Name: O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda a dissecar o cordão nervoso abdominal de lagostas para estudos eletrofisiológicos. Este método permite registrar padrões de locomoção fictícia em neurônios motores dos pleópodes, auxiliando pesquisas em neurociência.

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Agradecemos Jos Burgert para ajudar com algumas das figuras. Somos gratos a Ingo Selbach (e do grupo &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) por seus esforços para fornecer o laboratório com animais experimentais. Agradecemos a Anna C. Schneider para reler primeiras versões do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa de SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 e uma subvenção de arranque da Universidade de Colônia para professores do sexo feminino.

Este procedimento de dissecção está em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias do dia 22 de Setembro 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparação <ol><li> Obter lagostas, Pacifastacus leniusculus (Dana), de ambos os sexos ≥8 cm de tamanho. Certifique-se de que os animais são vitais e abdome e dos membros abdominais estão intactos. </li><li> Tome cuidado para inspecionar a carapaça e que esta cutícula é dura e rígida. Pré- e pós-muda animais têm uma carapaça macio e não são adequados para experiências porque durante o processo de muda mudar vários parâmetros (por exemplo, diminuição da actividade locomotora). </li><li> Montar todas as ferramentas e os materiais utilizados durante a dissecção, prendendo e desheathing do cordão nervoso mostrado na Figura 2 e enumerados nos suplementos fornecidos. </li></ol><img alt="Configuração do microscópio de dissecção com ferramentas cirúrgicas para análise de amostras biológicas; Inclui fonte de luz." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: (1) balde grande cheio de gelo; (2) solução salina lagostas; (3) dispensador de solução salina; (4) microscópio de dissecação; (5) prato dissecção; (6) uma tesoura forte; (7) fórceps (8) tesoura primavera; (9) placa de Petri forradas com Sylgard claro; (10) dos pinos de fixação; (11) fonte de luz fria. 2. Dissecção Gross <ol><li> Anestesiar animais em gelo durante 15-20 min. Realizar a primeira parte da dissecção bruto a uma bancada de laboratório perto da pia, pois inclui uma etapa exsanguination ea amostra precisa ser lavado regularmente com lagostas salina durante o procedimento. </li><li> Segure lado ventral animais e usar uma tesoura para cortar ambos os fortes garras em suas bases perto do tórax (Figura 3-1). Remover uropod esquerda e direita (Figura 3-2). </li><li> Coloque o animal lado ventral-se no prato forrado com dissecção Sylgard preto. Elevate cefalotórax através da inserção de gelo por baixo e prender o abdômen no telson (Figura 4A). </li><li> Encha o distribuidor de solução salina com ~ 60 ml de solução salina gelada lagostas. Perfundir lagostim com soro fisiológico frio através da abertura de garra (Figura 4B). O excesso de solução salina irá drenar através dos cortes nos uropods. Cubra lagostim com gelo durante exsanguination </li><li> Decapitar o animal com um único corte transversal apenas posterior para os olhos do animal utilizando uma tesoura forte (Figura 5A). Remova todas as pernas que andam perto das articulações de base, como indicado na Figura 5B. </li><li> Isolar o abdômen com os últimos segmentos torácicos a partir do resto do cefalotórax. Adicione um primeiro corte ao nível das segundas pernas de passeio (segmento torácico 3) inserindo a extremidade da tesoura para dentro da abertura da segunda perna curta e de corte para o lado oposto. (Figura 6A-1). </li><li> Estender este primeiro corte para ambos os lados através de tele cefalotorácica (Figura 6A-2). </li><li> Virar o animal aberto para fazer alguns dos órgãos internos visíveis. Empurrar o proeminente glândula digestivo (Figura 6B-3) para a parte anterior da amostra e usar uma pinça para remover os órgãos reprodutores a partir da cavidade abdominal. </li><li> Retire a parte anterior do cefalotórax (Figura 6C). Use cortes laterais para remover as partes laterais