Name: Use Synergetic de células neuronais precursoras e Peptídeos de auto-montagem em Experimental Cervical Spinal Cord Injury (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda a tratar lesão medular cervical combinando peptídeos de auto-montagem e células neuronais precursoras em modelo de ratos. Este método promove regeneração neural e recuperação funcional após trauma.

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Gostaríamos de agradecer o apoio de financiamento para este trabalho a partir do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a Fundação Krembil Família, o Presidente Halbert em Neural Repair and Regeneration, Phillip e Peggy DeZwirek, e Gordon Yao para a contribuição para a Figura 2 . Klaus Zweckberger foi financiado por uma doação da &quot;Deutsche Forschungsgesellschaft&quot; (DFG).

Nota: Os seguintes protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais da University Health Network (Toronto, Canadá) e está em conformidade com as políticas estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de experimentação preparado pelo Conselho Canadense de cuidados com os animais . 1. Cervical Aneurysm Clipe Contusão / Compression Modelo <ol><li> Antes de instrumentos e autoclave cirurgia manter condições estéreis durante todo o procedimento surgcial, colocando os instrumentos em um banho de álcool a 70%. </li><li> Anestesiar ratos machos Wistar (250-270 g) com uma combinação de oxigénio (O2), óxido nitroso (N2O) (1: 1), e 1,8-2,2% de isoflurano e suportar a respiração espontânea, através de uma máscara de anestesia de gás. Para a indução de anestesia começar com 5% de isoflurano durante 1 minuto e depois reduzir. Antes de iniciar a cirurgia, a profundidade da anestesia controle, dando um estímulo doloroso (ex. Nas patas). Aplicar pomadas gordasnos olhos para evitar a secura e a prevenção de infecções subsequentes. </li><li> Coloque os ratos sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C) e fixar a cabeça em um quadro estereotáxico. </li><li> Raspar a região cirúrgica ao redor da coluna cervical e desinfectar com iodopovidona e 70% de álcool. </li><li> Faça uma incisão na linha média acima da espinha da vértebra cervical (C2) chegando ao processus proeminente do corpo vertebral torácica 2 (T2). </li><li> Corte através da camada externa dos músculos da coluna diretamente na linha média (para evitar o sangramento) no sentido crânio-caudal e mais dissecar as camadas musculares mais profundas sem rodeios até chegar ao spinosus processus e as lâminas. Insira afastadores. </li><li> Orientar o proeminente spinosus processus do T2 corpo vértebra para observar os níveis direcionados para laminectomy. Após a identificação e preparação de micro-cirúrgica das lâminas selecionado, cortar o flavae ligamenti para soltar a lâmina e do spinosus processus. Finalmente, cut através das lâminas com um cortador de osso de lateral para a medula espinhal e remover aqueles suave, evitando qualquer compressão da medula espinhal em si. NOTA: O mais comum são os níveis C5 / 6, C6 / 7, ou C7 / T1. A taxa de mortalidade peri-operatória aumenta o mais rostral do nível da lesão. Sangramento do seio venoso paravertebral é comum e pode ser abordada por compressão cuidado com esponja. </li><li> Antes de inserir o clipe para traumatizar a cabo, identificar emergente raízes nervosas para poupá-los a partir de recorte (especialmente a nível C5 / 6). </li><li> A fim de garantir a indução grampo liso, soltar a dura-máter do lado ventral dorsal dos corpos vertebrais com um gancho e preparar um corredor para o grampo. </li><li> Finalmente, insira o clipe aberto e deixá-lo tirar fechada (fechamento rápido) para alcançar uma contusão. Clipe força de fecho e duração de encerramento clipe determinar a intensidade do trauma e o grau de compressão. Comumente usado são forças clipe de entre 15-35 g e um clippiduração ng de por exemplo 1 min. (Figura 1). </li><li> Após a remoção do clipe, adaptar-se os músculos