Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

O objetivo geral deste procedimento é identificar potenciais reguladores-chave da auto-renovação e diferenciação de células EML de camundongos usando a tecnologia de sequenciamento de RNA. Isso é feito separando primeiro as células EML de linhagem negativa CD 34 positiva e de linhagem negativa CD 34 negativa com base em marcadores de superfície. O segundo passo é isolar o mRNA, converter o mRNA em cDNA e preparar a biblioteca para o sequenciamento.

Em seguida, a biblioteca de DNA é submetida a um sequenciamento de alto rendimento. A etapa final é analisar os resultados do sequenciamento e procurar fatores de transcrição diferencialmente expressos. Em última análise, a tecnologia de sequenciamento de RNA é usada para mostrar fatores de transcrição diferencialmente expressos em células EML de linhagem negativa CD 34 positiva e linha negativa de CD 34 negativa.

A principal vantagem do sequenciamento de RNA sobre outros métodos de expressão G prolene, como microray, é que ele tem maior sensibilidade, precisão e faixa dinâmica mais ampla, e não depende de informações de anotação de genes preexistentes. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo das células-tronco, como quais são os principais fatores de transcrição que regulam a auto-renovação e diferenciação celular. A implicação desta técnica se estende para onde a terapia da doença do sangue porque uma melhor compreensão do regulador-chave que controla as células precursoras hematopoiéticas, auto-renovação e diferenciação pode levar ao desenvolvimento de tratamentos eficazes.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque várias ferramentas de bioinformática são necessárias para a análise de sequenciamento. O rim de hamster bebê ou células BHK para coleta de fator de células-tronco são cultivados em meio dmem contendo 10% FBS em um frasco de 25 centímetros quadrados, a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Quando as células atingirem 80 a 90% de olhos de tripsina de confluência e coletá-los por centrifugação a 200 Gs por cinco minutos à temperatura ambiente, descartar o snat e ressuspender a paleta de células em 10 mililitros de meio de cultura de células BHK fresco.

Transfira dois mililitros da suspensão celular para um novo frasco de 75 centímetros quadrados por aplicativo e adicione 48 mililitros de cultura de células BHK frescas. Cultura do meio ao frasco. As células BHK por dois dias.

Após dois dias, recolher o meio de cultura e passá-lo por um filtro de ponto 45 micrómetros. Armazene o meio a 20 graus Celsius negativos. As células eritróides, mieloides e linfocíticas ou EML de camundongo usadas neste protocolo são cultivadas em suspensão em meio básico EML contendo meio de cultura de células BHK a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Mantenha as células EML em baixa densidade celular com uma densidade de pico inferior a 600.000 células por mililitro. Divida as células a cada dois ou três dias em uma proporção de uma a cinco passagens para as células suavemente, mas por não mais de 10 gerações para esgotar as células positivas da linhagem. Colha as células EML por centrifugação a 200 Gs por cinco minutos.

Lave as células uma vez com PBS e centrifugue novamente depois de descartar o sobrenadante. Suspenda novamente as células em PBS e conte as células com um hemocitômetro. O número de células é necessário para determinar a concentração de anticorpos na etapa subsequente.

Isole as células de linhagem negativa ou linha negativa usando um coquetel de anticorpos de linhagem e um sistema de classificação de células ativadas por magnetismo de acordo com as instruções do fabricante. Para iniciar este procedimento, gire as células negativas a 200 Gs por cinco minutos. Ressuspenda o pellet celular com PBS e conte as células com um hemocitômetro.

Lave as células duas vezes com tampão de fax. Após a segunda lavagem, esfolar as células a 200 Gs por cinco minutos. Rotule os cinco tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitro com os números 1, 2, 3, 4 e cinco, respectivamente.

Ressuspenda as células com um volume apropriado de tampão de fatos para uma concentração de 1 milhão de células por 100 microlitros. Em seguida, alíquota de 100 microlitros de suspensão de células para cada um dos cinco tubos de microcentrífuga. Adicione um micrograma de anticorpo anti-camundongo CD 34 FE ao tubo um e ao tubo dois.

Misture os tubos e incube suavemente todos os tubos a quatro graus Celsius por uma hora no escuro. Em seguida, adicione 25 microgramas de antica conjugado com PE, um anticorpo e 20 microlitros de uma linhagem conjugada PC. Coquetel de anticorpos para dois um, adicione 25 microgramas de anticorpo conjugado PE um ao tubo três e 20 microlitros de uma linhagem conjugada PC.

