A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando Phaseolus vulgaris Como exemplo

O objetivo deste procedimento é demonstrar a extração de fluido aplástico das folhas das plantas usando a técnica de centrifugação por infiltração. Isso é feito primeiro imergindo uma folha em fluido de infiltração e usando diferenças de pressão geradas usando uma seringa ou bomba de vácuo para infiltrá-la totalmente. O segundo passo é preparar a folha para ser centrifugada usando um aparelho de suporte.

Em seguida, a folha é centrifugada suavemente para obter o fluido de lavagem do plástico APO. A etapa final é determinar o fator de diluição do plast APO e testar a qualidade do último fluido de lavagem. Em última análise, o ensaio de centrifugação por infiltração é usado para obter amostras representativas de plásticos APO que podem ser usadas para uma variedade de análises a jusante.

A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes é que é simples otimizar para uma variedade de tipos de folhas, a fim de obter amostras superiores e com contaminação mínima com compostos citoplasmáticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em áreas como fisiologia vegetal e interações entre micróbios e micróbios vegetais, onde é importante entender como a composição dos APLs varia entre as plantas e muda sob diferentes condições fisiológicas ou estresses. Como primeiro passo, tome precauções de segurança usando regras de jaleco, luva e óculos de proteção.

Em seguida, prepare um volume de água destilada para mergulhar a amostra de folhas. Tenha uma lâmina de barbear pronta para coletar uma amostra, neste caso, uma folha da cultivar de feijão verde tenro. Coloque a lâmina de barbear contra o animal de estimação de uma folha e prenda a folha da planta.

Depois de coletada, mergulhe a folha recém-excisada em água destilada para remover os contaminantes da superfície da folha. Em seguida, use lenço absorvente ou papel para bloquear suavemente a folha seca. Meça o peso da folha antes de prosseguir com a infiltração.

Isso ajudará mais tarde na aproximação do volume de infiltração. Inicie o processo de infiltração com uma seringa de 60 mililitros. Com o êmbolo removido, enrole cuidadosamente e/ou dobre a folha na seringa.

Em seguida, encha a seringa com fluido de infiltração. Aqui, água destilada está sendo usada. Insira o êmbolo e inverta a seringa para ejetar o ar dentro dela.

Observe a cor da folha para comparação posterior. Mover o êmbolo para a marca de 40 mililitros utilizando um pequeno pedaço de paraparam. Cubra a ponta da seringa.

Em seguida, puxe o êmbolo até a marca de 60 mililitros para criar pressão negativa. Inverta a seringa para liberar bolhas de ar da superfície da folha. Volte lentamente o êmbolo à posição inicial durante cerca de dois segundos.

Descubra a ponta da seringa e ejete o ar. Em seguida, cubra a ponta novamente e pressione o êmbolo para criar uma quantidade modesta de pressão positiva. Continue aplicando pressão negativa ejetando ar e aplicando pressão positiva até que a folha esteja totalmente infiltrada.

A evidência de infiltração total é a cor escurecida das áreas infiltradas. Assim que isso for visto, remova a folha da seringa. Bloqueie suavemente a folha com papel absorvente para remover o líquido da superfície.

Em seguida, meça o peso da folha infiltrada e um método alternativo de infiltração usa um frasco a vácuo. Novamente, colete uma folha e enxágue-a em água destilada. Depois de secar, meça o peso da folha.

Obter um balão de arma com uma capacidade mínima de 250 ml. Coloque a folha no frasco e cubra-o com água destilada. Em seguida, coloque uma rolha no frasco e coloque uma bomba de vácuo na pistola.

Aplique um vácuo no balão por tempo suficiente para atingir uma pressão. Aproximadamente 650 milímetros de mercúrio. Agite suavemente o frasco para liberar bolhas de ar da folha enquanto estiver sob pressão reduzida.

Em seguida, solte o vácuo com cuidado e lentamente ao longo de cerca de 10 segundos. Repita o processo de aplicação de vácuo, agitando o frasco e liberando o vácuo até que a folha esteja totalmente infiltrada. A evidência de infiltração total é a cor escurecida das áreas infiltradas.