da carapaça, que cobrem as guelras, em ambos os lados do tórax remanescente (Figura 6D-4). Retire as brânquias e enxaguar a amostra com solução salina fria. </li><li> Continuar a dissecação com um corte através de todo o comprimento da placa esternal, como indicado na Figura 6E-5. Faça este corte nas posições laterais máximas entre Pleuron e swimmerets (Figura 6E marcações vermelhas). Proceder do outro lado com um mesmo corte. Lavar a amostra com solução salina fria. </li><li> Realizar a dissecção restante sob uma dissection microscópio. Coloque abdômen lado ventral do lagostim-se no prato forrado com dissecção Sylgard preto e cheio de lagostas salina para que ele cobre o espécime. NOTA: Os passos seguintes (2,12-4,8) contêm instruções de direção que se aplicam aos experimentadores destros. Nos passos seguintes (2,12-6,8) é importante para substituir lagostas salina em intervalos regulares, a cada 20-30 min com solução salina fria, para manter o sistema nervoso saudável. </li><li> Fixe a amostra com os pinos de insetos posteriormente no telson e anteriormente com os restos da carapaça. Coloque a amostra de modo a que os pontos Telson para a esquerda e é paralela à borda da mesa. </li><li> Use uma pinça grossa na mão esquerda para pegar através de uma abertura perna curta (Figura 7A) e puxe o modelo open (Figura 7B seta branca). Identificar os grandes dorsais duas fibras musculares flexor (Figura 7b-1 e C-1) e cortar seu ventralbase, como mostrado na Figura 7B. </li><li> Identificar a artéria esternal (Figura 7C-2), que desce a partir dorsal (coração) para ventral, no segmento torácico 4 th. Esta artéria situa-se acima do cordão nervoso (Figura 7C-3), antes de projectos no âmbito do cordão nervoso, formando a artéria ventral. </li><li> Transecto artéria esternal. Como demonstrado na Figura 7C, levantar a artéria primeiro, usando uma lâmina da tesoura, e apenas cortada quando o cordão nervoso localizada ventralmente é visível. </li><li> Corrigir os músculos flexores dorsal anterior (para o lado direito). Isto deve ser feito na posição máxima esticado com pinos que eles não vão bloquear a visão ea amostra permanece esticado. Quando as fibras musculares dorsal são fixadas (Figura 8-1), o primeiro gânglio abdominal, A1 e A2, com nervos associados N1, N2 e N3 são visíveis (Figura 8). </li><li> Use uma pinça na mão esquerda para pegar a especificaçãoimen em uma abertura de pernas para caminhada. Durante todo o seguinte dissecção passos puxe delicadamente para manter o modelo aberto. </li><li> Transecto os nervos N3 na posição mais distante do cordão nervoso. (Figura 8-3). </li><li> Cortar os flexores perto do apodeme ventral, conforme mostrado na Figura 8-4. Tome cuidado para não danificar o cabo dos nervos ou o N2 nervos. </li><li> Repita os passos 2.18 e 2.19 para o N3 nervos e os músculos flexores do restante gânglios abdominal A2 a A5. </li><li> Na última gânglio abdominal, A6, cortar os flexores do apodeme dorsal e ventral do espécime deve ter a aparência, como mostrado na Figura 9. </li><li> Corte a placa posterior do esterno para os nervos da A6 (Figura 9-1) e manter a parte ventral (Figura 9-2). Descarte a parte dorsal com músculos flexores (Figura 9-3). Fixar a placa esternal anteriormente com pinos através das aberturas das pernas de passeio,e posteriormente para A6. </li></ol> 3. Belas Dissection <ol><li> Coloque a amostra sob o microscópio com a parte anterior direcionada para fora e na parte posterior em direção da borda das mesas. </li><li> Use uma pinça, como mostrado na Figura 10A para remover as partes mais anterior da esternos cefalotorácico. NOTA: Os gânglios torácicos e nervos associados estão parcialmente cobertas pela musculatura da perna e esternos cefalotorácico. O esternos cefalotorácico formar um esqueleto que separa as cavidades localizadas lateralmente das pernas caminhada um do outro e da cavidade medial em que o cordão nervoso ventral reside. </li><li> Cortar os músculos entre as estruturas restantes exoesqueléticas conforme indicado na Figura 10B -1 e B2. Use uma pinça para agarrar e levantar a extremidade anterior do cordão nervoso ventral (Figura 