC a um frasco de 2,5 mg / ml de concentração em 0,1 M de tampão de carbonato de Na de pH 9,5 por mistura de 2,6 ml de NaHCO3 0,1 M pH 8,4 com 1,4 ml de 0,1 M de Na 2 CO 3 pH de 11,5 (Quadro 2, soluções de reserva). Girar durante 1 hora à temperatura ambiente ao mesmo tempo proteger da luz e centrifugação durante 5 minutos à velocidade máxima, para sedimentar os sólidos não-FITC ressuspensas. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 ml de POS de lavagem de solução de 3 (ou DMEM) e juntar 2 ml de solução de FITC para 80 olhos. Armazenar sobra FITC congelado a -80 ° C. Para rodar, pelo menos, 1,5 horas à temperatura ambiente. Proteger da luz usando papel alumínio. </li><li> Lavar POS marcado duas vezes, utilizando solução de lavagem 3, como descrito na secção 2.3.4, em seguida, uma vez ou duas vezes em DMEM até quase nenhuma FITC livre é visto no sobrenadante frAction. Ressuspender POS em DMEM e proceder como para POS não marcado para contagem e alíquotas (seção 2.4). </li></ol></li><li> Usando POS em experiências: <ol><li> POS Thaw à RT, e mantê-los no escuro, tanto quanto possível, se eles são fluorescently marcado. Girar durante 5 minutos a 2300 xg à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Imediatamente ressuspender em volume apropriado de solução de ensaio como ditado pela experiência. Em caso de diferentes tempos de desafio POS, loja novamente suspensas no POS RT no escuro entre pontos de tempo por várias horas. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

Três degraus ou condições são cruciais para uma purificação optimizado: qualidade da carcaça de gradiente e manipulação delicada tubos de gradiente, mantendo tecidos refrigerada e no escuro até que o passo de recolha, a força de agitação de homogenatos da retina para se obter o isolamento POS adequado do restante da PR célula. Se algumas questões surgem em ver a banda laranja corretamente, eles são provavelmente devido a uma das três razões acima (ver também o segundo parágrafo da seção Resultados). Alg...

