Name: Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a monitorar a atividade da PAD4 usando um ensaio baseado em fluorescência com substrato pró-fluorescente. Este método quantitativo permite medir a conversão de arginina em citrulina com alta sensibilidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Lehigh University Start-up Package. Agradecemos ao Dr. Walter Fast por fornecer o plasmídeo GST-PAD4 para expressão de proteínas.

1. PAD4 Transformação, expressão e purificação <ol><li> Para PAD4 Transformação, transformar o plasmídeo pGEX contendo PAD4 GST fusão em E. quimicamente competente Coli (células BL21 (DE3)), as células para a expressão de proteínas utilizando o seguinte procedimento. Prepare (cloreto de cálcio) quimicamente competentes E. Coli (células BL21 (DE3)), as células de acordo com protocolos padrão. <ol><li> Descongelar 50 ul de previamente preparada quimicamente competentes BL21 (DE3) células em gelo e misturar com 1 ul do plasmídeo pGEX contendo o gene PAD4 num tubo de cultura de 5 mL. Incubar a mistura em gelo durante 10 minutos, enquanto agitando a cada 2 min. </li><li> Calor chocar as células colocando a mistura em um banho de água a 42 C ° durante 40 seg. Colocar imediatamente a mistura de células-plasmídeo para trás em gelo durante 2 min para permitir que as células para recuperar. Adicionar 1 ml de caldo LB estéril à mistura e colocar em gelo durante 1 min. </li><li> Incubar o calor células chocados a 37 ° C, agitação a 250 rpm durante 1hr. Pipetar 75 ul das células transformadas numa placa de ágar resistente à ampicilina e incubar a 37 ° C durante 15 h. Placa armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expressão. <ol><li> Picareta 1 colónia de células BL21 (DE3) a partir da placa de ágar e ampicilina-se em 5 ml de LB contendo ampicilina 1x. Colocar na incubadora e agite O / N a 37 ° C. </li><li> Transferir os 5 ml de LB (kits) em 1 L de LB estéril contendo 1x tri-hidrato de ampicilina (PM 403,45 g / mol). Ponto de crescimento num incubador com agitação a 37 ° C. Monitorar a OD 600 do crescimento. Quando o crescimento atinge uma DO600 de 0,3, mova o crescimento em 16 ° C agitando incubadora. </li><li> Ao atingir uma DO600 de 0,6, induzir as células com 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permitir que as células agitar por 15 horas a 16 ° C. </li><li> Células colheita por centrifugação a 4000 xg durante 20 min a 0 ° C. Decantar o sobrenadante e pellet loja a -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Purificação <ol><li> Re-suspender o sedimento contendo o PAD4 expressa em BL21 (DE3) células num tampão de NaCl 50 mM (PM 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (PM 119,98 g / mol), 10 mM de imidazole (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM de ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lisar as células por sonicação durante 15 min a 4 ° C. Após sonicação, centrifugar o lisado celular a 20000 xg durante 20 min a 0 ° C. Deitar fora e salvar sobrenadante. Lote do sobrenadante com glutationa (GSH) esferas de agarose durante 30 minutos à TA. </li><li> Drenar o sobrenadante das esferas de GST / coluna por acção da gravidade. Lavar as pérolas com 4 x 25 ml de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH = 8,0) à temperatura ambiente. </li><li> Eluir PAD4 com 2 x 10 ml de tampão de eluição, 50 mM de tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutationa (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Concentre PAD4 usando 100k MW corte-off tubos de centrífuga e centrifugar a 4000 xg durante 20 min a 4 ° C. Aliquota de proteína em 200 ul volumes de 1,0 ml em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparar soluções estoque para amortecedores <ol><li> Pesam-se cloreto de sódio (NaCl, PM 58,44 g / mol) e preparar uma solução 2 M. Misturar a solução até que clara. </li><li> Pesar Tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparar uma solução 2 M, pH = 8,0. Misturar a solução até que clara. </li><li> Pesam-se di-hidrato de cloreto de cálcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) e preparar uma solução 500 mM. Misturar a solução até que clara. </li><li> Pesar de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparar uma solução 200 mM. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. </li><li> Pesar ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparar uma solução 1 M. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepararuma solução de 0,5% de Triton X-100. </li><li> Pesar o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparar uma solução 100 mM. Misturar a solução até que clara. </li><li> Pesar Z- Arg-Arg-7- amido- metilcumarina cloridrato de 4- (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparar uma solução a 10 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Ensaio a 37 ° C <ol><li> De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 125 mM de ZRcoum na água. Esta solução 125 uM ZRcoum será Solução A. </li><li> Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, e PAD4 5 uM (pH = 8,0). Este será Solução B. </li><li> Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, e 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Este será Solução C. </li><li> Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20° C. Este será Solução D. </li><li> Obter uma placa de 96 poços e designar um número de poços para