10C). NOTA: O cabo de nervo é danificado durante o processo, para evitar pegar a NERVe cabo várias vezes. </li><li> Cortar os nervos torácicos lateralmente ao levantar o nervo espinhal (Figura 10C-3). Manter estes nervos ao comprimento adequado para fixação. Retire a parte espremido da cadeia de gânglios, que foi pego com uma pinça, cortando-se todo o tecido anterior ao T4 (Figura 10C-4). </li><li> Coloque a amostra com a parte anterior para a esquerda e se concentrar em A1. Corte o N1 e N2 nervos de A1 em um comprimento adequado (max. 1 cm) para fixar-los para fora. </li><li> Concentre-se em A2 e identificar os nervos N1, N2, N3 e deste segmento (Figura 11). Os nervos N1 do gânglio abdominal A2-A5 residir entre dois dobramentos cuticulares esternal em cada segmento (Figura 11A-1) e são cobertos por musculatura. Faça um corte ao longo da infolding cuticular esternal posterior. Iniciar na borda lateral do abdómen e avançar no sentido da linha média como mostrado na Figura 11A. </li><li> Se o N1 alvo ainda é covevermelha com o tecido, como mostrado na Figura 11B (seta vermelha), atravessam o feixe muscular, mas este tempo anterior para ambos os invaginações cuticulares esternal e o nervo N1 (Figura 11B-2). </li><li> Cortar N1 nervo como distalmente quanto possível (Figura 11C-3). Nerve N1 é totalmente visível e do ramo anterior e posterior podem ser identificados (Figura 11C). </li><li> Vá para a N1 nervo contralateral e primeiro corte os músculos ao longo da infolding cuticular esternal posterior, começando medial, próximo ao gânglio (Figura 11D). Se o nervo ainda é coberto por tecido, cortar transversalmente o feixe muscular, mas este tempo anterior para ambos os invaginações cuticulares esternal e o nervo N1, semelhante à Figura 11B-2. Corte o N1 nervo como distal possível. </li><li> Corte o nervos N2 deste gânglio para um comprimento adequado (aprox. 0,5 centímetros) para fixação. </li><li> Repita os passos 3,7-3,11 para os nervos de A3-A5. </li><li> Corte o nerves de gânglio A6 como distal possível (Figura 12a). Use uma pinça para agarrar múltiplos nervos de A6 para levantar este gânglio e começar a isolar a cadeia de gânglios da placa esternal. </li><li> Ao levantar o cordão nervoso, puxe-o suavemente na direção anterior, como demonstrado na Figura 12B (seta branca). Como os gânglios individuais são levantadas, remover a artéria ventral que pode ser ligado ao lado ventral do nervo espinhal (Figura 12C). Continue esta seqüência (suavemente) Puxe cortar, até o cordão nervoso está completamente isolado. </li><li> Transfira a corrente isolada de gânglios de uma placa de Petri forradas com Sylgard claro e preenchido com solução salina lagostas (Figura 12D). </li></ol> 4. Fixar o cordão nervoso em placa de Petri NOTA: Use pequenos pinos cortados a partir de fio de aço inoxidável (ver suplementos) para prender o cabo dos nervos. Toque apenas a terminação nervosa com a pinça e não fazer squeezum e os conectivos ou gânglios. <ol><li> Pin a cadeia de gânglios em uma linha reta, ao aplicar alongamento suave. </li><li> Arrume o cordão nervoso na placa de Petri com o lado dorsal virada para cima (Figura 13, linha preta). O lado ventral do gânglio pode ser identificada pela sua convexidade; lado dorsal é plana. Pin os nervos torácicos para os lados. Continue com os nervos da A6, esticando o cordão nervoso ao longo do seu eixo longitudinal. </li><li> Pin para os nervos de A1 em um ângulo de 90 ° em relação ao cordão nervoso. </li><li> Avance para o pino A2 e N2 nervos num ângulo de 35-45 ° em relação ao cordão nervoso (Figura 1A). </li><li> Separe os nervos N1 em seus ramos anterior e posterior antes de fixar como demonstrado na Figura 14. Use dois pares de uma pinça fina para pegar com um par de fórceps o anterior e com a outra o ramo posterior do nervo N1. Tome cuidado para escolher apenas o fim mais distals dos ramos nervosos. Agora puxe-os cuidadosamente separados. </li><li> Pin o ramo anterior do nervo N1 a um ângulo de 90 ° relativamente ao cabo de nervo (Figura 1A). Pin o ramo posterior do nervo N1 entre o ramo N1 anterior eo nervo N2. </li><li> Repita o 4,4-4,6 passos para os