em duas camadas e fechar a ferida. </li><li> Pare de anestesia e deixar o rastro dos animais sob sua observação contínua até que ele recupere a consciência suficiente para decúbito esternal. Por último, coloque o rato em uma gaiola individual e siga as diretrizes de tratamento pós-operatório. </li><li> Dado que os animais lutam com a gravidade deste tipo de lesão, você deve prestar atenção especial para tratamentos pós-operatórios: <ol><li> Administrar analgésicos (buprenorfina e meloxicam durante 3 dias e 5 dias, respectivamente, e de acordo com os sintomas clínicos). </li><li> Dê subcutaneamente solução salina adicional durante 3 dias (2 vezes por dia, 5-10 mililitros (ml)). </li><li> Fornecer antibióticos em água potável 2 dias antes e até sete dias após a cirurgia (por exemplo, moxifloxacina) </li><li> Aperte a bexiga urinária 2-3 vezes ao dia até que a recuperação da função da bexiga é constantely aparente. </li><li> Observe déficits neurológicos e condição fisiológica dos animais operados pelo menos uma vez por dia. </li></ol></li></ol> 2. A injeção de SAPs e NPCs (14 dias após a lesão) <ol><li> Induzir a anestesia, conforme descrito no item 1.1. para 1,3, fixar a cabeça do rato em um quadro estereotáxico, retirar os pontos ou clipes de feridas, e desinfectar a ferida e a área cirúrgica com iodopovidona e 70% de álcool. </li><li> Dissecar cuidadosamente os músculos paravertebrais, insira afastadores, remover o tecido cicatricial microscopicamente da dura-máter, e re-expor o local da lesão. </li><li> Prepare SAPs em uma concentração de 1% (w / v) para executar um gel de matriz extracelular. SAPs QL6 tem um pH fisiologicamente compatível e não precisam de ser tamponada, antes da injecção. Para a visualização de PAE na medula espinhal, usar um derivado fluorescente de QL6 (QL6-FITC). </li><li> Injectar SAPs (5 microlitros (ul) para o centro da lesão, distribuídos em duas porções, cada2,5 ul bilateral da linha média. Usando uma seringa de Hamilton ligada à armação estereotáxica com um micro capilar de vidro (100 micrómetros (um) de diâmetro externo (OD)). Abra a dura-máter cuidadosamente com a ponta de uma agulha afiada, e inserir o tubo capilar de vidro estereotaxicamente 2 milímetros (mm) para a medula espinhal traumatizado. </li><li> Após a injecção de 1/3 do volume, remover a agulha a uma profundidade 1,5 mm, e após mais 1/3 a 1 mm. Após a injecção de todo o volume, e antes da remoção da seringa, esperar 5 minutos para estabilizar a formação de gel. </li><li> Para gerar NPCs, use camundongos adultos DsRed (ou YFP camundongos positivos, verde) e isolar e cultivar-los da zona paraventrical 4,18,21. </li><li> Avaliar a viabilidade de NPCs por coloração com azul de tripano, indicando a presença de ~ 90% de células vivas na suspensão de células. Diluir as células em meio de crescimento (50 x 103 células vivas / l) e, em seguida, usá-los para o transplante de células. </li><li> Faça quatro 2 ul (8 ul vo total delume, contendo 4 x 10 5 NPCs) injeções intra-espinhal bilateralmente a 2 mm rostral e caudal do local da lesão. Após a abertura da dura-máter, inserir o micro capilar de vidro Hamilton 1,5 milímetros abaixo da superfície dorsal da medula espinal e injectar 2 ul de suspensão de células. Escolha uma velocidade de injecção de cerca de 0,5 ul / min (min). </li><li> No final de cada injecção e antes da remoção do capilar para fora do cabo, para esperar pelo menos 1 min permitir que o tecido estica para acomodar o volume da célula nova. (Figura 2) </li></ol> 3. Implantação de subdural Bombas para Growth Factor Aplicação <ol><li> A fim de enriquecer o cerebral fluido espinhal (CSF) com fatores de crescimento apoiando a sobrevivência da célula, use bombas de micro-osmótica diluindo fatores de crescimento sub-durally ao longo de 7-14 dias, com uma taxa de diluição de 0,5 l / h, um diâmetro de 0,04 cateter cm OD, e um volume do reservatório de 100 ul. </li><li> Escolha factores de crescimento preferidos(Por