controlos (sem PAD4) e os poços de ensaio (+ PAD4). </li><li> Pipeta 160 mL de solução B para poços de teste e pipeta de 160 mL de solução de C em poços de controlo. Incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Pipetar 40 ul de solução A em todos os poços e incubar a 37 ° C durante 45 min. </li><li> Pipetar 10 ul de dH2O a metade dos poços de controlo e metade dos poços de teste. Para a outra metade dos poços de controlo e controlos de ensaio e pipetas 10 mL de solução de D. Incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. </li></ol> 4. Ensaio PAD4 à TA <ol><li> De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 50 mM de ZRcoum na água. Esta solução ZRcoum 50 uM será Solução A. </li><li> Preparar um tampão de Na 100 mMCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, e 8 PAD4 uM (pH = 8,0). Este será Solução B. </li><li> Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% e Triton X-100 (pH = 8,0). Este será Solução C. </li><li> Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução D. </li><li> Obter uma placa de 384 poços e poços para designar controles (sem PAD4) e poços de teste (+ PAD4). </li><li> Pipetar 25 mL de solução B para poços de teste e pipeta de 25 mL de solução de C em poços de controlo. Permitir tampão com / sem PAD4 a incubar nos poços durante 20 min à TA. </li><li> Pipetar 25 ul de solução C em todas as cavidades e incubar durante 45 min à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar 10 ul de dH2O a metade dos poços de controlo e metade dos poços de teste. Para a outra metade dos poços de controlo e controlos de ensaio, pipetae 10 ul de solução de D. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 tempo do curso ensaios a 37 ° C e RT <ol><li> De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 125 mM de ZRcoum na água. Esta solução 125 uM ZRcoum será Solução A. </li><li> Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, e PAD4 5 uM (pH = 8,0). Este será Solução B. </li><li> Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução C. </li><li> Obter duas placas de 96 poços e pipeta de 160 mL de solução B em # quantidade de poços (número de poços vai depender de quantos pontos de tempo). </li><li> Incubar uma placa de 96 poços, a 37 ° C. Incubar a outra placa de 96 cavidades, à TA. </li><li> Pipette 40 ul de solução A em todos os poços em ambas as placas de 96 poços e imediatamente pipeta 10 ul de solução C em t = 0 o mínimo de poços. Continue a adição de 10 ul de solução C em pontos de tempo específicos até que todos os poços foram temperada. </li><li> Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. </li></ol> 6. Ensaio de Inibição PAD4 à TA <ol><li> De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução 83 mM de ZRcoum na água. Esta solução ZRcoum 83 uM será Solução A. </li><li> Pesar Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparar uma solução stock de 100 uM. Este será Solução B. </li><li> Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, e 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Este será Solução C. </li><li> Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% e Triton X-100 (pH = 8,0). Thé será Solution D. </li><li> Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução E. </li><li> Obter uma placa de 384 poços e poços para designar controles (sem PAD4), poços de teste (+ PAD4) e poços de inibição (PAD4 + Cl-amidina). </li><li> Pipetar 25 mL de solução C em poços de teste e pipeta de 25 mL de solução de D em poços de controlo. Permitir tampão com / sem PAD4 a incubar nos poços durante 20 min à TA. </li><li> Pipetar 10 ul de solução B em poços de inibição e incubar durante 20 min a RTe. </li><li> Pipetar 15 ul de solução A em todos os poços e incubar durante 45 min à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar 10 mL de solução E para todos os poços. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. </li></ol> 7. Ensaio Lisado celular brutoà TA <ol><li> Após a colheita de células PAD4 crescimento de 1 L, ressuspender as células em 10 ml de 50 mM Tris, 50 mM de NaCl, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM de ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lisar as células por sonicação durante 15 min a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado celular a 20000 xg durante 20 min a 0 ° C. Concentra-se o sobrenadante claro até metade do volume por centrifugação a 4.000 rpm a 4 ° C utilizando 100k MW tubos de centrífuga de corte. </li><li> De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 250 mM de ZRcoum na água. Esta solução 250 uM ZRcoum será Solução A. </li><li> Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, e TCEP 2 mM (pH = 8,0). Este será Solução B. </li><li> Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução C. </li><li> Obter um preto placa de 384 poços e designcomeu poços para controles (não lisado celular) e poços de teste (+ lisado celular). </li><li> Pipetar 100 mL de solução B para todos os poços e pipeta 60 mL de lisado de células nos poços de teste. Incubar durante 20 min à TA. </li><li> Pipetar 40 ul de solução A em todos os poços e incubar durante 45 min à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar 10 ul de solução C a todos os poços. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Obter uma fluorescência leitura em leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. </li></ol>