nervos dos gânglios A3-A5. Enquanto fixando o trecho cordão nervoso que em longitudinal, bem como as direções transversais. </li></ol> 5. Desheathing os gânglios <ol><li> Coloque a preparação de uma tal maneira que as mãos do experimentador estão sempre em repouso sobre um plano estável para evitar agitação. A fim de desheath os gânglios iluminar o cordão nervoso a partir de baixo. </li><li> Concentre-se em qualquer gânglio A1 abdominal para A5. Use tesoura mola finos para fazer um pequeno corte lateral através da bainha gânglio, posterior ao gânglio e entre os nervos N2 e N3 (Figura 15A seta vermelha). </li><li> Pegue a bainha gânglio usando muito ffórceps ine e cortar transversalmente através da bainha acima dos conectivos, como indicado na Figura 15A-1. Tome cuidado para não apertar ou cortar o cordão nervoso com a tesoura. </li><li> Ainda segurando e levantando a bainha gânglio com uma pinça continuar a cortá-lo ao longo das bordas laterais do gânglio (Figura 15B-2 e -3). Remover a bainha. Alternativamente fixá-lo para ambos os lados dos conectores de tal modo que ele é fixado, mas o cordão nervoso não é espremido. </li><li> Repita os passos de 5,2-5,4 para todos os gânglios abdominal A1 a A5. </li><li> Desheathe gânglios torácica e o gânglio A6 de uma forma semelhante. A fim de desheathe A6 anterior início ao gânglio e prosseguir em direção posterior. Pin a bainha gânglio de A6 até o fim posterior da cadeia de gânglios. </li></ol> 6. Extracelular Recordings de Neurônios Motores <ol><li> Reúna todas as ferramentas e materiais utilizados para gravações extracelulares mostrados in Figura 16B e listados nos suplementos. Uma visão geral sobre a configuração de gravação é mostrado na Figura 16A. Comece todos os equipamentos eletrônicos utilizados neste experimento (Figura 16C), para que os amplificadores podem aquecer-se durante pelo menos 30 minutos antes da gravação. Ligue o computador e iniciar o software de gravação. </li><li> Coloque a cadeia de gânglios na mesa de microscópio e iluminar a partir de baixo. Insira o eletrodo de registro no Sylgard próximo ao nervo alvo e o eletrodo de referência em uma posição próxima, mas lateral à gânglios (Figura 17A e B). Dobre o nervo alvo em torno do eletrodo de registro (Figura 17C). </li><li> Esticar o nervo ligeiramente, para garantir o contato entre o eletrodo e do nervo e fixá-lo para o lado (F igura 17D). Fixe os cabos de força para a tabela de microscópio utilizando massa de modelar, para que fiquem na posição desejada. </li><li> Use umcheia com geleia de petróleo e uma agulha de calibre 20 (com ponta arredondada) (Figura 17E-3) para isolar o nervo alvo a partir da solução do banho. Primeiro dab alguns vaselina na Sylgard em torno do eletrodo de registro. O resultado é uma camada de geleia de petróleo cobrindo o Sylgard na proximidade do eléctrodo de registo (Figura 17E-4). Tome cuidado para não bata diretamente no nervo e evitar bolhas de ar nesta camada. </li><li> Fecha-se o eléctrodo de registo com geleia de petróleo a partir de todos os lados, até ao nível da superfície da solução salina (Figura 17F). </li><li> Repita esse procedimento para todos os nervos alvo cuja actividade deve ser monitorado. </li><li> Iniciar a gravação. Use um modo de aquisição livre contínua ou lacuna e uma taxa de amostragem de 5 kHz. Defina o amplificador extracelular com os seguintes parâmetros; ganhar para 1.000 (amplifica o sinal de 1.000 vezes, ter o cuidado de incluir esse parâmetro amplificação nas configurações do software de aquisição) umada faixa de filtro de banda de 300 Hz (baixo) a 2.000 Hz (alta corte). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<html> A anatomia de lagostins e seus gânglios abdominal tem sido descrito anteriormente 5, 18, ​​19, 20 e recomenda-se a familiarizar-se com eles antes da dissecção, a fim de evitar o corte de nervos importantes. É crítico para manter a preparação, a temperaturas inferiores a 23 ° C para evitar degradação do cabo de nervo isolado. Isto pode ser facilmente conseguido por substituição da solução de banho a cada 20-30 min com solução salina fria lagostas. Nestas circunstâncias, a cad...

