Name: Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a diferenciação de células T a partir de células-tronco embrionárias de mouse usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. Este protocolo detalhado permite estudar eventos moleculares e celulares da hematopoiese.

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Agradecemos a Joon Kim pela assistência especializada em citometria de fluxo. A pesquisa nos laboratórios dos autores é apoiada pelo programa SCORE dos Institutos Nacionais de Saúde (concessão SC1-GM095402 para BDO) e pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (para JCZP). J.C.Z.P. é apoiado por uma Cátedra de Pesquisa do Canadá em Imunologia do Desenvolvimento. A infraestrutura de pesquisa biomédica do Hunter College é apoiada em parte pelo programa NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) por meio de MD007599 de subsídios. Também reconhecemos o Programa de Ciência de Células-Tronco do Estado de Nova York (NYSTEM) por seu apoio ao início da pesquisa com células-tronco no Hunter College por meio de C023048 de subsídios.

1 Preparação de Meios de Cultura, Citocinas e placas gelatinizado <ol><li> Preparar meios celulares ES utilizando Modificação de Meio de Eagle (DMEM) da Dulbecco com glucose elevada e piruvato de sódio. Adicionar 20% CES qualificado de Soro Fetal Bovino (FBS), 1% Penicilina / Estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de HEPES, 1% de não-aminoácidos essenciais, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoetanol. Esterilizar meios de células ES por filtração. </li><li> Prepare mídia OP9, fazendo 1 L de alfa Meio Essencial Mínimo (MEM-α) de pó de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina. Inverta para misturar. Esterilizar por filtração em duas aliquotas de 500 ml. NOTA: O uso de meios feitos de pó é recomendado e susceptível de produzir a manutenção das células OP9 melhorado e em resultados de diferenciação in vitro. Esta abordagem tornou-se o nosso procedimento padrão. No entanto, notamos também that que ter, por vezes, utilizados de líquidos pré-fabricados α-MEM com sucesso adequada. </li><li> Prepare a meio de congelação por adição de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a 90% de FBS. Agitar suavemente e esterilizar por filtração. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare 2,000x Flt-3 ligando (10 pg / ml) por dissolução humana recombinante Flt-3 ligando (Flt-3L), em meio completo OP9 a 10 ug / ml. Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. Siga as recomendações do fornecedor sobre a estabilidade e armazenamento. NOTA: A estabilidade de Flt-3L é curto (1 mês a 4 ° C ou 3 meses a -80 ° C). </li><li> Prepare 1.000x IL-7 (1 ug / ml), utilizando meios de OP9 completa. Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. Seguir as recomendações do fornecedor e na estabilidade de armazenamento (IL-7 é estável durante até 12 meses a -80 ° C). </li><li> Prepare 1.000x Factor Inibidor da Leucemia (LIF) (10 ng / ml) por uma diluição de 10 7 unidades de LIF i 01:10n meios de células ES. Alíquota da loja a 4 ° C. Certifique-se de observar a data de validade fornecido pelo fabricante nos frascos alíquotas. NOTA: O produto é estável em concentrados e diluídos formar pelo menos 18 meses a partir da data de fabricação. </li><li> Prepare a placas de 6 poços gelatinizados por adicionar 1,5 ml de solução de gelatina a 0,1% em cada cavidade de uma placa de 6 poços. Deixar pratos na capa estéril à temperatura ambiente com tampas, o que permite, pelo menos, 30 minutos para o revestimento. Os pratos podem também ser deixado durante a noite numa incubadora humidificada. Remova qualquer solução de gelatina sobra pouco antes de semeadura de células. Não deixe que a solução de gelatina a secar completamente para