Anticorpos de coquetel para o tubo quatro. Misture os tubos suavemente e incube as células a quatro graus Celsius por mais 30 minutos no escuro. Após 30 minutos, adicione 300 microlitros de tampão de fax a todos os tubos e gire as células a 200 Gs por cinco minutos.

Lave as células três vezes com 500 microlitros de tampão de fax após a lavagem final. Resus suspende cada pellet celular em 500 microlitros de fax buffer isolate lin negativo SCA positivo CD 34 positivo e lin negativo SCA negativo CD 34 células negativas no tubo um por classificação de células ativadas por fluorescência. O RNA total é extraído das células lin negativo CD 34 positivo e lin negativo CD 34 negativo usando triol e o DNA contaminado é removido usando desoxirribo nuclease um.

Seguindo o protocolo do fabricante, avalie a qualidade do RNA total usando um bioanalisador seguindo as instruções do fabricante, apenas amostras de RNA com um número de integridade de RNA ou RIN superior a nove são usadas para extração de mRNA e procedimentos subsequentes de construção de bibliotecas. Esta figura mostra o resultado de uma amostra de RNA de alta qualidade com um RIN igual a 9,4. O protocolo de construção de biblioteca usado aqui é específico para a plataforma de sequenciamento de RNA Illumina e utiliza um kit de preparação de amostra de RNA.

Siga as instruções fornecidas pelo fabricante, pois apenas as etapas selecionadas são mostradas neste vídeo. Comece selecionando positivamente poli MNA usando esferas magnéticas oligo DT. Em seguida, fragmente o poli mRNA e execute a transcrição reversa usando primers aleatórios para converter o mRNA em CD NA. Posteriormente, a segunda fita sintetizada CD NA é usada para gerar DNA de fita dupla.

Em seguida, as três saliências principais são removidas e as cinco saliências principais são preenchidas por DNA polimerase As três extremidades principais dos fragmentos de CD NA de ligação umas às outras. Adicione adaptadores de indexação multiplex a ambas as extremidades do CD NA de fita dupla para sequenciamento.

Finalmente, realizar PCR para o enriquecimento do CD NA para fragmentos usando um espectrofotômetro medir a absorbância dois 60 sobre absorbância dois 80 do DNA amplificado. Para obter informações sobre a concentração da biblioteca, avalie a qualidade da biblioteca e meça a faixa de tamanho dos fragmentos de DNA usando um bioanalisador. Os métodos para análise de dados de sequenciamento de RNA são encontrados no texto do protocolo que acompanha e incluem processamento de arquivos de dados para análise downstream, detecção de novos transcritos e avaliação do nível de expressão, detecção de genes diferencialmente expressos e identificação de fatores de transcrição diferencialmente expressos.

As células EML de linhagem negativa foram coradas com anticorpos anti CD 34 antica one e coquetel de linhagem e lca negativa para crânio CD 34 positivo e lca negativa para lin. As células negativas do CD 34 foram separadas usando apenas a classificação de células ativadas por fluorescência. As células Lin negativas foram fechadas para análise da expressão de SCA one e CD 34.

Duas populações de células EML foram observadas quando a construção da biblioteca foi concluída. O tamanho dos fragmentos de DNA na biblioteca foi verificado usando um bioanalisador. Esses dados representativos mostram uma biblioteca de boa qualidade, mas o tamanho do fragmento atinge um pico de cerca de 300 pares de bases.

O algoritmo D-E-S-E-Q foi usado para análise de expressão diferencial com foco em fatores de transcrição diferencialmente expressos, pois os fatores de transcrição são cruciais para a determinação do sulfato. Fatores de transcrição que mudam mais de 1,5 vezes entre lin negativo CD 34 positivo e lin negativo CD 34 negativo foram encontrados e são mostrados neste mapa de calor. Notavelmente, o nível de expressão relativa de TCF sete em células lin negativas para CD 34 positivas é mais de 100 vezes maior do que em células lin negativas para CD 34 negativos.

Assim, o TCF seven foi escolhido para análise adicional de imunoprecipitação e sequenciamento da cromatina e testes funcionais para confirmar sua função na regulação da auto-renovação e diferenciação em células EML. Uma vez dominado, a biblioteca de RNA pode ser concluída em poucos dias e todo o procedimento pode ser concluído em cerca de um mês se for realizado corretamente após seu desenvolvimento. Essa tecnologia abriu caminho para pesquisadores que desejam explorar diferencialmente a expressão gênica entre diversos tipos de células e tecidos, como células B e células B malignas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar CAR TRNA alto porque é a base de todo o procedimento de RNA doente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como identificar os principais reguladores que controlam a renovação e diferenciação das células EML.