Alta resolução de Microscopia Eletrônica da Helicobacter pylori Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

O procedimento visualiza a hiperprodução do sistema de secreção CAG tipo quatro pii, que ocorre sob condições de limitação de ferro primeiro cultivo de h pylori sob condições de limitação de ferro. O segundo passo é co-cultivar h pylori com células epiteliais gástricas. Em seguida, processe as amostras de co-cultura para microscopia eletrônica de varredura.

Em última análise, a microscopia eletrônica de varredura de alta resolução é usada para mostrar o aumento da produção de pi eye do sistema de secreção CAG tipo quatro sob condições de limitação de ferro. A técnica neste manuscrito é importante para doenças relacionadas ao h pylori, como o câncer gástrico, porque o sistema de secreção CAG tipo quatro está associado ao aumento do risco de resultados negativos da doença. Assim, uma melhor compreensão da regulação desta importante superfície bacteriana.

Organela pode revelar novos alvos quimioterápicos E a vantagem da microscopia eletrônica de varredura de alta resolução em relação aos métodos existentes, como a microscopia fluorescente, é que a pílula de secreção tipo quatro individual I pode ser visualizada. Indivíduos novos neste método de microscopia eletrônica têm problemas com o procedimento, especificamente com a química úmida, pois requer um tempo cuidadoso e uma mão delicada no sangue. Placas de ágar crescem.

H Pylori PMs, S uma bactéria e seu mutante CAG e isogênico, que não possui um sistema de secreção tipo quatro em funcionamento. Inocular culturas e caldo Ella modificado suplementado com colesterol para crescer durante a noite. Em seguida, semeie células epiteliais gástricas humanas GS em lamínulas tratadas com polilisina em placas de 12 poços para condições variadas de disponibilidade de ferro.

Diluir o h pylori a uma densidade óptica 600 de 0,3 apenas em caldo bru modificado. Meios contendo 100 micromolares de cloreto de ferro, 200 micromolares da concha quelante de ferro sintético ou 200 micro de concha mais 200 micromolares de cultura de cloreto de ferro. As amostras por quatro horas agora centrifugam as bactérias a 1000 Gs e Resus suspende os pellets em um volume igual de caldo bru modificado fresco suplementado com colesterol.

Meça a densidade bacteriana. Em seguida, infecte as células epiteliais com o h pylori em uma multiplicidade de infecção de 20 para um. Realize diluições seriadas e coloque as células bacterianas em placas de ágar sangue.

Para avaliar a viabilidade celular bacteriana, coloque as coculturas na incubadora de cultura celular por quatro horas. Decantar o sobrenadante das coculturas h pylori I e GS . Lave suavemente as células aderentes três vezes com tampão de revestimento de sódio 0,05 molar.

Em seguida, fixe as amostras por duas a quatro horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave as amostras três vezes com tampão ca coate de sódio 0,05 molar. Para uma fixação secundária, adicione tetróxido de ósmio a 0,1% em tampão de cacoate de sódio 0,05 molar em duas etapas sequenciais de fixação de 10 minutos.

Em seguida, após três lavagens, desidrate as amostras com concentrações aumentadas de etanol. Coloque as amostras em uma máquina de secagem de ponto crítico e, em seguida, encha a câmara com dióxido de carbono líquido. O etanol é purgado da câmara e a câmara é preenchida novamente com dióxido de carbono líquido.

A amostra é então levada ao ponto crítico de 31,1 graus Celsius e 1073 PSI agora monte as lamínulas em pontas de amostra de SEM de alumínio e pinte uma linha fina de prata coloidal na borda da amostra para aterramento. Durante a imagem SEM, usando uma máquina de revestimento catódico, cubra as amostras com cinco nanômetros de paládio de ouro para aumentar o sinal de elétron secundário da amostra e o efeito de borda. Examine as amostras com uma imagem de microscópio eletrônico de varredura com pistola de emissão de campo em modo de alto vácuo a uma distância de trabalho de cinco a 10 milímetros.

Defina a tensão de aceleração para cinco quilovolts. Em seguida, defina o tamanho do ponto em dois a 2,5. Agora incline a amostra entre 15 a 25 graus para obter uma melhor visualização da interface do patógeno hospedeiro para visualização de alta ampliação.

Priorize a imagem de bactérias que aderem às bordas das células epiteliais para bactérias que aquecem a vida PI enriquecidas em interações patógeno hospedeiro. Abra os arquivos de micrografia no software de imagem J. Identifique pi li à medida que as estruturas se formam entre a célula bacteriana e a célula hospedeira com largura uniforme de 10 a 13 nanômetros e comprimento de 60 a 150 nanômetros.

Calibre a ferramenta de medição desenhando uma linha com a ferramenta de linha reta e clicando na guia analisar no menu suspenso. Selecione definir escala e insira o valor da barra de ampliação em distância conhecida e defina a unidade de comprimento para o nanômetro. Em seguida, clique em OK.

Agora use uma ferramenta de linha reta para desenhar sobre o comprimento ou largura dos pilotos e, em seguida, pressione control M para medir cada piloto e registrar os valores medidos em um programa de planilha. Use parâmetros de comprimento e largura previamente estabelecidos para desconsiderar recursos que não se encaixam no perfil do sistema de secreção CAG tipo quatro. Em seguida, quantifique o número de IP I com base em valores que estão dentro do intervalo analisado estatisticamente uma quantificação do PI LI usando um teste T de Student bicaudal.

Neste experimento, h pylori foram cultivados em condições de depleção de ferro usando o quelante sintético dip parital em concentrações que não inibem significativamente o crescimento. A bactéria produziu numerosas PII do sistema de secreção CAG tipo quatro quando co-cultivada com células gástricas humanas. Por outro lado, quando uma fonte exógena de ferro nutriente está presente, a formação de PII do sistema de secreção CAG tipo quatro é reprimida.

A quantificação do PII na interface do patógeno hospedeiro revela que, em condições de restrição de ferro, h pylori exibe um aumento de duas vezes no olho PI do sistema de secreção CAG tipo quatro, a porcentagem de células pileadas aumenta em 11% em comparação com as células cultivadas apenas em meio. Curiosamente, embora a atividade do sistema de secreção CAG tipo quatro, medida pela secreção IL oito do hospedeiro, seja aumentada sob condições de restrição de ferro e reprimida sob condições de excesso de disponibilidade de ferro, as dimensões do PI LI permanecem consistentes entre todas as condições de disponibilidade de ferro. Consistente com o envolvimento do sistema de secreção CAG tipo quatro, a disponibilidade de ferro não altera a biogênese de PI LI na superfície de um mutante CAG e após seu desenvolvimento.

Essa técnica de MEV abriu caminho para pesquisadores no campo do sistema de secreção CAG tipo quatro explorarem a localização de proteínas. Com relação às almofadas do sistema de secreção CAG tipo quatro. Recentemente, descobriu-se que a proteína efetora CAG a localiza-se na ponta da pílula de secreção tipo quatro.