<ol><li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+protein+language+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li>
<li>Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li>
<li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination%3A+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li>
<li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li>
<li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li>
<li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li>
<li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination%2C+gene+regulation%2C+health+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li>
<li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+serological+gap%3A+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li>
<li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PADI4+and+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7(2010).</li>
<li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676(2012).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li>
<li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4+%28PAD4%29%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+peptidylarginine+deiminase+%28PAD%29+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li>
<li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4%3A+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+design%2C+synthesis%2C+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li>
<li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li>
<li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+citrulline%3A+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching%3A+multicolor+visualization+of+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li>
<li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li>
<li>Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li>
<li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+stabilizes+histone+H2A%2FH2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, um ensaio baseado em fluorescência foi desenvolvido com sucesso que monitora a atividade do PAD4. O ensaio provou ser incrivelmente robusto em várias condições de alto rendimento e também é compatível com lisados de células inteiras37.
A afinidade entre as proteínas histonas e as fitas de DNA que as cercam diminui devido à neutralização da carga positiva na cadeia lateral da arginina após a citrulinação. Previu-se que a neutralização da cadeia lateral da arginina poderia ser a...

Um grande número de proteínas de mamífero são fortemente modificado pela acção de enzimas após a biossíntese de proteínas pelo ribossoma. Estas modificações pós-translacionais (PTMs) pode aumentar significativamente a diversidade funcional do proteoma mudando o tamanho, carga, estrutura, e estado de oligomerização (entre outras características) de proteínas 1-3. Como resultado, a variação na estrutura da proteína podem conduzir a consequências fisiológicas, tais como a degradação das proteínas, a diferenciação celular, a sinalização, a modulação da expressão do gene, e interacções proteína-proteína. Enquanto essas modificações são predominantes em uma grande porcentagem de todas as proteínas humanas, o terminal termina em proteínas histonas passam por um número anormalmente elevado de modificações covalentes 4. Proteínas histona são uma família de proteínas estruturais que facilitam a condensação de ADN genómico. Modificações covalentes das caudas das histonas não estruturados são realizadas e regulado por uma series de enzimas que podem catalisar a modificação covalente de resíduos (escritores), inverter as mesmas modificações (borrachas), e distinguem entre as mudanças que estão sendo impressas para as caudas das histonas (leitores) 5-7. Na verdade, a maioria dos PTMs conhecidos pode ser observado dentro deste segmento curto da histona, incluindo a metilação, fosforilação, acetilação, sumoilação, ubiquitinação, e citrulinação 8. Citrulinação envolve a conversão de peptidil-arginina para o t ARN não codificado peptidil-citrulina (Figura 1A). As proteínas, responsáveis ​​por esta cadeia lateral de neutralização, são membros da DAP (p eptide um eiminase rginine d) a família de proteínas, todas as quais são enzimas dependentes de cálcio 9,10.. Até à data, cinco membros da família PAD foram descritos (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Cada membro desta família parece alvejar proteínas celulares distintas e também exibe uniperfis de distribuição de tecido Que. PAD4 é o único membro desta família de proteínas conhecida por estar localizada dentro do núcleo através de uma sequência de localização nuclear 11. Deste modo, tem sido demonstrado que deiminate um número de alvos nucleares, incluindo cadeias laterais de arginina sobre as caudas N-terminais das histonas H2A arginina resíduo 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Enquanto cada uma das isozimas PAD têm funções fisiológicas específicas e críticos, PAD4 tem