exemplo, factor de crescimento derivado do cérebro (BDGF), o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF)), encher as bombas de 6-10 horas antes da implantação, bombas e equilibrar num banho de água a 37 ° C. </li><li> Imediatamente após injeções NPC, preparar um recesso subcutânea para colocar a bomba. Locais preferidos são os flancos laterais da toracotomia região abdominal evitar maior desconforto local provocada pela própria bomba. </li><li> Para ganhar a maior concentração de fatores de crescimento, garantir que a ponta do cateter aberto termina próximo ao local da lesão. Portanto, executar um salto-laminectomy do nível superior ou inferior adjacente. Por exemplo, se o SCI é a C7 / T1, realizar uma pequena laminectomia de C5. </li><li> Coloque a bomba no recesso subcutânea, encurtar o cateter com o comprimento necessário, e prenda-o com várias suturas (6.0) nos músculos paravertebrais evitando qualquer luxação associada à circulação. </li><li> Após abertura da dura (por exemplo, em C5) com a ponta afiadade uma agulha, introduzir o cateter no espaço subdural e deixá-lo deslizar em direção caudal, sem qualquer resistência e sem ferir o cabo. A lâmina pulada de eg C6 serve como ponto adicional de fixação e estabilização do cateter. </li><li> Certifique-se de que o cateter corra bem e não se dobra. </li><li> Fechar músculos por camada, e pele, com suturas ou grampos. (Figura 3) </li><li> Pare de anestesia e deixar o rastro dos animais sob sua observação contínua até que ele recupere a consciência suficiente para decúbito esternal. Por fim, colocá-los de volta em uma única gaiola e siga as diretrizes de tratamento pós-operatório. </li><li> Fornecer tratamento pós-operatório especial, embora, os animais poderiam ter recuperado parcialmente a este ponto-time: <ol><li> Administrar analgésicos (Buprenorthine e meloxicam durante 3 dias e 5 dias, respectivamente, e de acordo com os sintomas clínicos). </li><li> Fornecer antibióticos em garrafas de água até 2 dias antes7 dias pós-cirurgia (por exemplo, moxifloxacina). </li><li> Continue apertando a bexiga urinária, se ainda for necessário. </li><li> Dê fluidos por via subcutânea adicionais, se os ratos aparecem desidratado. </li><li> Mantenha observando a função neurológica e estado fisiológico dos animais operados pelo menos uma vez por dia. </li><li> Administrar tratamento de imunossupressão dois dias antes da injecção NPC e até 7 dias após o transplante (minociclina) e até o sacrifício (Sandimmune), respectivamente. </li></ol></li></ol> Avaliação 4. Tissue <ol><li> Sacrificar os animais no final do período de observação (por exemplo. 4 semanas após a SCI) em anestesia profunda (5% de isoflurano durante 2-3 min) e perfundir-los transcardíaca com 50 ml de solução salina fria (4 ° C), seguido por 150 ml de 4 frias % de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Remover a medula espinhal e colocá-lo em 4% de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 24 horas. </li><li&gt; Coloque as medulas espinais em solução de sacarose a 25% para crioprotecção durante 48 horas. </li><li> Fornecer criocortes longitudinais com uma espessura de &lt;30 um. </li><li> Para coloração imuno-histoquímica de todos os núcleos de células-proporcionando um uso do fundo DAPI (1: 1.000). DsRed NPCs positivos aparecem em vermelho, QL-6 FITC aparece verde, e ambos, portanto, não precisa de ser marcadas especialmente. (Figura 4). </li><li> Para a microscopia eletrônica de varredura (SEM) deixe amostras de molho em glutaraldeído a 4 ° C, durante 2 horas, desidratam-los lentamente em passos de 10% de incremento de etanol durante 5 minutos e coloque-os em um pressurizado líquido CO 2 sifão para a 1 hora. Scaffolds revestimento com ouro usando um revestidor por crepitação. Tire fotos com a Hitachi S-3400N microscópio eletrônico de varredura. (Figura 5) </li></ol>

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A Covidien forneceu o QL6 SAP para este estudo.