fora do poço. </li></ol> 2 Preparação e Manutenção de células alimentadoras e mouse Células-Tronco Embrionárias (MESC) NOTA: Incubar todas as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. <ol><li> Descongelamento embrionárias de camundongos fibroblastos (MEF) <ol><li> Quick-descongelar um frasco congelado (~ 5 x 10 6 </sup&gt; células / frasco) de mitomicina (ou de outra forma tratados mitoticamente-C) MEFs e transferi-las para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 8 mL de meio de células ES para células descongeladas, de uma forma gota a gota, para diluir gradualmente o DMSO a partir do meio de congelamento. </li><li> Células de centrifugação a 400 x g a 4 ° C durante 5 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 3 ml de meio de células ES. </li><li> Preparar um tubo de centrífuga de 50 ml com 33 ml de meio de células pré-aquecida ES. Adicionar os 3 ml de MEFs ressuspensos para levar o volume final para 36 ml. </li><li> Distribuir 3 ml das MEFs ressuspensos em cada poço de placas de dois gelatinizado 6 poços. Colocar as placas na incubadora durante pelo menos seis horas para permitir que as células se fixem e se espalhar para fora antes de semear as mESCs sobre eles. Essas camadas alimentadoras mitoticamente pode ser usado por vários dias após a semeadura inicial, se seus meios de comunicação é trocada a cada 2-3 dias. NOTA: MEFs recentemente presas podem também ser utilizados. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> MESCs Sementeira <ol><li> Quick-descongelar um frasco com um clone MESC congelado no 37 ° C banho de água e preparar células, conforme descrito no 2.1.1-2.1.3. NOTA: congelar 2 frascos de MESC de um poço de uma placa confluente de 6 poços. </li><li> Retirar mídia de um poço (MESC por clone) da placa de 6 poços com monocamadas de MEF presos (preparado no passo 2.1.5) e semear a 3 ml de mESCs em cima da monocamada de MEF. Adicione 3 mL de 1.000x LIF (10 ng / ml). Voltar pratos na incubadora. </li></ol></li><li> Manutenção de células ES e tripsina mediada passagem Nota: A alteração de mídia diariamente, ou divisão com base em confluência dos MESC. Idealmente, colheita e dividir / re-placa das células a cada dois dias. <ol><li> Remova a mídia de células ES e lavar mESCs com 2 ml de PBS. Remover PBS. Adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina e incubação a 37 ° C durante 3-5 min. </li><li> Recolher as células tratadas com tripsina e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 ml. Vigorosamente pipete a suspensão de células para quebrar aglomerados de mCES. Adicionar 2 ml de meio completo de células ES para a suspensão de células para neutralizar a tripsina. </li><li> Células de rotação a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de mídia célula ES. </li><li> Remova a mídia da placas de 6 poços contendo monocamadas MEF presos preparados. Adicionar a quantidade adequada de suspensão de células (com base na razão de separação desejado) em 3 ml de meio de células ES para cada cavidade a ser semeadas. Adicione 3 mL de 1.000x LIF. A confluente MESC bem dividida 1: 6 estará pronto para a passagem em 2 dias. </li></ol></li><li> OP9 / manutenção de células OP9-DL1 <ol><li> Descongelar um frasco de células OP9 (siga os passos 2.1.1-2.1.3 usando a mídia OP9) </li><li> Adicionar 7 ml de meio OP9 10 cm de prato de cultura de tecidos. Adicionar os 3 ml de células ressuspensas em um modo gota a gota, a distribuição de células ao longo da placa. Colocar as células durante a noite na incubadora. </li><li> Verifique a confluência das células OP9 no dia seguinte. Se o prato contém muitas células flutuantes mortos, remove os meios de comunicação e adicionar 10 ml de meio OP9 fresco. Retorne o prato para a incubadora se confluência quase cheio não é observado. Split (usando tripsina) 1: 4 a quase monocamada confluente OP9. NOTA: As placas devem chegar mesmo nível confluência novamente em cerca de 2 dias. Tome cuidado para não deixar que as células se tornam mais OP9-confluentes. </li><li> Congelar as passagens iniciais de células OP9 como ações de expansão. NOTA: Nós congelamos 2 frascos de células OP9 de um próximo confluente prato de 10 cm. Cada frasco de estoque de expansão pode ser ainda mais propagada para criar estoques de trabalho que são posteriormente utilizados na Mesc experimentos de co-cultura. Mantenha todas as ações OP9 congelados em nitrogênio líquido e não no freezer -80 ° C, uma vez que temperaturas flutuantes podem influenciar negativamente a qualidade dos congelamentos. </li></ol></li></ol> 3. OP9-DL1 Co-cultura Procedimento <ol><li> Preparações co-cultura <ol><li> Cerca de uma semana antes do início de um co-cultura, descongelar MEFs, mESCs e sto celular OP9 trabalhocks. Como as células OP9-DL1 não são necessários até que co-cultura dia 8, descongelar as células OP9-DL1 durante os três primeiros dias após o início co-cultura. Manter ou congelar todas as células, conforme necessário. </li><li> Determinar o número inicial de placas de 10 cm com monocamadas de células OP9 preparados para atingir 80% de confluência em co-cultura dia 0 com base na escala da experiência (por exemplo, número de clones a serem diferenciados Mesc e número de pontos no tempo de co-cultura para ser analisada). Para se preparar para uma co-cultura, dividida próximo confluente prato de OP9 células entre 1: 4 e 1: 6 dois dias antes de quando serão necessários os monocamadas. NOTA: Será necessário pelo menos uma placa por ESC clone. Tipicamente, um único clone CES semeadas numa única placa (como descrito abaixo), no dia 0 devem produzir células suficientes para semear placas de seis no dia 5 de passagem. Cada dia 5 chapa vai permitir que um ponto de tempo posterior análise. </li><li> Desde monocamadas OP9 será continuamente necessário para co-cultura passagem, ter o cuidado de sempre maintaem um número adequado de placas de cultura de OP9 adicionais em paralelo com a co-cultura. </li></ol></li><li> Dia 0: Iniciação de co-cultura <ol><li> Recolhe MESC como em 2.3.1-2.3.4. Contar as células. </li><li> Para cada clone MESC preparar 5 x 10 4 MESC em 10 ml de meio OP9 por placa. NOTA: Apesar de não tê-lo usado, notamos que um meio alternativo que consiste em α-MEM, 10% de FBS, e 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol também foi relatado para o uso em diferenciação co-culturas 10. </li><li> Remova a mídia velha de OP9 pratos e adicione os 10 ml de suspensão MESC aos pratos tendo o cuidado de distribuir as células de maneira uniforme em toda a placa. Coloque os pratos no 37 ° C incubadora. </li></ol></li><li> Dia 3: Troca de mídia <ol><li> Retirar pratos da incubadora e observar ao microscópio. Colônias deve começar a perder brilho e parecem achatadas. </li><li> Remova a mídia da pratos e adicione delicadamente 10 ml de fresco OP9mídia. </li><li> Retorne os pratos co-cultura para a incubadora. Monitorar visualmente a formação de colónias mesoderme semelhante diária para informar o tempo de preparação OP9 alimentador de monocamada para a próxima passagem (dia 5), ​​a qual não deve ser realizada até que ~ 80-90% das colónias apresentar visualmente a morfologia mesoderme semelhante. Adiamento máxima do dia 5 passo transferência de células é de 2 dias. </li></ol></li><li> Dia 5: tripsina passagem mediado com pré-galvanização. NOTA: Prepare com antecedência um número adequado de placas de 10 cm com células OP9 otimamente confluentes. Prossiga com os próximos passos somente se as co-culturas exibir visualmente os recursos descritos na etapa 3.3.3 (ver resultados também representativos). <ol><li> Remova a