Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de uma cóclea embrionária retirada de um camundongo repórter fluorescente em intervalos de 30 minutos durante cinco dias. Isso é feito pela primeira colheita da cóclea embrionária do dia 13 de camundongos repórteres fluorescentes. Em seguida, a cóclea é cultivada in vitro.

Em seguida, as culturas de explicação coclear são colocadas em um microscópio de incubadora. Finalmente, uma rotina de imagem automatizada é configurada e a cóclea E é fotografada. Em última análise, a imagem de lapso de tempo de longo prazo de culturas de explanação coclear pode ser usada para mostrar movimentos morfogenéticos do epitélio coclear como um todo, bem como mudanças na expressão do gene repórter ao longo do tempo e os efeitos de agentes farmacológicos de ação lenta.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como fotografar manualmente as culturas de fundos X ao longo de um curso de tempo, é que esse sistema é totalmente automatizado. Ele permite que mais pontos de tempo sejam coletados e garante que a mesma região da cóclea ou conjunto de células seja visualizada na mesma orientação em todos os pontos de tempo, enquanto cresce em incubadora de cultura de tecidos irregulares. Depois de suplementar o meio de águia modificado de KO ou DMEM e a solução salina de equilíbrio de Hank ou HBSS de acordo com o protocolo de texto que o acompanha.

Sob uma capela de fluxo laminar, use cinco mililitros de DMEM suplementado para ressuspender, 200 microlitros de substrato de membrana basal pipeta 150 microlitros no centro de cada poço de 10 milímetros de uma placa de cultura com fundo de vidro de 35 milímetros de diâmetro. Incubar por 40 minutos em uma incubadora de CO2 a 35 graus Celsius. Para preparar a estação de trabalho e as ferramentas, ligue a bancada de limpeza de fluxo laminar e use etanol 70% para pulverizá-la e embeber pinças, colheres e um prato revestido de silicone preto.

Na estação de trabalho limpa, colha embriões da gestação apropriada no gelo. HBSS frio suplementado com 1% de pilhas. Usando um microscópio estereoscópico fluorescente, identifique os embriões que exibem atividade repórter externamente ou dentro de um órgão visível e transfira-os para HBSS fresco e gelado com 1% de pilhas para coletar ossos temporais, usando uma fonte de luz fria e pinças finas.

Trabalhe rapidamente para prender as vértebras cervicais e abaixo da mandíbula para coletar as cabeças. Depois de coletar as cabeças dos embriões de acordo com o protocolo de texto, abra cuidadosamente o crânio, remova a guarnição do cérebro da frente da cabeça e transfira a parte posterior do crânio para um prato com gelo fresco. Frio. HBSS montes, dissecar cuidadosamente os ossos temporais em forma de amendoim, tomando cuidado para manter o sistema vestibular intacto.

Para dissecar a cóclea, transfira os ossos temporais para um prato revestido de elastômero de silicone preto em pilhas de HBSS geladas. Prenda a região vestibular do osso inserindo pinos em um ângulo oblíquo para estabilizar o osso temporal e criar espaço para a pinça. Em seguida, remova cuidadosamente a cartilagem ao redor da cóclea, inserindo uma laço da pinça na cartilagem na borda externa da base da cóclea e cortando um orifício na cartilagem.

Prenda horizontalmente na parte superior e na diagonal e levante cuidadosamente a parte frontal da cápsula. Insira uma ponta da pinça entre a cartilagem restante e o ducto e corte suavemente a cartilagem restante. A superfície apical da cóclea está agora exposta.

Começando na base, pegue a área onde o teto do duto encontra o epitélio coclear e abra o ducto coclear. Retire cuidadosamente o corte do telhado quando necessário até que seja completamente removido. Apare todas as porções de membrana deixadas no lado medial do duto.

Em seguida, limpe o ducto do excesso de tecido mesenquimal e descole o ducto do sistema vestibular para os implantes de cultura. Coloque uma superfície luminal no centro de uma placa de cultura com fundo de vidro revestido com substrato. Retire cuidadosamente o líquido e deixe por dois minutos.