Os swimmerets de lagostins servem a uma função no controle da postura e bater ritmicamente quando os animais nadar para a frente, ventilar suas tocas ou fêmeas arejar seus ovos 5, 6. Os swimmerets do lagostim sinal, Pacifastacus leniusculus, ocorrem em pares do segundo para o quinto segmento abdominal, com um membro de cada lado do abdômen 7. O sistema nervoso central produz por si própria o alinhador rítmica do motor que acciona o movimento swimmeret no animal intacto, bem como na preparação de nervo isolado cabo. Quando não há feedback sensorial ou descendente de entrada presente o padrão motor rítmica é chamado locomoção fictício 1, 2. No sistema swimmeret este padrão motor não diferem em qualquer parâmetro da actividade dos pleópodes medidos no animal intacto. O movimento de cada swimmeret é accionado por um microcircuito que está localizado dentro e restrita a um corresponding hemiganglion 1 - 3. Em cada microcircuito há um núcleo de geração de padrões que compreende cinco identificados interneurons não spiking. Eles podem ser funcionalmente caracterizada como sendo ou Inibidor de Power Stroke (IPS) ou inibidor de Retorno Curso (IRS) 8. Estes IPS e interneurônios IRS não são osciladores endógenos, em vez da sua actividade alternada é impulsionado por inibição recíproca 9. Porque estes interneurônios inibem os neurônios motores swimmeret diretamente, o movimento alternado PS-RS é gerado 10. Locomoção no entanto, não requerem apenas a geração de actividade, mas também a coordenação das diferentes microcircuitos independentes. No sistema swimmeret essa coordenação é estabelecida pelo microcircuito coordenação que assegura que os membros estão ativos em horários corretos. Este microcircuito é construído por três neurônios identificados em cada segmento 11-15. Este protocolo prevê the primeira vez um passo-a-passo para isolar a dissecção de gânglios da cadeia (T4 para A6, Figura 1). Mostramos como fixar o cordão nervoso abdominal isolada e desheathe cada gânglio. Neste isolado de preparação do sistema nervoso, os neurônios responsáveis ​​pelo movimento swimmeret estão prontos para uso em experimentos eletrofisiológicos e morfológicos. A segunda parte deste protocolo demonstra as principais características do padrão motor swimmeret. Isto inclui um guia passo-a-passo para registro extracelular a atividade dos neurônios motores swimmeret. Os axônios dos neurônios motores RS projetar através do ramo anterior do nervo N1, enquanto axônios dos neurônios motores PS projeto por meio do ramo posterior do mesmo nervo (Figura 1) 4. Por isso a sua atividade pode ser gravado a partir destes ramos com eletrodos diferenciais pinos. <img alt="Diagrama de estrutura neural e ilustração rotulada para estudo de anatomia, destacando ramos nervosos." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Isolado sistema nervoso de gânglio torácico 4 (T4) ao gânglio abdominal 6 (A6) e um diagrama esquemático de que T4:. Gânglio torácico 4; T5: gânglio torácico 5; A1, A2 ... A6 gânglio abdominal 1, gânglio abdominal 2 ... gânglio abdominal 6; N1: nervo N1; N2: nervo N2; N3: nervo N3; PS: power-acidente vascular cerebral; RS: return-acidente vascular cerebral. Abreviaturas direcionais: A = anterior; P = posterior. Este procedimento de dissecção e a técnica eletrofisiológica demonstrado são convenientes para estudantes de graduação e podem complementar de estudantes de cursos práticos em fisiologia. A cadeia isolada de gânglios foi usado em uma série de experiências para estudar a função do sistema nervoso, a coordenação, ou modulação de microcircuitos swimmeret 6, bem como o controlo neuronal do comportamento adaptativo na locomoção 16, 17. O sistema de lagostas swimmeret proporciona assim uma enorme quantidade de ensino interessante ou tchovendo oportunidades que todos começam com a dissecção do cordão nervoso ventral de lagostins e gravação extracelular do padrão motor fictício.

<table><tbody><tr><td>Amplificador extracelular de 4 canais: MA 102&nbsp;</td><td>Amplificador</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&auml; t zu K&ouml; ln, Alemanha</td><td></td></tr><tr><td>Air-table</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation (TMC) uma unidade da AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, EUA</td><td>63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>big bucket&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex e Clampfit</td><td>pClamp 10, software de gravação e análise</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10 Fonte de</td></tr><tr><td>lâmpada fria</td> padrão <td>com guia de luz flexível (feixe de fibra óptica)&nbsp;</td><td>Microscópios Euromex holland, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 & LE.5235</td></tr><tr><td>computador e monitor</td><td>equipados com recipiente de software</td><td></td><td></td>de gravação</tr><tr><td>e pipeta para resíduos líquidos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução salina para lagostins</td><td>contém (em mM): 5,4 KCl, 2,6 MgCl2, 13,5 CaCl2 e 195 NaCl, tamponado com 10mM de base Tris e 4,7mM de ácido maleico; aerado por 3 horas. Ajuste em pH de 7,4.