mídia dos pratos co-cultura. Adicionar 4 ml de PBS para lavar. Agitar o PBS e remover. Adicione 4 ml de tripsina a 0,25% e colocar os pratos na incubadora para ~ 5 min. </li><li> Romper a camada de células tripsinizados por pipetagem vigorosa, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar excessiva, até que um, a suspensão de célula única principalmente homogénea é atingida. </li><li> Adicione 4 ml de meio OP9 completos e misture por pipetagem. Transferência de células para um novo, vazio placa de 10 cm e lugar na incubadora durante 30 minutos para permitir que as células OP9 a aderir ao prato. Este &quot;pré-plaqueamento&quot; passo reduz o número de células OP9 transferidos para o próximo passo de co-cultura. </li><li> Prepare 50 ml tubos de centrífuga com coadores de células de 40 m. </li><li> Recolher as células não-aderentes, a partir da placa pré-preparada e passá-los através do filtro celular para dentro do tubo. Lavar o prato gentilmente com 6 ml de PBS e passá-lo através do mesmo filtro, deixando as células OP9 ligados atrás. </li><li> Células de centrifugação a 400 x g 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 3 ml de meio completo OP9. Contar as células. </li><li> Remova a mídia de placas de 10 cm com células OP9 otimamente confluentes. </li><li> Para cada ponto de tempo de análise, de semente de 5 x 10 5 células em mono OP9camada de 10 ml volume final. </li><li> Adicionar 5 ng / ml humana recombinante Flt-3L e colocar os pratos na incubadora. </li></ol></li><li> Dia 8: células progenitoras hematopoéticas (HPC) coleção NOTA: Prepara-se previamente uma quantidade adequada de placas de 6 poços com monocamadas OP9 ou OP9-DL1 células de modo a que eles vão ser ~ 80% confluentes em tempo para este passo. <ol><li> Prepare 50 ml tubos de centrífuga com 40 mM filtros. </li><li> Retirar as placas do incubador e observa ao microscópio. Cachos brilhantes de HPCs deve ser frouxamente ligado à monocamada OP9. Recolher o maior número dessas células quanto possível, lavando (mas não excessivamente interromper) a monocamada OP9 com uma pipeta e os meios de comunicação existente no prato. Para evitar a formação de espuma, sempre deixar pelo menos 1 ml da mídia na ponta da pipeta durante esta coleção HPC / etapa de lavagem. </li><li> Passar as células através do filtro de 40 um para um tubo. Adicione 8 ml de PBS para a mesma placa e verifique sob o microscópio, se todos nós HPCsre colhido. Repetir o passo de lavagem / recolha com PBS e (se necessário) com uma lavagem mais forte. Estirpe das células no interior do tubo que já contém as células a partir da mesma placa. </li><li> Células de centrifugação a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Prepare uma mistura de mestre de 3 ml (por placa semeada no dia 5) de mídia OP9 com 5 ng / ml Flt-3L e 1 ng / ml de IL-7. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em media OP9 com Flt-3L + IL-7 mix master (3 ml para cada 10 centímetros prato processado). Transferir as células recolhidas a partir de cada placa para um poço de uma placa de 6 poços com células OP9. <ol><li> Para dirigir as células para monocítica, B ou célula linhagens eritróide, semear as células coletadas em OP9 células. Para obter células T, semear as células em monocamadas de células OP9-DL1. </li></ol></li><li> Colocar as placas de 6 poços em incubadora. </li></ol></li><li> Dia 10: Troca de mídia <ol><li> Prepare um tubo de centrífuga de 15 ml para cada distinta MESC clone-alimentador tipo de célula Combinação em co-cultura. </li><li> Prepara-se uma mistura principal de meios OP9 com 5 ng / ml de Flt-3L e 1 ng / ml de IL-7. Preparar 3 ml para cada poço. </li><li> Suavemente recolher meio de cada poço da placa de 6 poços, combinando meios de comunicação de múltiplos poços que contêm o mesmo clone