Remova a folha totalmente infiltrada do frasco e seque suavemente a folha com papel absorvente. Para remover o líquido da superfície, meça o peso da folha infiltrada para permitir a determinação do volume aproximado de infiltração. Depois que uma folha estiver totalmente infiltrada, prepare-a para centrifugação.

Coloque um pedaço de filme de quatro polegadas de largura. Coloque a folha no filme para. Em seguida, usando uma ponta de pipeta de cinco mililitros, enrole a folha no filme para.

Pegue um corpo de seringa de 20 mililitros com o êmbolo removido e insira a folha enrolada com a ponta da pipeta. Posicione as bordas das folhas cortadas e voltadas para a extremidade do êmbolo. Obtenha um tubo de polietileno ou policarbonato de 50 mililitros e insira a seringa nele.

Empregue uma centrífuga com um rotor de caçamba oscilante. Carregue o tubo contendo a folha infiltrada e centrifugue a quatro graus Celsius e 1000 G por 10 minutos. Após a centrifugação, examine a folha para determinar se a maior parte do fluido de infiltração foi expelida.

O tubo da centrífuga agora contém o fluido de lavagem APO plast recuperado, continue pipetando o último fluido de lavagem recuperado em tubos frescos de 1,5 mililitro. Coloque as amostras de fluido de lavagem APO plast na centrífuga e gire a 15.000 G por cinco minutos para remover quaisquer células ou partículas. Após centrifugação, pipetar o supinato para tubos novos.

Mantenha as amostras no gelo até que possam ser armazenadas a 80 graus Celsius negativos. Um método para avaliar a qualidade do fluido de lavagem da plataforma APO é calcular o fator de diluição da plataforma APO. Para fazer isso, prepare dois volumes de água destilada com fluido de infiltração, neste caso, cada um suficiente para várias infiltrações em um volume.

Adicione o pó de índigo carmim a uma concentração final de 50 micromolares. Não acrescente nada ao outro. Obtenha uma microplaca de 96 poços para encher três poços com 200 microlitros da solução de infiltração.

Com índigo carmim, encher outros três com 200 microlitros da solução de infiltração não adulterada, basear a microplaca no leitor para medir a absorvância de cada fluido. A 610 nanômetros, a absorbância média para fluido com índigo carmim menos o absorvente médio para fluido sem fornece a absorbância corrigida do infiltrado. Em seguida, replique o protocolo de infiltração foliar três vezes para cada uma das soluções de infiltração.

Mergulhe uma amostra de folha em água. Aplique pressão negativa e positiva ao usar a solução de infiltração de índigo carmim, enxágue as folhas em água destilada após a infiltração para remover qualquer índigo carmim restante da superfície da folha. Recuperar um último líquido de lavagem por centrifugação.

Depois de recuperar o último fluido de lavagem, retorne ao leitor de placas nos poços da microplaca. Colocado 200 microlitros de cada uma das extrações livres de índigo carmim, e também 200 microlitros de cada índigo carmim alast lavando a extração do fluido. Meça a absorbância das amostras em 610 nanômetros para obter a absorbância corrigida.

Faça a média de cada conjunto de números e pegue a diferença. Utilizar a absorbância corrigida do infiltrado e a absorbância corrigida do líquido de lavagem aplástica para determinar o factor de diluição APL para obter estimativas das concentrações ou actividades no líquido aplástico. O implantador multiplica os valores de concentração ou atividade do último fluido de lavagem pelo fator de diluição extraído do último fluido de lavagem da cultivar fasi vulgaris.

O verde macio foi usado para produzir ácidos orgânicos do espectro de massa desta cromatografia gasosa. Açúcares simples e aminoácidos representam a maior parte dos metabólitos identificáveis. Aqui está uma comparação da página SDS, Géis de coloração Kumasi de extratos de folhas de fluido de lavagem fasi vulgarus alast.

As extrações diferem na quantidade de contaminação citoplasmática. Isso é observado como diferentes quantidades da enzima de gesso rubis. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de ser o mais gentil possível, no mínimo, para evitar causar qualquer dano tecidual ou contaminação citoplasmática após este procedimento.

Outros métodos, como espectrometria de massa de proteínas ou metabólitos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a composição do fluido aplástico. O fluido de lavagem aplástico também pode ser usado como um meio macroscópico para estudar o efeito de produtos químicos plásticos nos microrganismos que colonizam os tecidos vegetais.