Na retina, a visão é desencadeada por isomerização de moléculas fotossensíveis chamados opsinas, antes de ser transformado em um sinal que pode ser transmitido entre os neurónios para cima para as áreas visuais no cérebro. Estas moléculas são incorporados em pilhas de discos que se assemelham panquecas membranosas que constituem as partes segmentares exterior de células fotorreceptoras (RP). Sendo submetido a constante exposição à luz e, portanto, os níveis consideráveis ​​de estresse oxidativo, PRs renovar continuamente os seus segmentos externos para limitar o dano oxidativo potencial. Segmentos externos fotorreceptoras estão em contato próximo com microvilosidades apical das células do epitélio pigmentado da retina vizinhos (RPE). Células RPE constituem a parte exterior da barreira hemato-retiniana e garantir inúmeras tarefas que são cruciais para fotorreceptores saúde e função 1, como o que extingue os raios de luz através de pigmentos de melanina, re-isomerização do retinal componente opsina fotorreactivo, fornecendo nutrientes e gCRESCIMENTO fatores, participando de eliminação PR metabólito. Além disso, as células de RPE eliminam gasto POS e reciclar seus componentes, uma ocupação diária, que é regulada pelo ritmo circadiano na retina de mamíferos 2,3. A folga de galpão POS é absolutamente necessário para a sobrevivência PR. Quando ele está completamente revogada, POS detritos se acumulam e PRs degenerar causando 4,5 perda de visão rápida. Se o perfil rítmico é perdida e substituída por uma actividade constante, defeitos PR e RPE acumular com 6 anos de idade. Portanto, é muito importante para caracterizar a regulação molecular de EPR fagocitose in vitro, a fim de compreender fenótipos ligados à sua disfunção. Curiosamente, a maquinaria molecular em células RPE é muito semelhante à utilizada pelos macrófagos para eliminar as células apoptóticas e ambos dependem do reconhecimento de fosfatidilserina exposta em detritos fagocítica 7-9. Ainda, as células de RPE e macrófagos regular o pHagocytosis de forma diferente, como macrófagos optar pela eliminação imediata das células em apoptose em tempo de encontro, enquanto as células RPE ritmicamente engolfar POS apenas uma vez por dia, apesar de estarem em contato permanente com segmentos externos. Isto sugere mecanismos de regulação específicos que ainda não são totalmente compreendidos. Muitas das moléculas envolvidas na maquinaria de EPR fagocítica foram identificados e validados graças à utilização de POS isolado e ensaios de fagocitose de cultura de células. O receptor de integrina alphavbeta5 localizado na superfície apical de células RPE, em coordenação com o seu ligando MFG-E8, liga-se especificamente ao POS 10-12, que são então internalizado através do receptor tirosina-quinase MerTK 13-15. O scavenger receptor CD36 tem sido mostrado para participar na ingestão de POS e influenciar a sua velocidade de 16,17, e poderá servir como um sensor de fosfolípidos oxidados na superfície POS 18. Internalização precisa o recrutamento de F-citoesqueleto de actina-assproteínas, tais como a anexina ociated 2 19, 20 e miosina II miosina VIIA 21,22. POS Native ou oxidado in vitro também são utilizados para entender o envelhecimento fenótipos de células RPE in vivo ligados ao acúmulo de mal digeridos POS oxidado 23-28. A geração de células epiteliais pigmentares derivadas de células-tronco deu início a uma nova aplicação para o isolado POS que são usados ​​para provar a funcionalidade das células antes de serem transplantadas para animais ou pacientes 29,30,27. Descrita pela primeira vez por Molday e colegas em 1987, 31, o protocolo para o isolamento de POS bovina combina um passo ultracentrifugação de homogeneizados de retina em gradientes de sacarose contínuas com observação da aparência laranja característico de fotopigmento retinal crus (levando 11- retinal cis). Nos últimos 10 anos, devido a precauções tomadas, a fim de minimizar o risco de doença da vaca louca, o uso de olhos de porco tornou-se increasingly proeminente. O protocolo aqui descrito mostra como obter grandes quantidades de POS de porcina ou bovina olhos que podem ser distribuídos em alíquotas e armazenados por longos períodos de tempo. Isto elimina a necessidade de preparar a partir de POS de roedores olhos, o que exige a utilização de um grande número de animais em cada preparação e ensaio de POS 32,33,21,22. Além disso, detalhes sobre rotulagem POS antes de armazenamento utilizando moléculas fluorescentes são dadas, para quantificar e visualizar POS de uma forma simplificada e comparáveis ​​para algumas aplicações, em comparação com a rotulagem POS após o ensaio de fagocitose 32,10. Portanto, estes grandes existências permitir a reprodutibilidade e facilidade de utilização, em muitos tipos diferentes de experiências.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material/Equipamento Específico</td></tr><tr><td>2 Câmaras gradiente fabricante</td><td></td><td></td><td>com câmaras de 30 ml</td></tr><tr><td>Tubulação de silicone de 3 mm de</td><td></td><td></td> diâmetro <td>para fundição gradiente</td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td> de agitação magnética de tamanho pequeno <td>Barra de agitação encaixando a câmara do fabricante gradiente</td></tr><tr><td>Lâmpada</td><td></td><td></td> de luz de segurança vermelha <td>Lâmpada inactínica para dissecção no tubos escuros</td></tr><tr><td>Ultra Clear 25 x 89 cm</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Tubos de ultracentrifugação</td></tr><tr><td>Tubos PP Oak Ridge</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>Tubos de centrifugação de 30 ml</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultracentrifuge</td></tr><tr><td>SW 32Ti rotor de giro</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>Rotor de giro para ultracentrífuga</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrífuga 393124 Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA-25.50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td>Rotor para centrífuga Avanti J-26 XP</td></tr><tr><td>Isômero FITC I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Corante</td></tr><tr> fluorescente<td colspan="4">Outros materiais/equipamentos</td></tr><tr><td>Câmara de contagem (como Neubauer ou Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baldes de gelo escuro com tampas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético e pólo</td><td></td><td></td><td></td>de sustentação</tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td>refrescada</tr><tr><td>37 &deg; C banho-maria-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumíveis</td></tr><tr><td>Labcoat</td><td></td><td></td><td>Saúde e segurança</td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protetores</td><td></td><td></td><td></td>de manga</tr><tr><td>Óculos Almofadas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>absorventes Sacos</td><td></td><td></td><td></td></tr> e <tr><td>lixeiras</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>de risco biológico<td>Lâminas Weck-Prep Dissecção</td><td></td><td></td><td>Lâminas de barbear de 60 mm/2,25 polegadas de largura Prato</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de plástico de 15 cm</td></tr><tr>Folhas <td></td><td></td><td></td>de<td>gaze estéreis</td></tr><tr><td>Tubos de 15 e 50 ml Consumíveis</td><td></td><td></td><td>comuns</td></tr><tr><td>Microtubos Folha</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de alumínio</td></tr></tbody></table>