Em seguida, gota a gota. Adicione 150 microlitros de DMEM suplementado ao X explan, tomando cuidado para não perturbá-lo para que ele possa se depositar no substrato. Coloque os pratos com fundo de vidro em uma placa de Petri de 12 centímetros de diâmetro com um pequeno prato de água estéril para manter a umidade.

Coloque as culturas em uma incubadora de 35 graus Celsius durante a noite para que o explanador se prenda ao substrato e se achate para realizar imagens ao vivo. Após a seleção das amostras, use um microscópio estereoscópico fluorescente para avaliar a condição de cada cóclea explantada e selecione apenas explantes onde o ducto esteja intacto e conecte-se ao vidro da base ao ápice. Defina a incubadora a 35 graus Celsius com 5% de CO2 para cultura.

Tecido coclear aspire suavemente o DMEM suplementado das culturas e substitua-o por pelo menos 500 microlitros de um meio fresco. Nos casos em que o explan está frouxamente preso, pipete um anel de meio ao redor da borda do prato. Este líquido extra fará uma câmara umidificada em miniatura sem perturbar a explicação enquanto ela continua a se ligar à matriz.

O microscópio neste exemplo tem uma plataforma rotativa que contém 8 pratos de amostra de 35 milímetros sob a capa de fluxo laminar. Substitua as tampas de plástico por tampas de vidro e insira os pratos no suporte de prato de amostra. Se for necessário mudar a mídia durante o curso do experimento.

Para evitar perturbar o explicador, use tampas de prato articuladas que permitam a abertura das tampas enquanto o prato permanece em seu encaixe no microscópio, coloque o porta-prato de amostra dentro do microscópio da incubadora, tomando cuidado para não desalojar o explanador do fundo do prato ou perturbar o meio. Para configurar a rotina de imagem, ligue a lâmpada UV do microscópio e a câmera e abra o software de imagem. Para cada amostra localizada, escolha um plano de foco e exposição da área de imagem, tendo em mente não apenas a visão do explane no momento do início, mas também como o tecido se moverá durante a execução.

No canal de fluorescência, defina uma pilha Z centralizada em torno do plano focal selecionado. Em seguida, defina a frequência e a duração da amostragem para o experimento. Isso será limitado pelo tempo necessário para coletar imagens para gerar um filme no final de um período de lapso de tempo.

Use um software como o METAMORPH para abrir os arquivos de imagem de uma amostra quadro a quadro. Escolha o melhor plano focal para mostrar a população de células de interesse. Por fim, converta as imagens em um arquivo VI de ponto ou exporte-as como uma montagem para gerar um conjunto de imagens que podem ser abertas e analisadas em software de processamento de imagem ou convertidas para outros formatos.

Aqui é mostrado um filme que demonstra como um explanante coclear organotípico crescerá se for plaqueado. Em E 13.5, um camundongo repórter SOX foi usado para visualizar a região sensorial pros como vista em verde à medida que as células das regiões não sensoriais se dividem e se movem. A região sensorial não proliferativa em verde sofre rearranjos teciduais e movimentos convergentes de extensão.

Um segundo experimento de lapso de tempo centrado na base média de um explanante coclear diferente demonstra que, à medida que estende os prós. A região sensorial se estreita quando a primeira cultura é a primeira vez. A espessura do tecido torna possível identificar regiões de expressão, mas não células individuais.

No entanto, após três dias em cultura, o tecido se achatou consideravelmente, tornando possível visualizar células fluorescentes individuais após este procedimento. Outros métodos, como coloração imunofluorescente ou extração de proteínas e RNA, podem ser realizados para avaliar as mudanças na expressão gênica em nível molecular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar e cultivar a cóclea e como usar um microscópio incubador para realizar imagens ao vivo em todo o explan durante um período de dias.