recebido bastante mais atenção devido ao seu papel numa série de processos humanos em ambas as células doentes e saudáveis. Recentemente, PAD4 mostrou ser um membro da rede transcricional pluripotência 14. Ambos os níveis de expressão PAD4 e atividade mostraram-se elevados durante a reprogramação e estatais chão estados pluripotentes em camundongos. Ao controlar a regulação de genes de células-tronco, PAD4 pode reter um papel crucial na eficiência de reprogramação celular. PAD4 também tem sido implicado naformação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, o qual após a ligação de agentes patogénicos possibilitar a sua recarga do sistema. O hypercitrullination de proteínas histona por PAD4 induz descondensação da cromatina, o que serve como o material de base para o encapsulamento de bactérias patogénicas por a armadilha extracelular, assim, afastar infecções bacterianas 15,16. Além disso, foi encontrado PAD4 a desempenhar um papel activo num número de doenças humanas. Foi previamente mostrado que a expressão aberrante de PAD4 está associada com o aparecimento e gravidade da artrite reumatóide, a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e esclerose múltipla 17. Na verdade, a presença de anticorpos anti-citrulinados proteína é um dos biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico mais fiáveis ​​e definitivas 18 de artrite reumatóide. Do mesmo modo, a actividade desregulada PAD4 foi recentemente observado num número de cancros humanos incluindo ovário, mama, pulmão, umad cânceres de esôfago 19-22. A ligação entre PAD4 e cancro tem sido mostrado para ser mediada através do oncogene ELK1 ou através da proteína supressora de tumor p53 22,23 e trabalho anterior sugeriu que PAD4 poderia ser um alvo terapêutico anti-cancro da novela 17,24,25. Como prova do princípio do estudo, a depleção de PAD4 através shRNA na linha celular de cancro colo-rectal HCT116 foi revelado para ser suficiente para induzir a apoptose e paragem do ciclo celular 26. Um inibidor irreversível PAD4 recentemente desenvolvido conduziu a uma redução de setenta por cento da massa do tumor em ratos 27. Muito notavelmente, a inibição PAD4 apareceu para actuar como uma terapia-alvo que resultou na morte selectiva de células cancerígenas, enquanto poupando células não transformadas. O uso de pequenas moléculas para desligar a função de PAD4 pode vir a ser uma nova e poderosa estratégia para atingir as células cancerosas ou para aumentar quimioterápicos de câncer existentes 28. Infelizmente, a potenda inibidor reversível PAD4 tem ainda a ser descoberto. Uma série de inibidores covalentes foram desenvolvidos usando o / alça imidine flúor cloro que imita o substrato arginina 27,29,30 e provaram ser ferramentas práticas para a compreensão do papel da PAD4 em ambas as células estaduais saudáveis ​​e doentes. No entanto, estas moléculas inibem a todos os PADs activos com potência similar. Portanto, a necessidade de um ensaio fácil, que relata sobre a actividade de PAD4 é crucial. Até à data, PAD4 ensaios foram descritos que vincular a liberação de amônia a partir da reação de uma leitura colorimétrica 31, utilizar um análogo do substrato chloroamidine fluorescente etiquetado para teste de polarização fluorescente de 32, contam com a reação assistida por ácido entre glioxal e citrulina 33, e par a actividade PAD4 a um passo de fluorescência dequenching 34. Destes, apenas a estratégia haloacetamidine modificador covalente tem provado ser compatíveis com scre de alto rendimentoplataformas ening 32,35,36. Nós descrevemos um ensaio baseado fluorescência fácil, que mede de forma confiável a atividade de PAD4. O ensaio, que exibe uma forte relação de sinal-para-ruído, a velocidade de análise, e robustez de medição, tem o potencial para descobrir um verdadeiramente potente e selectivo inibidor PAD4.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><<td>a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicilina Trihidratada (Pó Esbranquiçado), BioReagentes</td><td>Fisher Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Isopropiltiolactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>Todos os Sais Tampão&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pode comprar da Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutationa (GSH) agarose&nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Loja em 4 &deg; C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>Cloroamidina&nbsp;</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td>10599</td><td>Armazenar a -20 &deg; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 e 384)</td><td></td><td></td><td>Compre na Corning; Software leitor de microplacas Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control</td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter<a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento baseado em fluorescência de pad4 atividade através de um substrato analog pro-fluorescência

