A Novel In vitro Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

O objetivo geral deste procedimento é estudar as interações entre o sangue e as células endoteliais usando um novo ensaio de câmara endotelial sanguínea. Isso é feito primeiro coletando sangue de um voluntário saudável por punção venosa em sistema aberto. Na segunda etapa, o sangue é cuidadosamente colocado em camadas em câmaras de sangue revestidas com superfície de heparina acopladas a lâminas de cultura de células endoteliais.

Em seguida, essas câmaras de células endoteliais do sangue são giradas suavemente para facilitar a interação entre o sangue e as células endoteliais. Em última análise, as interações célula a célula entre as células sanguíneas e endoteliais e a produção resultante do complexo trombina antitrombina podem ser avaliadas por microscopia de imunofluorescência e Eliza, respectivamente. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como aqueles que usam modelos animais, é que aqui um sistema de modelo humano pode ser usado para investigar doenças vasculares antes de iniciar o experimento.

Acople uma agulha hipodérmica de calibre 18 a um pedaço de tubo de silicone revestido com superfície de heparina de dois milímetros de diâmetro. As superfícies plásticas são revestidas com heparina para evitar a ativação inespecífica da coagulação. Por exemplo, nesta imagem, um coágulo é claramente visível nesta câmara não revestida.

Após 30 minutos de contato com o sangue, o tratamento da câmara com a superfície da heparina protege o sangue da ativação descontrolada, garantindo que os resultados sejam devidos às interações sanguíneas das células endoteliais. Somente depois de conectar o tubo, colete cuidadosamente uma amostra de sangue de um doador saudável por punção venosa de sistema aberto em um tubo revestido de superfície de heparina de 50 mililitros. Suplementar o sangue coletado com heparina não fracionada até atingir uma concentração final de 0,75 UIs por mililitro e inverter o tubo duas a três vezes para uma mistura suave.

Para análise da concentração inicial de proteína no sangue, misture cuidadosamente um mililitro de sangue por tubo em tubos de microcentrífuga contendo 30 microlitros de K 10 milimolares três EDTA e coloque os tubos no gelo. Em seguida, use uma ponta de pipeta revestida com superfície de heparina para transferir 1,5 mililitros de sangue para cada câmara de células endoteliais de sangue revestida com superfície de heparina, tomando cuidado para deixar o sangue fluir lentamente e sem criar bolhas para evitar a ativação. Em seguida, remova as paredes plásticas das lâminas de cultura de células endoteliais de acordo com as instruções do fabricante e lave suavemente as células endoteliais.

Com o PBS, movemos o máximo possível da lavagem das células sem deixar as culturas secarem e colocamos as lâminas em cima das câmaras de sangue com as células voltadas para o sangue. Em seguida, usando lâminas de plástico para suporte adicional. Para evitar a quebra das lâminas de cultura de células, coloque uma pinça ao redor de cada câmara de células endoteliais de sangue para prender as lâminas.

Agora, gire as câmaras em uma roda giratória em um banho-maria de 37 graus Celsius a 0,5 Gs por 30 minutos. Após a rotação, desmonte as câmaras celulares endoteliais do sangue, lave as lâminas de cultura de células em PBS e fixe as células em 1% de paraldeído gelado por 10 minutos. Finalmente, para avaliação da concentração de proteína no sangue ativado, misture um mililitro de sangue de cada câmara em tubos de microcentrífuga contendo 30 microlitros de 0,34 molar K três EDTA e coloque os tubos no gelo por no máximo uma hora.

Então, depois de girar as células, armazene o plasma em novos tubos de microcentrífuga a menos 70 graus Celsius até uma análise mais aprofundada. A ativação dos fatores de coagulação é mais provável de ocorrer no sangue estagnado à medida que a probabilidade de uma interação entre os fatores ativados aumenta. De fato, o volume de sangue sem qualquer movimento por bolhas de ar é duas vezes e meia maior.

Quando 1,75 mililitros de sangue são adicionados à câmara em comparação com quando 1,5 mililitros de sangue são usados, os valores medidos de trombina antitrombina sugerem um aumento da formação de trombina antitrombina com um aumento do volume sanguíneo também. Curiosamente, quando cinco são incubados com qualquer volume de sangue total, não são observadas diferenças entre os dois grupos, sugerindo que as células endoteliais podem modular a ativação da coagulação para estudar o efeito do TNF alfa no recrutamento de leucócitos. Neste experimento, qve foram tratados com 20 nanogramas por mililitro de TT NF alfa quatro horas antes do contato com o sangue, após o qual o número de células CD 16 positivas foi quantificado.

O recrutamento das células positivas para CD 16 aumentou significativamente com o tratamento com TNF alfa de 100 para 256 células positivas para CD 16 por milímetro quadrado e 1,5 litros de sangue, e de 172 para 378 e 1,75 mililitros de sangue. A formação dos complexos trombina antitrombina foi então medida nas amostras de plasma correspondentes do sangue incubado com células tratadas ou não tratadas com TNF alfa. Como esperado, as células estimuladas por TNF alfa induziram uma duplicação aproximada dos complexos trombina antitrombina em comparação com os controles não tratados após seu desenvolvimento.

Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem, complementarem e coagularem em um modelo in vitro usando células primárias humanas e sangue total humano.