grande escala da purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores outer segmentos para a fagocitose ensaios sobre retinal pigment células epiteliais

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Análise de uma das funções vitais do pigmento epitelial da retina (RPE) células, a fagocitose de fragmentos distais envelhecido gasto de segmentos externos de fotorreceptores (POS) pode ser realizado in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos com pilhas de discos membranosos que contêm as máquinas phototransduction é continuamente renovado na retina. Passado POS são eliminados diariamente por células RPE. Roedor, suíno / bovino e células RPE humanas reconhecem POS a partir de várias espécies de um modo semelhante. Para facilitar a realização de uma grande série de experiências com pouca variabilidade, um grande stock de POS podem ser isolados a partir de olhos de porcos e armazenado congelado em alíquotas. Este protocolo tira proveito da característica de photopigments que exibem uma cor laranja quando mantidos no escuro. Sob a luz vermelha ofuscante, retinae são coletados em um buffer de viseiras abertas cortadas em metades. A suspensão de células da retina é homogeneizada, filtrada e carregado num gradiente de sacarose contínuo. Após centrifugation, POS estão localizados em uma banda discreta na parte superior do gradiente que tem uma cor laranja característica. POS são então recolhidas, centrifugadas, ressuspensas em tampões de lavagem sequencialmente, contadas e aliquotadas. POS obtidos deste modo podem ser utilizadas para ensaios de fagocitose e análise de activação da proteína, localização ou interacção em vários momentos após o desafio POS. Alternativamente, POS podem ser marcados com fluoróforos, e. G., FITC, antes de alíquotas para posterior quantificação de fluorescência de ligação de POS ou imersão. Outras aplicações possíveis incluem o uso de POS ou POS desafio modificado combinado com condições de estresse para estudar o efeito do estresse oxidativo ou envelhecimento sobre células RPE.

A combinação do gradiente linear de sacarose e a ultracentrifugação permite a separação dos diferentes componentes da suspensão da retina por densidade. As células de RPE e detritos pesados ​​maior da retina para afundar ou perto do fundo do gradiente (Figura 2A). Isqueiro POS e células mais leves individuais ou detritos celulares a partir da retina migram como bandas distintas para alcançar o topo da metade do gradiente até ao final do período de centrifugação. Ao manter os olhos e as amostras no escur...

Este artigo descreve o protocolo para a purificação de fragmentos do segmento externo (POS) fotorreceptores via ultracentrifugação de retinas suínas/bovinas usando homogeneização e centrifugação com gradiente de sacarose. Este protocolo permite a preparação de grandes estoques de alíquotas POS, rotuladas ou não, que podem ser armazenadas a -80 °C.

Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar estoques em larga escala de segmentos externos fotorreceptores, purificados de sinais de guerra ou olhos bovinos. Para estudar uma das funções mais importantes do pigmento da retina, as células epiteliais, sua atividade rítmica diária do ácido OC. Isso é feito pela primeira fundição de 25 a 60% de sacarose, gradientes em tubos de ultracentrífuga.Em seguida, os olhos suínos ou bovinos são dissecados e os Rey são coletados e homogeneizados. Em seguida, os re são filtrados e carregados no gradiente de sacarose e centrifugam para separar os segmentos externos do fotorreceptor. Finalmente, a faixa laranja contendo os segmentos externos do fotorreceptor é coletada em alíquota armazenada como está ou rotulada antes de Ali, citando e armazenando.Em última análise, a varredura fluorescente automatizada, a microscopia fluorescente ou o immuno blotting são usados para estudar a atividade fagocítica de linhagens celulares, células diferenciadas derivadas de células-tronco ou culturas primárias em várias condições. A principal vantagem dessa técnica sobre o isolamento de autosegmentos de massa ou olhos para cada experimento é que o mesmo pool de material pode ser usado para vários experimentos, permitindo assim maior grau de reprodutibilidade. A demonstração visual deste método é prática, pois uma etapa crítica está na fundição de íons porque condiciona a faixa de segmentos externos isolados.Demonstrando o procedimento estará Celia Parino, uma estudante de pós-graduação e, contente, uma técnica do meu laboratório Depois de obter 80 olhos frescos de porco ou vaca de acordo com o protocolo de texto, mantenha-os no escuro e refrigerados no gelo o máximo possível. Para evitar o branqueamento fotográfico de pigmentos visuais e perda de cor rosa alaranjada configurada na bancada, a lâmpada de luz segura vermelha absorve almofadas e lenços umedecidos. Prepare um prato de 15 centímetros sacos de risco biológico para coleta de lixo e lâminas de barbear.Uma vez preparadas todas as soluções, de acordo com o protocolo de texto, pré-resfrie-as e mantenha-as frias durante todas as etapas. Estabilize o gradiente em uma placa de agitação magnética e insira a barra de agitação na câmara mais próxima da saída onde a solução a 60% será derramada. Use uma ponta de pipeta P 200 de corte colocada na saída da tubulação para atingir a velocidade de fundição adequada com 12 mililitros de cada solução de sacarose a 25% e 60%.E enquanto agita a solução a 60%, funda um gradiente linear de sacarose em um tubo de centrífuga pré-resfriado, mantendo a abertura da ponta da pipeta na superfície da solução de gradiente continuamente crescente. Para realizar a coleta de tecidos, use um jaleco justo, luvas, protetores de manga e óculos de proteção sob luz vermelha fraca enquanto segura um olho em uma mão com a superfície de corte virada para fora, use a ponta de uma lâmina de barbear para perfurar a frente do olho. Em seguida, use a lâmina de barbear para cortar o globo ocular anterior em duas metades.Remova a lente e vire a ocular do avesso para que possa ser segurada sobre a ponta de um dedo. Assim, expondo a retina usando a lâmina de barbear em ângulo, raspe suavemente a retina, que se desprenderá facilmente e aparecerá como uma camada rosada da superfície do téter e cortará a cabeça do nervo óptico. Transfira as retinas para um dos tubos de dois a 50 mililitros contendo 15 mililitros de solução de homogeneização no gelo.Depois de coletar todas as retinas, agite a suspensão vigorosamente com a mão por dois minutos. Para romper as diferentes camadas celulares, quebre os segmentos externos dos fotorreceptores ou POS do resto dos fotorreceptores, fragmente o POS e homogeneize a suspensão da retina. Para remover grandes fragmentos de tecido, use a camada dupla de gaze limpa para filtrar a suspensão três vezes em um tubo de 50 mililitros.Pressione suavemente a gaze para liberar os tecidos fragmentados restantes. Após cada filtração, coloque suavemente a preparação bruta da retina sobre seis a 24 mililitros, gradientes de sacarose de 25 a 60%. Depois de equilibrar os tubos, a Ultra centrifuga a 106.000 Gs por 50 minutos a quatro graus Celsius.Quando a centrifugação estiver completa, aspirar a maior parte da solução acima da banda rosa alaranjada no terço superior do gradiente. Em seguida, usando uma ponta P 1000, colete a faixa rosa laranja em um béquer. Use aproximadamente quatro a cinco volumes de lavagem um para diluir a solução e alíquota em tantos tubos de 30 mililitros quanto necessário.Centrifugue a 3000 GS por 10 minutos a quatro graus Celsius e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, com a lavagem de duas soluções reus, suspenda os pellets antes de girar novamente. Use a solução de lavagem três para lavar os pellets.Uma terceira vez. Para alíquota do PDV. Use 10 a 20 mililitros de DMM para ressuspender as células.Em seguida, use 490 microlitros de