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Modificações pós-traducionais podem levar a estados funcionais de proteínas alterados, aumentando as variações covalentes nas cadeias laterais de muitos substratos proteicos. As caudas das histonas representam um dos trechos mais fortemente modificados dentro de todas as proteínas humanas. A peptidil-arginina deiminase 4 (PAD4) demonstrou converter resíduos de arginina em resíduos de citrulina não codificados geneticamente. Poucos ensaios descritos até o momento foram operacionalmente fáceis com sensibilidade satisfatória. Assim, a falta de ensaios adequados provavelmente contribuiu para a ausência de potentes inibidores não covalentes de PAD4. Aqui, um novo ensaio baseado em fluorescência que permite o monitoramento da atividade do PAD4 é descrito. Um análogo de substrato pró-fluorescente foi projetado para ligar a atividade enzimática do PAD4 à liberação de fluorescência após a adição da tripsina protease. Foi demonstrado que o ensaio é compatível com condições de triagem de alto rendimento e tem uma forte relação sinal-ruído. Além disso, o ensaio também pode ser realizado com lisados de células brutas contendo PAD4 superexpresso.

Inicialmente, foi demonstrado que ZRcoum pode informar sobre a actividade de PAD4 num formato de placa de 96 poços. Os poços foram incubados com o substrato ZRcoum e na presença / ausência de PAD4. Após um período de incubação de 45 min a 37 ° C, a fluorescência foi medida com um 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Como esperado, os níveis permaneceram baixos de fluorescência como o fluoróforo dentro ZRcoum (ou a citrulina ZRcoum) ma...

PAD4 é uma enzima responsável pela conversão de peptidil-arginina em peptidil-citrulina. A desregulação do PAD4 tem sido implicada em várias doenças humanas. Um ensaio PAD4 baseado em fluorescência fácil e compatível com alto rendimento é descrito.