Este protocolo foi desenvolvido para permitir que o leitor para realizar um modelo de lesão cervical em ratos e usar uma abordagem de tratamento combinado com SAPs e NPCs que promovem uma melhor recuperação após SCI cervical. Particularmente em relação a outros modelos de trauma cervical, como o (hemi) -transection modelo ou os modelos de queda de peso e de concussão, o modelo clipe contusão / compressão representa tanto importantes mecanismos de trauma fisiopatológicos - portanto, imita mel...

Mais de 50% das lesões da medula espinal estão relacionadas com a coluna cervical. Na clínica definindo dois principais mecanismos patofisiológicos são descritos: a contusão inicial da espinal medula e, subsequentemente, a compressão permanente causada por fracturas ósseas, hemorragias ou inchaço dos tecidos. O clipe de aneurisma imita contusão modelo / compressão ambos os mecanismos fisiopatológicos: tirando o clipe cria uma contusão e a duração do recorte representa o componente de compressão, admitindo que a compressão em clínicas causadas por fraturas ósseas, hemorragias ou inchaço dos tecidos última significativamente maior. O clipe de aneurisma utilizado é modificado por uma mola anel garantindo força exata e reprodutível recorte. Especialmente em comparação com o hemi-transection ou o modelo de contusão, este clip de aneurisma imita modelo melhores ambientes clínicos. Enquanto pacientes com lesões torácicas sofrem de paraplegia, a maioria dos pacientes com lesão cervicaluries são tetraplégica e completamente dependente. A estrutura anatômica do cordão cervical, no entanto, apresenta diferenças significativas em relação à coluna vertebral torácica ou lombar e, portanto, é dirigida em particular neste protocolo. O desenvolvimento de cavidades intramedulares e tecido cicatricial são obstáculos para a recuperação e regeneração. Para superar estes obstáculos à utilização de material de andaime é uma abordagem promissora. Péptidos de auto-montagem pode ser injectado directamente no epicentro da lesão. Lá eles se reúnem em andaimes nano-fibras ponte da cavidade e melhorar o ambiente inibitório, reduzindo a inflamação e cicatrização de tecidos. Enquanto materiais rígidos causar danos consideráveis ​​da medula espinhal durante a implantação, os péptidos de fluido podem ser injectados com segurança e sem causar danos adicionais grave. Melhorar o ambiente inibitório com peptídeos de auto-montagem antes do transplante de células-tronco, assim, apoiar a célula integração, diferenciação e, finalmente, a recuperação funcional após a lesão da medula espinal cervical.