DMM para diluir 10 microlitros de células e recalcular o rendimento e a concentração em partículas POS por mililitro. Decida sobre um volume final de DMM e adicione sacarose a uma concentração final de 2,5%Prepare as alíquotas desejadas. Girar uma única alíquota a 2.300 GS durante três a cinco minutos à temperatura ambiente.Avalie o tamanho do pellet e prepare vários volumes de alíquota para evitar o congelamento mais de uma vez. Para rotular as células antes do Eloqua watting. Use tampão de carbonato de sódio 0,1 molar para ressuspender um frasco de 10 miligramas de ZI a uma concentração de 2,5 miligramas por mililitro.Gire por uma hora em temperatura ambiente no escuro e gire na velocidade máxima por cinco minutos para granular os sólidos ZI restantes. Usando 10 mililitros de solução de lavagem três ou dmm, ressuspenda o pellet POS e adicione dois mililitros da solução Fite para 80 olhos. Use papel alumínio para proteger da luz e gire por pelo menos 1,5 horas.À temperatura ambiente. Use a solução de lavagem três para lavar as células duas vezes, conforme descrito anteriormente no vídeo, e depois DM EM uma a duas vezes até que quase nenhum ajuste livre seja visto no sobrenadante. Use DM EM para suspender novamente o POS e contar um quat semelhante ao POS não rotulado, como visto aqui.Ao manter os olhos e as amostras no escuro até depois da etapa de centrifugação, a proibição do gradiente de sacarose contendo POS pode ser imediatamente reconhecida por sua cor laranja brilhante. E se estiverem danificados, parecerão pedaços muito menores, um pouco como um fundo empoeirado. Normalmente, quando isolado adequadamente, o POS deve parecer alongado, reto ou dobrado.Quando observados ao microscópio, dependendo do plano de foco no microscópio, eles podem parecer escuros ou brilhantes. Se não forem ressuspensos corretamente, eles permanecerão em aglomerados. A POS isolada serve para testar diretamente a capacidade fagocítica das células RPE mutantes.Neste exemplo, a POS é prontamente fagocitada por células RPE primárias de camundongos do tipo selvagem, enquanto as células de beta cinco integrina e camundongos knockout MFG oito tito menos POS no mesmo período de tempo. A quantificação da fagocitose POS pode ser feita contando a POS marcada com FSE manualmente nas imagens do microscópio, medindo a intensidade da fluorescência ou por citometria de fluxo após a tripsina celular. Esta figura analisa o recrutamento de proteínas usando imunofluorescência, ensaios de colocalização e o recrutamento ou ativação de proteínas pode ser validado em bloqueios imunológicos após a imunoprecipitação ou verificando a fosforilação após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fagocitose mediada por fosfato seína explorarem e caracterizarem a maquinaria molecular nas células das pétalas pigmentares da retina e compararem os achados com outras células fagocíticas, como os macrófagos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, descrevemos uma técnica para isolar células epiteliais pigmentares da íris e da retina de olhos suínos para obter suas culturas primárias para estudos in vivo e ex vivo. Essas células pigmentares podem ser geneticamente modificadas para estudar abordagens regenerativas para tratar distúrbios oculares.

Isolamento de células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentadas de olho suíno isolado

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar as células epiteliais pigmentares da retina, ou EPR, e as células epiteliais pigmentares da íris, ou EIP, de olhos bovinos colhidos. As células isoladas podem ser cultivadas para estudar seu papel no tratamento de doenças oculares.

Isolando células RPE e IPE do olho bovino: um procedimento para colher e cultivar células epiteliais de pigmento primário bovino

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

Este protocolo descreve um modelo de acúmulo de lipofuscina em culturas altamente diferenciadas e polarizadas do epitélio pigmentado da retina humana (EPR) e um ensaio melhorado de fagocitose do segmento externo (EO) para detectar o consumo/capacidade de degradação total do EPR. Esses métodos superam as limitações de modelos anteriores de lipofuscina e ensaios clássicos de fagocitose do segmento externo de perseguição de pulso.

Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas

Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.

Isolamento de células epiteliais pigmentares primárias da retina suína para modelagem in vitro

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Aprenda a purificar segmentos externos de fotorreceptores de retina suína ou bovina usando ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método permite preparar grandes estoques para estudos de fagocitose em células epiteliais pigmentadas da retina.

Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal

Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

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