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter informações quantitativas sobre o nível de atividade da almofada quatro em um ensaio fácil de reproduzir usando fluorescência. Isso é conseguido pela incubação da almofada quatro com o análogo do substrato de design ZR Co. A proteína é incubada à temperatura ambiente ou a 37 graus Celsius para permitir a conversão do derivado da arginina no produto da citralina, o que resulta em uma modificação covalente do substrato. Em seguida, a tripsina é adicionada à solução para gerar a diferença do sinal fluorescente.Os resultados mostram a adição de pad quatro ativo a uma solução contendo o substrato fluorescente prof. leva a uma mudança covalente com base em sua diminuição da suscetibilidade à tripsina e, portanto, aos sinais fluorescentes mais baixos. A principal vantagem de nossa técnica sobre as técnicas existentes, como a que analisa a liberação do subproduto volátil da amônia, é que monitoramos a modificação do substrato usando fluorescência.Demonstrando esta técnica estarão Mary Saki e Jonathan Fiera para o meu laboratório Para trabalhar com o plasmídeo pgx pad quatro primeiro transforme a fusão pad 4G ST em células E coli quimicamente competentes para a expressão da proteína pad four todas as células no gelo. Em segundo lugar, misture as terceiras células com um microlitro do plasmídeo PGX contendo o gene pad four em um tubo de cultura de cinco mililitros. Incube a mistura no gelo por 10 minutos e agite suavemente a cada dois minutos.Em seguida, cada um dá choque nas células a 42 graus Celsius por 40 segundos. Imediatamente após amarrar a mistura de plasmídeo celular de volta ao gelo por dois minutos para que as células possam se recuperar. Agora adicione um mililitro de LB estéril e mantenha as células resfriadas por mais um minuto.Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por uma hora. Coloque-os agitando a 250 RPM após a incubação, pipete 75 microlitros das células transformadas em uma placa de ágar resistente à ampicilina e incube a placa a 37 graus Celsius por 15 horas. Armazene este prato a quatro graus Celsius.Transfira uma colônia de células transformadas para cinco mililitros de LB contendo ampicilina. Coloque o tubo em uma incubadora e agite durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte.Transfira a cultura inicial de cinco mililitros para um litro de STO L LB contendo um x ampicilina tri. Monitore o OD 600 das células à medida que crescem a 37 graus Celsius. Quando sua absorbância atinge 0,3.Transferir o balão para uma sala a 16 graus Celsius e continuar agitando. Continue monitorando o OD do crescimento. Quando o OD da cultura atinge 0,6.Induza as células com 0,3 milimolar isopropil THAG GTO. Deixe as células tremerem por 15 horas a 16 graus Celsius. É crucial certificar-se de que a temperatura de crescimento esteja em 16 graus Celsius antes de iniciar a indução com IPTG.No dia seguinte, ofereça as células por centrifugação a 4.000 G por 20 minutos a zero graus Celsius ou fora do agente SUP e armazene o pellet celular a menos 80 graus Celsius para coletar a almofada. Quatro proteínas ressuspendem o pellet de célula de transformação em tampão contendo fenol EOL, fluoreto de metil suen e dihi três etol. Em seguida, estão as células usando sonicação por 15 minutos a quatro graus Celsius, após a sonicação centrifugar os lisados a 20.000 vezes G por 20 minutos e a zero graus Celsius.Colete o supinato e incuba-o com grânulos de glutationa aeros por 30 minutos a quatro graus Celsius. Drene o supinato dos grânulos GST por gravidade após a coleta do fluxo. Lave as contas quatro vezes com 25 mililitros de PBS a quatro graus Celsius.Em seguida, elua a proteína da almofada quatro dos grânulos usando 10 mililitros de tampão eluciano concentrado almofada quatro no tampão eluciano usando tubos de centrífuga de corte de peso molecular de 100 K. Finalmente, Eloqua a proteína purificada da almofada quatro em volumes de 200 microlitros para armazenamento a 80 graus Celsius negativos. Para este procedimento, prepare a solução de trabalho micromolar 83 da solução marcada com ZR co A. Prepare também as soluções B, D e a solução de quatro soluções C.In preparar a solução E, certifique-se de misturar até que o TRIPSIN se dissolva.Obtenha uma placa de 384 poços e designe o bloco de notas, quatro poços de controle, os poços de teste e os poços de inibição para o bloco quatro mais cloro amadina. Em seguida, adicione 25 microlitros de solução C a cada poço de teste e 25 microlitros de D a cada controle. Bem, incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente.Após 20 minutos, adicione 10 microlitros da solução B aos poços de inibição e aguarde mais 20 minutos. Em seguida, adicione 15 microlitros de solução A a todos os poços. Em seguida, aguarde 45 minutos.Após 45 minutos, adicione 10 microlitros de solução E a todos os poços e espere mais 10 minutos antes de fazer medições de fluorescência. Por fim, use um leitor multimodal para coletar os dados de emissão. Zar CO foi incubado com e sem pad four por 45 minutos sem pad four, a adição de tripsina livre, os níveis de Fluor e fluorescência aumentam e a presença de pad quatro zar é modificada e a tripsina não libera o Fluor diminuindo assim a fluorescência.O ensaio foi testado em placas de poços de alta densidade à temperatura ambiente para acomodar procedimentos de triagem de alto rendimento à temperatura ambiente. Os sinais permaneceram praticamente inalterados em comparação com os obtidos a 37 graus Celsius. A reação prosseguiu mais lentamente à temperatura ambiente.Foi concluído em 45 minutos. A estabilidade do PED quatro no tampão de reação foi então testada como alta estabilidade tão importante para triagem de alto rendimento durante um período de 15 horas. Nenhuma perda de atividade enzimática foi detectada.A inibição do PLA quatro com cloro AMADINA mostra tendências esperadas nessas condições de teste de temperatura ambiente. Para desafiar a robustez do ensaio PAD four zku, ele foi usado para testar um lisado celular bruto de células de e coli expressando GST pad four. Quando testado nas mesmas condições que a almofada GST purificada quatro, a fluorescência foi observada conforme o esperado.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar o pad quatro ativo e monitorar sua atividade usando este ensaio baseado em fluorescência fácil e confiável usando um substrato de fluorescência prof.

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Vamos descrever um método que mede a cinética de transporte de íons de proteínas da membrana juntamente com site-specific análise das mudanças conformacionais usando fluorescência em células individuais. Esta técnica é adaptável a canais iônicos, transportadores e bombas de íons e pode ser utilizado para determinar restrições de distância entre as subunidades da proteína.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

A ativação do Ser/Thr kinase multifuncional AURKA é marcada por sua autofosforilação em Thr288. Sondas fluorescentes que dependem de FRET podem discriminar entre seus estados inativos e ativados. Aqui, ilustramos algumas estratégias para a engenharia de sondas, juntamente com um protocolo RÁPIDO DE FRET para acompanhar a ativação da quinase ao longo da mitose.

Monitoramento em tempo real da aurora quinase Uma ativação usando biosensores de FRET conformacional em células vivas

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ  na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

Aprenda a monitorar a atividade da PAD4 usando um ensaio baseado em fluorescência com substrato pró-fluorescente. Este método quantitativo permite medir a conversão de arginina em citrulina com alta sensibilidade.

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Explorar mais vídeos