de alimentador combinação tipo de célula ESC. </li><li> Adicionar 2 ml de mistura principal mídia OP9 (ver 3.6.2) em cada poço. </li><li> Centrifugar os meios recolhidos a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cada pellet (muito pequena se visível) em 1 ml de OP9 master mix de mídia (ver 3.6.2) por poço originalmente coletados na etapa 3.6.3. </li><li> Distribuir 1 mL de células para cada poço de volta a partir do qual os meios foram inicialmente recolhidos elevando o volume de cada poço a 3 ml. Retorne os pratos para a incubadora. </li></ol></li><li> Dia 12: Nenhuma passagem de tripsina NOTA: Prepare com antecedência um número adequado de pratos 6 poços com células OP9 ou OP9-DL1 para que possam ser perfeitamente confluentes a tempo para este step. Dia 12 é ideal para análise de citometria de fluxo de desenvolvimento eritróide, monocítica, e as células T da fase inicial. <ol><li> Prepara-se uma mistura principal (3 ml para cada poço que continuará em co-cultura) de meios de OP9 com 5 ng / ml de Flt-3L e 1 ng / ml de IL-7. </li><li> Prepare 50 ml tubos de centrífuga com 40 mM filtros (um para cada clone-alimentador combinação tipo de célula ESC em co-cultura). </li><li> Vigorosamente pipetar os meios de comunicação existentes em cada cavidade para desagregar todas as células (incluindo a monocamada) no poço. Continue com pipetagem vigorosa até que um estado semelhante a uma suspensão de células individuais é alcançado. </li><li> Passe as células coletadas através do filtro para dentro do tubo. Adicionar 3 ml de PBS em cada poço para lavar e recolher todas as células restantes. Passa através de células do mesmo filtro. Combine as células de vários poços contendo o mesmo clone-alimentador combinação tipo de célula ESC. </li><li> Descartar o coador de células utilizadas e remover uma alíquota equivalente a uma cavidade (~ 6 ml) para qualquer pretendidacitometria de fluxo (ou outro) analisa a ser realizado no mesmo dia. Armazenar essas aliquotas sobre gelo antes da utilização. </li><li> Células de centrifugação a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento dos tubos de centrífuga de 50 ml em 3 ml de mistura principal por poço para ser re-semeadas. Adicionar 3 ml por cavidade de cada suspensão de célula para o tipo de células de alimentação apropriada e colocar os pratos na incubadora. </li></ol></li><li> Dia 14: Troca de mídia <ol><li> Siga as etapas descritas na seção 3.6. </li></ol></li><li> Dia 16: No trecho de tripsina NOTA: Prepara-se por avanço pratos de 6 poços de células OP9 ou OP9-DL1 optimamente confluentes para este passo. NOTA: Dia 16 é ideal para análise de citometria de fluxo de linfócitos B e células T fase secundária. <ol><li> Siga as etapas descritas na seção 3.7. </li></ol></li><li> Dia 18: Troca de mídia <ol><li> Siga as etapas descritas na seção 3.6. </li></ol></li><li> Dia 20: Nenhuma passagem de tripsina NOTA: 20 i Dias ideal para citometria de fluxo análises de médio a fase final de desenvolvimento de células T. <ol><li> Siga as etapas descritas na seção 3.7. Se desejar, levar diferenciar células passado dia 20 de mudança media alternada e sem tripsina passagens a cada dois dias, com acompanhamento diário da taxa de expansão dos linfócitos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O sistema OP9-DL1 co-cultura foi utilizada para estudar o papel de vários produtos de genes durante o desenvolvimento de tipos de células do sangue a partir de células estaminais. 8,12,13 Provou também um modelo eficaz para estudar a função de genes de DNA regulador durante a diferenciação celular 9,14. Usando essa abordagem como uma alternativa aos modelos inteiros rato pode render uma considerável economia de tempo e custo de experimentos que abordam muitas questões básicas na hematopoiese. No en...