<table><tbody><tr><td>Clipes aneurismáticos</td><td>SharpTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinjeção</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparelho estereotáxico para pequenos animais</td><td>David Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bombas subdurais</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Bomba micro-osmótica Alzet 1007D</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento cirúrgico</td><td>Fine Science tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução injetável de cloreto de sódio 0,9% USP</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidona-iodo 7,5%</td><td>Purdue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico 70% USP</td><td>GreenField Ethanol Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QL6 SAP</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano 0,4%</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos (FGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

use synergetic de células neuronais precursoras e peptídeos de auto-montagem em experimental cervical spinal cord injury

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Traumatismos da medula espinal (SCI) causar lesão neurológica grave e consequências psicológicas, econômicas e sociais para os pacientes e suas famílias. Clinicamente, mais de 50% da SCI afecta a coluna cervical 1. Como uma consequência da lesão primária, uma cascata de mecanismos secundários, incluindo a inflamação, a apoptose, e desmielinização ocorrem finalmente levando a cicatrização de tecidos e de desenvolvimento de cavidades intramedulares 2,3. Ambos representam barreiras físicas e químicas para o transplante de células, integração e regeneração. Portanto, moldar o ambiente inibitório e colmatar cavidades para criar um ambiente favorável para o transplante de células e regeneração é um alvo terapêutico promissor 4. Aqui, um modelo de contusão / compressão de SCI cervical usando um clipe de aneurisma é descrito. Este modelo é mais clinicamente relevantes do que outros modelos experimentais, uma vez que transection ou rupturas do cabo completo são raros. Também em COMPARAÇÃOn para o modelo de queda de peso, o que, em particular, as colunas danos no dorso, compressão circunferencial da medula espinal é vantajoso. Clipe força de fecho e tempo de exposição pode ser ajustada para atingir diferente gravidade da lesão. Uma mola anel facilita a calibração precisa e constância da força clip. Em condições fisiológicas, peptídeos auto-montagem sintéticos (SAP) de auto-montar em nanofibras e assim, estão apelando para aplicação em SCI 5. Eles podem ser injectados directamente na lesão minimizando os danos ao cabo. SAPs são estruturas biocompatíveis erguer andaimes para colmatar cavidades intramedulares e, portanto, equipar o cabo danificado por tratamentos regenerativos. K2 (QL) 6K2 (QL6) é um romance SAP introduzido por Dong et a l. 6 Em comparação com outros peptídeos, QL6 auto-monta em β-folhas de pH neutro 6 0,14 dias após a LM, após a fase aguda, SAPs são injectadas no centro da lesão e as células precursoras neurais (NPC) são injected em colunas dorsais adjacentes. A fim de suportar a sobrevivência de células, o transplante é combinado com a administração subdural contínua de factores de crescimento de micro-bombas osmóticas durante 7 dias.

Ao executar o procedimento acima descrito, irá obter um andaime SAP colmatar a cavidade e que oferece uma melhoria do ambiente inibitório, menos tecido cicatricial, e um aumento na sobrevivência NPC. A Figura 4 mostra uma secção longitudinal de uma medula espinal de rato obtido no local da lesão 6 semanas após SCI e 4 semanas após a injeção QL6 SAP e transplante NPC. Peptídeos QL6 foram injetados com êxito ao cabo, agregadas no epicentro e difusa rostro-caudal na penumbra. Microscópio Eletrônico de imag...

O tratamento da lesão medular cervical com peptídeos de automontagem (SAP) e células precursoras neurais (NPC), juntamente com fatores de crescimento, é uma abordagem promissora para promover a regeneração e a recuperação. Um modelo de rato clipe de aneurisma de contusão/compressão de SCI cervical e tratamento combinado envolvendo injeção de SAP e transplante de NPC é estabelecido.

