Use Synergetic de células neuronais precursoras e Peptídeos de auto-montagem em Experimental Cervical Spinal Cord Injury

O objetivo geral deste procedimento é introduzir um modelo de clipe de compressão de contusão de LME cervical em ratos e um protocolo para tratamento combinado envolvendo injeção de SAP e transplante de NPC. Primeiro, um clipe de aneurisma é colocado ao redor da medula espinhal e mantido no lugar por um minuto. Isso resulta em uma lesão por compressão de contusão bilateral.

Em seguida, os SAPs são injetados no epicentro da lesão, os NPCs são injetados imediatamente após a injeção de SAP. Uma bomba osmótica com um cateter subdural é inserida para a administração sustentada de fatores de crescimento. Este procedimento resulta na entrega de NPCs à medula espinhal lesionada.

A sobrevivência e o enxerto de NPCs são apoiados por tratamento combinatório com SAPs e fatores de crescimento. As implicações desta técnica se estendem a uma terapia para lesão traumática da medula espinhal porque fornece um modelo clinicamente relevante que pode ser usado para estudar terapias COMBINATOR baseadas em células que promovem a regeneração da medula espinhal. O seguinte protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da University Health Network, Toronto, Canadá, e está de acordo com as políticas estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais experimentais elaborado pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados em condições estéreis usando equipamentos e soluções estéreis e, de acordo com as diretrizes da instituição e do governo, esse procedimento usa ratos pesando 250 a 270 gramas antes de iniciar o procedimento. Forneça antibióticos aos animais na água de beber por dois dias no dia do procedimento. Depois de colocar o rato em uma câmara de anestesia e induzir a anestesia com flúor ISO 5% em oxigênio um a um e óxido nitroso por um minuto, reduza o flúor ISO para 1,8 a 2,2% Aplique a pomada lambic nos olhos e confirme a anestesia cirúrgica realizando um beliscão na pata.

Em seguida, coloque o rato em uma almofada aquecida e fixe a cabeça em uma estrutura estereotáxica com um cone de nariz. Depois de raspar o pelo ao redor da coluna cervical, desinfete a pele esfregando com iodo povidona, seguido de etanol a 70% após fazer uma incisão na linha média da região das duas vértebras cervicais C até o processo proeminente do corpo vertebral torácico T dois. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a camada externa dos músculos vertebrais diretamente na linha média na direção do crânio, use uma tesoura cirúrgica para dissecar as camadas musculares mais profundas até que o processáculo, a ose e o laminado sejam alcançados.

Insira os transferidores e segure. Abra as camadas musculares, oriente a posição proeminente do processo do corpo das duas vértebras T e identifique os níveis alvo para laminectomia. Em seguida, use um bisturi número 15 para cortar o flay ligamentar para soltar o lábio e a postura do processo.

Em seguida, use um cortador de osso para cortar o lábio lateral à medula espinhal e remova suavemente o lábio sem comprimir a medula espinhal. Agora reserve um momento para identificar as raízes nervosas emergentes para poupá-las de se cortar. Em seguida, use um gancho para soltar a dura-máter ventral do lado dorsal dos corpos vertebrais e prepare um corredor para o clipe.

Certifique-se de que a mola do anel do clipe esteja ajustada para fornecer a força desejada. A força do clipe determina a extensão do trauma e da compressão. Insira o clipe aberto ao redor da medula espinhal e deixe-o fechar para induzir uma lesão por contusão.

Forças de clipe entre 15 e 35 gramas são frequentemente usadas com uma duração de clipping de um minuto após a lesão da medula espinhal ter sido realizada. Remova o clipe e feche os músculos em duas camadas, seguido pelo fechamento da pele. Assim que a ferida estiver devidamente fechada, interrompa a anestesia e observe o rato enquanto ele acorda.

Depois que o animal recuperou a consciência suficiente para o esterno, reclinado, coloque o rato em uma gaiola limpa. Devido à gravidade desse tipo de lesão, é imperativo que os seguintes tratamentos pós-operatórios sejam seguidos. Primeiro, certifique-se de administrar analgésicos como buprenorfina e meloxicam por três a cinco dias, dependendo dos sintomas.

Evite também a desidratação por via subcutânea. Injetar de cinco a 10 mililitros de solução salina duas vezes ao dia durante três dias e continuar a fornecer antibióticos na água potável por cinco dias. Pós-operatório. Aperte a bexiga urinária duas a três vezes ao dia até que a recuperação consistente da função da bexiga seja aparente, mesmo depois que os animais parecerem recuperados.

Certifique-se de observar os animais operados quanto a déficits neurológicos e condição fisiológica. A injeção é realizada 14 dias após a lesão da medula espinhal. Antes de iniciar a cirurgia, prepare os SAPs na concentração de 1% de peso por volume em água estéril e encha um capilar de vidro de 100 micrômetros conectado a uma seringa de Hamilton.