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextran, Texas Red (3000MW, lisina fixável)</td><td>corante fluorescente, lisina fixável</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha</td> Prato de dissecação <td>D3328</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>(l x w x h) 15x7x5 cm; forrado com</td> pinça de pinos de fixação de gaiola de Faraday de silicone <td></td><td></td>preto</tr><tr><td>(biologia, Dumont # 5)</td> <td>Fórceps: Biologia, ponta 0,05 x 0,02 mm, comprimento 11 cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemanha</td><td>11252-20</td></tr><tr><td></td> fórceps (biologia, Dumont # 55) Fórceps: Biologia, ponta 0,05 x 0,02 mm, comprimento 11 cm, INOX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Ferramentas de Belas Ciências (FST), Alemanha</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>fórceps (eletrônico, Dumont # 5)</td> <td>Fórceps: Padrão, ponta 0,1 x 0,06 mm, comprimento 11 cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemanha</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>eletrodo intracelular</td><td>Capilares de vidro borossilicato (diâmetro externo/interno: 1 mm/0,5 mm), com filamento</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Microscópio de dissecação&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Alemanha</td><td>10446298</td></tr><tr><td>microscópio espelho de mesa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>para iluminar a preparação de baixo</td><td></td><td></td>da</tr><tr><td>massa</td><td></td><td></td><td></td>de modelagem</tr><tr>Microscópio de Dissecção<td>Olympus SZ61</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 0.67x - 4.5x</td><td>Olympus, Alemanha</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri&nbsp;</td><td>94 x 16 mm; forrado com silicone transparente</td><td>Greiner bio-one, Alemanha</td><td>633180</td></tr><tr><td>tesoura de anel</td><td>ThoughCut, aresta de corte: afiada/romba, reta: 13cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemanha</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>tesoura de mola ou alternativa: Tesoura de mola Vannas</td><td>de ponta: 8 mm, diâmetro da ponta: 0,2 mm, reta: 10 cm ou aresta de corte 2,5 mm, diâmetro da ponta 0,075 mm, reta: 8 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST), Alemanha</td><td>15024-10 ou&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>tesoura de mola Vannas para estudantes ou alternativa:&nbsp; Tesoura de mola Moria</td><td>de corte: 5mm, diâmetro da ponta: 0.35mm, reta: 9cm ou borda de corte: 5mm, diâmetro da ponta 0,1 mm, reta: 8 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (FST), Alemanha</td><td>91500-09 ou&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 Base de Elastômero de Silicone e Agente de Cura; para sylgard preto adicionar carvão ativado</td><td>Dow Corning, Midland, MI, EUA</td><td></td></tr><tr><td>seringa preenchida com vaselina e equipada com uma agulha 20 gauche com ponta</td><td></td><td></td><td></td> arredondada</tr></tbody></table>

o sistema swimmeret de lagosta: um guia prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares recordings do padrão motor

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Aqui demonstramos a dissecção do cordão nervoso abdominal lagostim. A preparação compreende os dois últimos gânglio torácico (T4, T5) e a cadeia de gânglios abdominal (A1 a A6). Esta cadeia de gânglios inclui a parte do sistema nervoso central (SNC) que leva a locomoção coordenada dos pleópodos (pleópodes): o sistema swimmeret. Ele é conhecido por mais de cinco décadas em que lagostas cada swimmeret é impulsionado por seu próprio padrão do kernel gerando independente que gera atividade rítmica alternando 1-3. Os neurônios motores que inervam a musculatura de cada swimmeret compreendem dois anatômica e funcionalmente distintas populações 4. Uma delas é responsável pela retração (curso de potência, PS) do swimmeret. O outro impulsiona o protraction (curso de retorno, RS) da swimmeret. Os neurónios motores do sistema swimmeret são capazes de produzir espontaneamente um padrão fictício do motor, que é idêntico ao padrão gravado in vivo </em&gt; 1. O objetivo deste relatório é a introdução de um sistema modelo interessante e conveniente para o estudo de redes de geração de ritmo e coordenação dos microcircuitos independentes para cursos práticos de laboratório dos alunos. O protocolo fornecido inclui instruções passo-a-passo para a dissecação de cordão nervoso abdominal do lagostim, prendendo da cadeia isolado de gânglios, desheathing gânglios e registrando o swimmerets padrão motor fictício extracelular do sistema nervoso isolado. Além disso, podemos monitorar a atividade dos neurônios swimmeret gravadas intracelular de dendritos. Aqui também descrever brevemente essas técnicas e dar alguns exemplos. Além disso, a morfologia de neurónios swimmeret pode ser avaliada utilizando várias técnicas de coloração. Aqui nós fornecemos exemplos de intracelular (por iontoforese) Dye preenchido neurônios e aterros de pools de neurônios motores swimmeret. No nosso laboratóriousamos esta preparação para estudar as funções básicas de locomoção fictício, o efeito de retorno sensorial sobre a actividade do sistema nervoso central, e a coordenação entre microcircuitos a um nível celular.