Use Synergetic de células neuronais precursoras e Peptídeos de auto-montagem em Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir um modelo de clipe de compressão de contusão de LME cervical em ratos e um protocolo para tratamento combinado envolvendo injeção de SAP e transplante de NPC. Primeiro, um clipe de aneurisma é colocado ao redor da medula espinhal e mantido no lugar por um minuto. Isso resulta em uma lesão por compressão de contusão bilateral.Em seguida, os SAPs são injetados no epicentro da lesão, os NPCs são injetados imediatamente após a injeção de SAP. Uma bomba osmótica com um cateter subdural é inserida para a administração sustentada de fatores de crescimento. Este procedimento resulta na entrega de NPCs à medula espinhal lesionada.A sobrevivência e o enxerto de NPCs são apoiados por tratamento combinatório com SAPs e fatores de crescimento. As implicações desta técnica se estendem a uma terapia para lesão traumática da medula espinhal porque fornece um modelo clinicamente relevante que pode ser usado para estudar terapias COMBINATOR baseadas em células que promovem a regeneração da medula espinhal. O seguinte protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da University Health Network, Toronto, Canadá, e está de acordo com as políticas estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais experimentais elaborado pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados em condições estéreis usando equipamentos e soluções estéreis e, de acordo com as diretrizes da instituição e do governo, esse procedimento usa ratos pesando 250 a 270 gramas antes de iniciar o procedimento. Forneça antibióticos aos animais na água de beber por dois dias no dia do procedimento. Depois de colocar o rato em uma câmara de anestesia e induzir a anestesia com flúor ISO 5% em oxigênio um a um e óxido nitroso por um minuto, reduza o flúor ISO para 1,8 a 2,2% Aplique a pomada lambic nos olhos e confirme a anestesia cirúrgica realizando um beliscão na pata.Em seguida, coloque o rato em uma almofada aquecida e fixe a cabeça em uma estrutura estereotáxica com um cone de nariz. Depois de raspar o pelo ao redor da coluna cervical, desinfete a pele esfregando com iodo povidona, seguido de etanol a 70% após fazer uma incisão na linha média da região das duas vértebras cervicais C até o processo proeminente do corpo vertebral torácico T dois. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a camada externa dos músculos vertebrais diretamente na linha média na direção do crânio, use uma tesoura cirúrgica para dissecar as camadas musculares mais profundas até que o processáculo, a ose e o laminado sejam alcançados.Insira os transferidores e segure. Abra as camadas musculares, oriente a posição proeminente do processo do corpo das duas vértebras T e identifique os níveis alvo para laminectomia. Em seguida, use um bisturi número 15 para cortar o flay ligamentar para soltar o lábio e a postura do processo.Em seguida, use um cortador de osso para cortar o lábio lateral à medula espinhal e remova suavemente o lábio sem comprimir a medula espinhal. Agora reserve um momento para identificar as raízes nervosas emergentes para poupá-las de se cortar. Em seguida, use um gancho para soltar a dura-máter ventral do lado dorsal dos corpos vertebrais e prepare um corredor para o clipe.Certifique-se de que a mola do anel do clipe esteja ajustada para fornecer a força desejada. A força do clipe determina a extensão do trauma e da compressão. Insira o clipe aberto ao redor da medula espinhal e deixe-o fechar para induzir uma lesão por contusão.Forças de clipe entre 15 e 35 gramas são frequentemente usadas com uma duração de clipping de um minuto após a lesão da medula espinhal ter sido realizada. Remova o clipe e feche os músculos em duas camadas, seguido pelo fechamento da pele. Assim que a ferida estiver devidamente fechada, interrompa a anestesia e observe o rato enquanto ele acorda.Depois que o animal recuperou a consciência suficiente para o esterno, reclinado, coloque o rato em uma gaiola limpa. Devido à gravidade desse tipo de lesão, é imperativo que os seguintes tratamentos pós-operatórios sejam seguidos. Primeiro, certifique-se de administrar analgésicos como buprenorfina e meloxicam por três a cinco dias, dependendo dos sintomas.Evite também a desidratação por via subcutânea. Injetar de cinco a 10 mililitros de solução salina duas vezes ao dia durante três dias e continuar a fornecer antibióticos na água potável por cinco dias. Pós-operatório. Aperte a bexiga urinária duas a três vezes ao dia até que a recuperação consistente da função da bexiga seja aparente, mesmo depois que os animais parecerem recuperados.Certifique-se de observar os animais operados quanto a déficits neurológicos e condição fisiológica. A injeção é realizada 14 dias após a lesão da medula espinhal. Antes de iniciar a cirurgia, prepare os SAPs na concentração de 1% de peso por volume em água estéril e encha um capilar de vidro de 100 micrômetros conectado a uma seringa de Hamilton.Com a solução, encaixe a