Um sistema de cultura de células foi estabelecido no qual células-tronco embrionárias de camundongo (mESC) são diferenciadas em células T in vitro.1 Este sistema explora a capacidade da sinalização Notch de impulsionar a diferenciação das células T. 2 A linhagem celular OP9-DL1 foi criada pela transdução de células OP9 derivadas da medula óssea3 com um ligante Notch, semelhante ao Delta 1 (DL1). 4 A ativação da cascata de sinalização Notch in vitro facilita o desenvolvimento de células T com a exclusão de outras linhagens celulares. Com a inclusão de citocinas apropriadas, este sistema fornece um "microambiente" de cultura de células que suporta o avanço sequencial de mESC em direção a linhagens de células T hematopoiéticas e, finalmente, T Este sistema suporta a identificação por citometria de fluxo de células T nos vários estágios de desenvolvimento observados durante a ontogenia normal de células T no timo. Para investigar questões selecionadas relacionadas ao desenvolvimento de células T, este procedimento tornou-se uma alternativa atraente aos modelos de camundongos inteiros in vivo 5 e métodos de cultura de órgãos tímicos fetais in vitro usados para induzir o desenvolvimento de células T a partir de precursores hematopoiéticos derivados de células-tronco embrionárias de camundongos. 6 A principal vantagem do sistema de co-cultura OP9 é que ele envolve técnicas de cultura de células padrão e diretas e não depende do uso contínuo de animais experimentais. 
Seguimos um protocolo detalhado e publicado anteriormente em nossos experimentos usando essa abordagem. 7 Utilizamos essa tecnologia para examinar os produtos de diferenciação hematopoiética de clones mESC não manipulados, clones mESC de alta qualidade escolhidos a dedo para fazer embriões quiméricos8 e clones ESC transfectados de forma estável vindos diretamente da seleção de medicamentos. 9 Observamos que a cinética temporal da diferenciação inicial in vitro de mESC para colônias semelhantes a mesoderma neste modelo pode ser variável entre clones individuais. As co-culturas mESC-OP9 podem ser avaliadas visualmente quanto à progressão para o mesoderma. Embora isso geralmente seja concluído no quinto dia de co-cultura, entre clones individuais, a conclusão pode ser adiada por um ou dois dias. A formação quantitativa (~ 80-90%) do mesoderma deve ser alcançada antes da transferência, a fim de obter a formação ideal de células progenitoras hematopoiéticas (HPC) e linfopoiese robusta. Assim, ao trabalhar com vários clones de mESC, essa passagem do "dia 5" é melhor adiada até que todos os clones completem a transição para colônias semelhantes ao mesoderma. Isso permite a sincronia do desenvolvimento subsequente entre os clones após sua transferência para condições de diferenciação hematopoiética. Três dias após a passagem das formações mesodérmicas de 80-90%, as HPCs são coletadas das monocamadas OP9. As HPCs podem ser semeadas em novas células OP9 para permitir a diferenciação de linhagens monocíticas, eritróides e de células B. Alternativamente, os HPCs podem ser semeados em células OP9-DL1 e direcionados para o desenvolvimento de células T. Todas as culturas de diferenciação in vitro são fornecidas Flt-3L a partir do dia 5, com adição adicional de IL-7 a partir do dia 8. As análises de citometria de fluxo realizadas em vários momentos durante o experimento permitem monitorar o progresso através dos estágios e linhagens de diferenciação hematopoiética e desenvolvimento de células T. As células T CD4/CD8 duplamente positivas (DP) começam a emergir no dia 16 da cocultura, e as células DP e CD8 únicas positivas (SP) são abundantes no dia 20. O resultado geral e a robustez da co-cultura dependem muito da capacidade de verificar visualmente a conclusão dos pontos de virada significativos do desenvolvimento que ocorrem. Este protocolo pretende ser um guia para o reconhecimento desses marcos, bem como dos outros parâmetros críticos, que são fundamentais para uma diferenciação bem-sucedida.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Qualificado para células-tronco FBS</td><td>Gemini</td><td>100-125</td> Penicilina/Estreptomicina <td>inativada por calor</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampão&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>TMS-003-C</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Solução Regent de Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (55 mM) em DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu; m Membrana PES</td></tr><tr><td>Grau de Cultura de Células Água</td><td>Corning</td><td>25-055-CM&</td><td></td></tr><tr><td>alpha;-MEM&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>12000-022</td><td>Pó, reconstituir por recomendação de fabricação</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>SH 30396.03</td><td>Teste de lotes individuais necessários&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfóxido de Dimetilo</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ligante Flt-3 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine IL-7</td><td>PeproTech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Utrapure água com 0,1% de gelatina</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEFs mitomicina C tratada</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>Qualquer MEFs mitoticamente preso pode ser usado</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (40 &mu; m)</td> <td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 100 x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Poliestireno de 5 ml com Tampa de Filtro</td><td>de Célula Tubos BD Falcon</td><td>352235</td><td>para FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>Células ES R1</td><td>Células</td><td></td> ATCC SCRC-1011 <td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>As células podem ser obtidas no Riken Laboratory Cell Repository (Japão).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células OP9-DL1</td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>As células podem ser solicitadas ao Z&uacute; &ntilde; iga-Pfl&uuml; Laboratório Cker.</td></tr><tr><td>Software FlowJo</td>Análises de dados <td>Tree Star</td><td></td><td>FACS</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td></td><td>FACScan, FACSCalibur e FACSVantage foram usados em nosso laboratório</td></tr></tbody></table>