Com as gravações extracelulares simultâneas de RS e PS, os neurônios motores de um gânglio, a atividade alternada dessas piscinas do neurônio motor, podem ser monitorados (Figura 18), o que representa o padrão de locomoção fictício. <img alt="Análise de impulsos neuronais, diagrama com sinais marcados RS, PS; configuração experimental e formas de onda." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 18"> Figu...

Aqui descrevemos a dissecção do cordão nervoso abdominal do lagostim. Também demonstramos uma técnica eletrofisiológica para registrar a locomoção fictícia dos neurônios motores nadadores.

O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar o cordão nervoso abdominal do lagostim para usá-lo em estudos eletrofisiológicos. Isso é feito anestesiando primeiro o lagostim. Em seguida, uma dissecção macroscópica é realizada para isolar a placa ventral do lagostim.Em seguida, uma dissecção fina é realizada para isolar completamente o sistema nervoso central dos gânglios raicos para os gânglios abdominais. Um seis. Finalmente, a bainha ganglionar é removida de todos os gânglios para facilitar os experimentos eletrofisiológicos.Em última análise, a cadeia de gânglios abdominais é usada para registros extras ou intracelulares. Estudar a coordenação de geradores de padrões centrais ou investigar a morfologia e o contexto sináptico dos neurônios identificados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como fornecer experiência prática sobre a função da rede nervosa para poder registrar a comoção fic FLA no sistema nervoso isolado ou caracterizar a morfologia dos gânglios abdominais ou de neurônios específicos.Embora este método possa fornecer informações sobre o sistema de taxa de natação dos lagostins. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como uma rede neuronal que impulsiona o comportamento de virar a cauda em lagostins Trabalhando com o lagostim Pacific Stacia Linea Guus. Depois de anestesiar um animal de acordo com o protocolo de texto, segure o lado ventral para cima e use uma tesoura forte para cortar ambas as garras em suas bases perto do tórax.Em seguida, remova os europods esquerdo e direito. Coloque o lado ventral do animal para cima em uma placa de dissecação forrada com sardinha preta antes de usar solução salina fria para perfundir através da abertura da garra. Em seguida, use uma tesoura forte para fazer um único corte transversal logo posterior aos olhos do lagostim para decapitá-lo.Em seguida, remova todas as pernas de caminhada perto das articulações da base para isolar o abdômen junto com os últimos segmentos torácicos do resto do tórax. Insira a ponta da tesoura na abertura da segunda perna de caminhada e corte para o lado oposto. Depois de estender o corte para ambos os lados através do tórax e expor alguns dos órgãos internos conforme descrito no protocolo de texto, remova a parte anterior do tórax.Agora remova os órgãos internos e enxágue o animal com solução salina fria. Continue a dissecção com um corte em uma posição lateral máxima entre o lumon e os ratos nadadores em todo o comprimento da placa esternal. Faça o mesmo corte do outro lado.Coloque o abdômen do lagostim com o lado ventral para cima na placa de dissecação. Use alfinetes de insetos para fixar a amostra posteriormente no tellson e anteriormente nos restos do carabase. Encha o prato com soro fisiológico de lagostim para cobrir o espécime.Use uma pinça grossa na mão esquerda para agarrar através de uma abertura de perna e puxe a amostra para abri-la. Identifique as duas grandes fitas musculares flexoras dorsais. Fixe-os e corte suas bases ventrais, bem como a artéria esternal.Exponha os primeiros gânglios abdominais A um e os nervos associados N um N dois. Agora passando para o segundo segmento abdominal. Remova a base dos fios musculares perto da base ventral.O gânglio abdominal A dois agora é visível com os nervos associados N um, N dois e N três. Atravessar os nervos N três na posição mais distante do cordão nervoso. Repita essas etapas para os próximos três segmentos abdominais com os gânglios abdominais.Um três a cinco. Ao atingir o gânglio abdominal, um seis. Corte a placa esternal posterior aos nervos de um seis.Mantenha a parte ventral e prenda-a. Lado dorsal para cima no prato cheio de solução salina ao microscópio. Use uma pinça para remover as partes mais anteriores da popa torácica do cefalon.Em seguida, corte os músculos entre as estruturas exoesqueléticas restantes. Depois de levantar cuidadosamente a extremidade anterior do cordão nervoso ventral, corte os nervos torácicos lateralmente. Concentre-se em um e corte os nervos N um e N dois de um com no máximo um centímetro de comprimento para prendê-los.Em seguida, vá para A dois e identifique os nervos N um, N dois e N três deste segmento. Os nervos n um dos gânglios abdominais, um dois a cinco. Residem entre dois cuticulares esternais