seringa Hamilton na estrutura estereotáxica. Após a anestesia, o rato fixa a cabeça na estrutura estereotáxica e desinfeta o local da cirurgia com iodopovidona e álcool a 70%. Como antes, mais uma vez, depois de abrir a pele, disseque cuidadosamente o par de músculos vertebrais e insira afastadores.Use um bisturi número 15 para remover o tecido cicatricial da dura-máter e reexpor o local da lesão. Em seguida, use a ponta de uma agulha afiada para abrir a dura-máter com cuidado. Finalmente, estereotaxialmente, insira o capilar de vidro a uma profundidade de dois milímetros na medula espinhal traumatizada e injete os SAPs.Após a injeção dos SAPs, deixe o capilar permanecer no local da injeção por um minuto antes da remoção para permitir o alongamento do tecido para acomodar a solução injetada. Em seguida, repita a injeção no próximo local. Aqui, NPCs, foram isolados da zona paraventricular de um camundongo vermelho DS adulto e cultivados de acordo com procedimentos publicados anteriormente.Pouco antes da microinjeção, dilua os NPCs em meio de crescimento a uma concentração de 50 vezes 10 elevado a um terço de células vivas por microlitro para transplante de células e carregue em um capilar de vidro em uma seringa Hamilton. Os NPCs são injetados imediatamente após a injeção de SAPs. Para isso, insira o capilar de vidro da seringa de Hamilton a 0,2 milímetros rostral do local da lesão e 1,5 milímetros abaixo da superfície dorsal da medula espinhal.Injete dois microlitros da suspensão celular a uma taxa de cerca de 0,5 microlitros por minuto. Após a conclusão da primeira injeção, deixe o capilar permanecer na medula espinhal por um minuto como antes, depois retraia o capilar, mova-o para um local adjacente e repita o procedimento de injeção. Depois de esperar um minuto, como antes, retraia o capilar e mova-o dois milímetros até o local da lesão.Realize duas injeções de dois microlitros neste local. Esta imagem mostra todos os locais de injeção relativos à lesão da medula espinhal. A implantação de mini bombas osmóticas subdurais para suporte do fator de crescimento é realizada imediatamente após as injeções de NPC.Primeiro escolha um local de implantação. Os locais preferidos são os flancos laterais da região toracoabdominal para evitar o desconforto causado pela própria bomba. Após a desinfecção da região, como antes, é preparado um recesso subcutâneo para a bomba.Em seguida, execute uma laminectomia salta das vértebras superiores ou inferiores adjacentes à lesão da medula espinhal. Aqui, a lesão medular foi realizada em C sete T um, e assim a laminectomia é realizada em C cinco. Agora coloque a bomba no recesso subcutâneo, corte o cateter no comprimento necessário e, finalmente, use suturas 6.0 para prendê-lo ao par de músculos vertebrais.Evitando qualquer luxação associada ao movimento. Use a ponta de uma agulha afiada para abrir a dura-máter abaixo da laminectomia. Em seguida, introduza o cateter no espaço subdural e deixe-o deslizar na direção do mimo, sem resistência e sem ferir o cordão.Agora, verifique se o cateter funciona sem problemas e não tem dobras ou dobras, conforme mostrado aqui. Em seguida, feche os músculos camada por camada usando suturas ou clipes e, em seguida, feche a pele. Uma vez que a ferida esteja devidamente fechada, pare a anestesia e observe o animal enquanto ele acorda.Depois que o animal recuperar a consciência suficiente para o esterno reclinado, coloque o rato em uma gaiola limpa. Certifique-se de seguir todos os procedimentos de tratamento pós-operatório, incluindo monitoramento do animal e analgesia pós-cirúrgica. Administre o tratamento de imunossupressão dois dias antes da injeção de NPC e até sete dias após o transplante e até o sacrifício, respectivamente.Esta imagem de microscopia de fluorescência mostra uma seção longitudinal de uma medula espinhal traumatizada de um rato. A coloração é DPI fluorescência SAPs marcados com QL seis. Os fite aparecem verdes e se agregam no epicentro da lesão.Os NPCs vermelhos positivos DS injetados se difundiram nas direções rostral e coddle indicadas pela fluorescência vermelha. A barra de escala representa cinco milímetros. Aqui, uma imagem de microscópio eletrônico de varredura mostra a formação de andaimes de nanofibras de SAPs montados.A barra de escala representa um micrômetro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão dos procedimentos cirúrgicos envolvidos na compressão do clipe, SCE e como a abordagem promissora do tratamento combinado com SAPs e NPCs pode ser estudada neste modelo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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