derivação de células t in vitro de mouse células-tronco embrionárias

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

O sistema de co-cultura OP9/OP9-DL1 tornou-se um método bem estabelecido para derivar tipos diferenciados de células sanguíneas de progenitores embrionários e hematopoiéticos de origem humana e de camundongos. Agora é usado para abordar uma variedade crescente de questões genéticas, celulares e moleculares complexas relacionadas à hematopoiese e está na vanguarda dos esforços para traduzir essas descobertas básicas em aplicações terapêuticas. Os procedimentos são diretos e rotineiramente produzem resultados robustos. No entanto, alcançar uma diferenciação hematopoiética bem-sucedida in vitro requer atenção especial aos detalhes da manutenção do reagente e da cultura celular. Além disso, o protocolo apresenta etapas sensíveis à técnica que, embora não sejam difíceis, exigem cuidado e prática para dominar. Aqui nos concentramos nos procedimentos de diferenciação de linfócitos T de células-tronco embrionárias de camundongos (mESC). Fornecemos um protocolo detalhado com discussões sobre as etapas e parâmetros críticos que permitem a diferenciação celular reprodutivelmente robusta in vitro. É do interesse do campo considerar uma adoção mais ampla dessa tecnologia, pois ela tem o potencial de reduzir o uso de animais, diminuir o custo e encurtar os prazos da experimentação básica e translacional.

Quando cultivado em MEFs na presença de LIF, mESCs pode ser mantido num estado indiferenciado. Em condições ideais, eles aparecem como colônias compactas de células rodeadas por um halo brilhante em microscopia de contraste de fase (Figura 1). Estas culturas devem ser monitorizados diariamente. Dependendo da confluência das células, a mídia pode ser alterado ou células podem ser divididos. Vizinhas colônias Mesc não deve vir para o ponto de contato com o outro. Uma cultura normal, saudável de mESCs indi...

As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

O objetivo geral deste procedimento é impulsionar a diferenciação quantitativa de células T de células-tronco embrionárias de camundongos ou ESCs in vitro. Isso é feito primeiro semeando as ESCs em uma monocamada de células estromais OP nove. Após cinco a sete dias, as formações de colônias mesodérmicas são colhidas e recolocadas em uma nova monocamada de nove células OP.Três dias depois, as pequenas células progenitoras hematopoiéticas redondas ou HPCs são colhidas e transferidas para uma nova monocamada OP nove para a geração de células eritróides, monocíticas e B, ou para uma nova monocamada OP nove DL uma para gerar células T. Em última análise, este método pode ser usado como um modelo in vitro para estudar os eventos moleculares, genéticos e celulares que regulam a hematopoiese e o desenvolvimento de linfócitos T. Este procedimento foi desenvolvido no laboratório do Dr. Juan Carlos Sunga Fluker na Universidade de Toronto.Aprendemos a técnica com seu grupo para que pudéssemos aplicá-la à nossa pesquisa sobre regulação gênica durante o desenvolvimento de células T no Hunter College. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela permite a manipulação e

derivation-of-t-cells-in-vitro-from-mouse-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo demonstra um protocolo para gerar células T funcionais específicas do antígeno a partir de células T imaturas derivadas de iPSC usando um sistema de cultura tímica tridimensional. A co-cultura de células T imaturas derivadas de iPSC com lobos tímicos fetais de camundongos empobrecidos de linfócitos endógenos resultou em maturação bem-sucedida das células T para formar emigrantes tímicos derivados de iPSC CD8αβ + MHC classe I + iPSC.

Sistema de cultura tímica tridimensional para gerar emigrantes tímicos derivados de iPSC

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Este artigo descreve a metodologia in vivo e in vitro para caracterizar os progenitores de decantação tímica pela análise da cinética de geração, fenótipo e número de suas progênies de células T.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Este protocolo descreve a diferenciação de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas in vitro. Especificamente, quando combinado com uma abordagem baseada em citometria de fluxo multiparâmetro, 90% de pureza de células Th17 patogênicas podem ser obtidas de células T CD4 + virgens usando este método de diferenciação.

Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

Aprenda a diferenciação de células T a partir de células-tronco embrionárias de mouse usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. Este protocolo detalhado permite estudar eventos moleculares e celulares da hematopoiese.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

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