em desdobramentos em cada segmento e são cobertos por musculatura.Em seguida, começando na borda lateral do abdômen, faça um corte ao longo da dobra cuticular esternal posterior e prossiga em direção à linha média Depois de descobrir N um de acordo com o protocolo de texto. Se necessário, corte o nervo o mais distalmente possível. Prossiga para o lado contralateral e comece a isolar o nervo N um da linha média perto do gânglio em direção à borda lateral, cortando ao longo do envoltório cuticular esternal posterior.Agora corte os nervos N dois deste gânglio em um comprimento adequado para fixação. Em seguida, repita as etapas mostradas para os gânglios abdominais. Um dois para um três para um cinco o mais distalmente possível.Corte os nervos do gânglio a seis. Use uma pinça para agarrar vários nervos de um seis para levantar o gânglio e começar a isolar a cadeia de gânglios da placa esternal. Depois de isolar completamente o cordão nervoso, transfira a cadeia de gânglios para uma placa de Petri forrada com proteção de peitoril transparente e preenchida com solução salina usando pequenos pinos cortados de fio de aço inoxidável enquanto aplica um toque suave de alongamento.Prenda a cadeia de gânglios em linha reta com o cordão nervoso disposto com o lado dorsal para cima. Mantenha apenas os dois últimos gânglios torácicos e prenda os nervos torácicos ao lado. Prenda os nervos de um em um ângulo de 90 graus em relação ao cordão nervoso.Em seguida, prossiga para um dois e fixe os nervos N dois em um ângulo de 35 a 45 graus em relação ao cordão nervoso. Uma vez que os nervos N um são separados e fixados de acordo com o protocolo de texto, fixe o ramo anterior do nervo N um em um ângulo de 90 graus em relação ao cordão nervoso. Em seguida, fixe o ramo posterior do nervo N um entre o ramo anterior N um e o nervo N dois.Como todos os gânglios abdominais devem ser desembainhados, use uma tesoura de mola fina para fazer um pequeno corte lateral na bainha do gânglio posterior ao gânglio e entre os nervos N dois e N três. Corte transversalmente na bainha acima do conectivo. Em seguida, continue a cortá-lo ao longo das bordas laterais do gânglio antes de remover a bainha.Se necessário, use uma pinça fina para levantar a bainha para realizar gravações extracelulares. Após a configuração das ferramentas e reagentes listados no protocolo de texto, coloque a cadeia de gânglios na mesa do microscópio e ilumine por baixo. Insira o eletrodo de gravação na proteção do sílaba próximo ao nervo alvo e o eletrodo de referência em uma posição próxima, mas lateral aos gânglios.Em seguida, dobre o nervo alvo ao redor da gravação. Depois de esticar e prender o nervo, use uma seringa cheia de vaselina e uma agulha de ponta arredondada de calibre 20 para isolar o nervo alvo da solução de banho. Repita isso para todos os nervos cuja atividade precisa ser registrada.Finalmente, comece a registrar como mostrado aqui, a atividade extracelular do PS dois a PS cinco neurônios motores ipsilaterais começa com uma explosão de PS em cinco e a onda de excitação se propaga na direção anterior. Além disso, o tempo medido desde o início de uma explosão até o início da próxima explosão em cada segmento permanece constante e é definido como o período dos períodos de ritmo e explosão. As durações podem variar entre diferentes preparações, mas o atraso de fase entre os segmentos permanece constante em aproximadamente um quarto do ciclo, independentemente da frequência do ritmo.Esses padrões de coordenação podem ser melhor vistos nos histogramas de fase vistos aqui. Aqui, usando microeletrodos afiados, gravações intracelulares dos dendritos dos neurônios motores Ps mostram oscilações de enfase de neurônios individuais com a atividade extracelular registrada de todos os neurônios motores PS do mesmo hemigânglio. Para identificar neurônios registrados intracelularmente, as células podem ser preenchidas usando microeletrodos afiados e iontoforese.Nesta figura, a soda ventral de dois neurônios motores PS preenchidos com di estão localizados posteriormente à base do nervo N um. O neurite primário se projeta anteriormente e se ramifica dentro da neuropílula lateral. O axônio se projeta através do ramo posterior do nervo N um para a musculatura.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 45 minutos a uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trocar a solução salina em intervalos regulares para manter o tecido nervoso saudável. Após este procedimento, outros métodos, como o registro intracelular de neurônios motores ou interneurônios, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como analisar o mecanismo celular de coordenação, medir correntes iônicas ou estudar o efeito de neuromoduladores na atividade rítmica de células específicas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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