Com a solução, encaixe a seringa Hamilton na estrutura estereotáxica. Após a anestesia, o rato fixa a cabeça na estrutura estereotáxica e desinfeta o local da cirurgia com iodopovidona e álcool a 70%. Como antes, mais uma vez, depois de abrir a pele, disseque cuidadosamente o par de músculos vertebrais e insira afastadores.

Use um bisturi número 15 para remover o tecido cicatricial da dura-máter e reexpor o local da lesão. Em seguida, use a ponta de uma agulha afiada para abrir a dura-máter com cuidado. Finalmente, estereotaxialmente, insira o capilar de vidro a uma profundidade de dois milímetros na medula espinhal traumatizada e injete os SAPs.

Após a injeção dos SAPs, deixe o capilar permanecer no local da injeção por um minuto antes da remoção para permitir o alongamento do tecido para acomodar a solução injetada. Em seguida, repita a injeção no próximo local. Aqui, NPCs, foram isolados da zona paraventricular de um camundongo vermelho DS adulto e cultivados de acordo com procedimentos publicados anteriormente.

Pouco antes da microinjeção, dilua os NPCs em meio de crescimento a uma concentração de 50 vezes 10 elevado a um terço de células vivas por microlitro para transplante de células e carregue em um capilar de vidro em uma seringa Hamilton. Os NPCs são injetados imediatamente após a injeção de SAPs. Para isso, insira o capilar de vidro da seringa de Hamilton a 0,2 milímetros rostral do local da lesão e 1,5 milímetros abaixo da superfície dorsal da medula espinhal.

Injete dois microlitros da suspensão celular a uma taxa de cerca de 0,5 microlitros por minuto. Após a conclusão da primeira injeção, deixe o capilar permanecer na medula espinhal por um minuto como antes, depois retraia o capilar, mova-o para um local adjacente e repita o procedimento de injeção. Depois de esperar um minuto, como antes, retraia o capilar e mova-o dois milímetros até o local da lesão.

Realize duas injeções de dois microlitros neste local. Esta imagem mostra todos os locais de injeção relativos à lesão da medula espinhal. A implantação de mini bombas osmóticas subdurais para suporte do fator de crescimento é realizada imediatamente após as injeções de NPC.

Primeiro escolha um local de implantação. Os locais preferidos são os flancos laterais da região toracoabdominal para evitar o desconforto causado pela própria bomba. Após a desinfecção da região, como antes, é preparado um recesso subcutâneo para a bomba.

Em seguida, execute uma laminectomia salta das vértebras superiores ou inferiores adjacentes à lesão da medula espinhal. Aqui, a lesão medular foi realizada em C sete T um, e assim a laminectomia é realizada em C cinco. Agora coloque a bomba no recesso subcutâneo, corte o cateter no comprimento necessário e, finalmente, use suturas 6.0 para prendê-lo ao par de músculos vertebrais.

Evitando qualquer luxação associada ao movimento. Use a ponta de uma agulha afiada para abrir a dura-máter abaixo da laminectomia. Em seguida, introduza o cateter no espaço subdural e deixe-o deslizar na direção do mimo, sem resistência e sem ferir o cordão.

Agora, verifique se o cateter funciona sem problemas e não tem dobras ou dobras, conforme mostrado aqui. Em seguida, feche os músculos camada por camada usando suturas ou clipes e, em seguida, feche a pele. Uma vez que a ferida esteja devidamente fechada, pare a anestesia e observe o animal enquanto ele acorda.

Depois que o animal recuperar a consciência suficiente para o esterno reclinado, coloque o rato em uma gaiola limpa. Certifique-se de seguir todos os procedimentos de tratamento pós-operatório, incluindo monitoramento do animal e analgesia pós-cirúrgica. Administre o tratamento de imunossupressão dois dias antes da injeção de NPC e até sete dias após o transplante e até o sacrifício, respectivamente.

Esta imagem de microscopia de fluorescência mostra uma seção longitudinal de uma medula espinhal traumatizada de um rato. A coloração é DPI fluorescência SAPs marcados com QL seis. Os fite aparecem verdes e se agregam no epicentro da lesão.

Os NPCs vermelhos positivos DS injetados se difundiram nas direções rostral e coddle indicadas pela fluorescência vermelha. A barra de escala representa cinco milímetros. Aqui, uma imagem de microscópio eletrônico de varredura mostra a formação de andaimes de nanofibras de SAPs montados.

A barra de escala representa um micrômetro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão dos procedimentos cirúrgicos envolvidos na compressão do clipe, SCE e como a abordagem promissora do tratamento combinado com SAPs e NPCs pode ser estudada neste modelo.