Name: Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprenda uma técnica otimizada de cultura ex ovo para embriões de galinha, permitindo observação do desenvolvimento embrionário do estágio Hamburger-Hamilton 19 até o estágio 40. Este método é ideal para laboratórios de biologia do desenvolvimento e pesquisa científica.

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Gostaríamos de agradecer a Paul Poirier, o produtor de mídia, em Mount Saint Vincent University por seu trabalho em filmagem e edição de uma parte do vídeo deste manuscrito. Reconhecemos a Ciência Natural e do Conselho de Pesquisa em Engenharia do Canadá para financiamento.

Nota: Todas as fontes estão listadas na Tabela 1. 1. Armazenar o frango Embriões <ol><li> Incubar ovos de galinha da estirpe Gallus gallus horizontalmente a 37 o C, com aproximadamente 40% de umidade e virar ovos uma vez ou duas vezes por dia. Voltando ovos é importante para evitar o embrião de aderir a casca do ovo. </li><li> Não para não transformar o ovo no 24 horas antes da criação da cultura de outra forma o embrião será localizado ventral à massa de gema e será danificado ao abrir o ovo no passo 3. Além disso, manter os ovos a 4 o C graus para não mais do que uma semana antes de incubação para o desenvolvimento &quot;parada&quot;, mas isso não é o ideal. </li></ol> 2. Encenação de frango Embriões <ol><li> Fase, os embriões de galinha usando o Hamburger e Hamilton 12 de tabela de representação. O palco ideal para a criação da cultura ex-ovo é HH fase 19-20 (cerca de 3 dias de incubação) because este é logo após a cabeça gira em 53 hpf. Nota: 19-20 HH fase caracteriza-se pelas seguintes características morfológicas: somitos são estendidas para a maioria da cauda, ​​no entanto, a própria extremidade da cauda permanece não segmentada, o botão de cauda está enrolado, o alantóide é pequena e tem vasculatura limitado, as pernas-botões são maiores do que os de asa-botões e os olhos são unpigmented ou têm uma tonalidade acinzentada. </li></ol> 3. Retirar o embrião da Shell <ol><li> Antes de retirar o embrião a partir do shell, pulverizar o shell com etanol 70% e deixe-a secar. Não vire o ovo rapidamente pois isso irá danificar o embrião. </li><li> Tomando cuidado para não alterar a orientação do ovo, cuidadosamente quebrar o ovo no lado inferior (ou seja, o lado que foi ventral durante a incubação) e libertar o embrião para um barco de pesagem estéril (88 x 88 x 23 mm). Limpe pesar barcos com etanol 70%. Inspeccionar o embrião para assegurar que o saco vitelino não está danificado. Se a gema hcomo quebrado, descartar o embrião, como ele não vai sobreviver. </li><li> Observar o embrião para garantir que ele é viável; o coração está batendo, vasculatura parece normal, e não há anormalidades óbvias estão presentes. Certifique-se de que as bordas do barco pesar são secos. </li><li> Usando uma pipeta, gota 40 mL de penicilina / estreptomicina (5000 unidades de penicilina, estreptomicina a 5 mg por ml) na parte superior da albumina para ajudar a prevenir a infecção. </li></ol> 4. Preparar a câmara de umidade <ol><li> Colocar uma pequena pilha de KIM-toalhetes e / ou uma almofada absorvente feita de algodão, no fundo de um recipiente de plástico estéril (12 x 12 x 6 cm) limpa com etanol a 70%. </li><li> Adicione água destilada estéril para umedecer os KIM-toalhetes e / ou algodão (aproximadamente 150 ml de água). </li></ol> 5. Montagem do Ex Cultura Ovo <ol><li> Inserir o barco pesar contendo o embrião no topo da pe de enchimento húmido. Em seguida, coloque a metade de um estéril petri-prato quadrado (9.5 x 9.5 cm) na parte superior do tele pesam barco para formar uma tampa solta. </li><li> Cobrir o recipiente de plástico com a sua tampa. Pressione para baixo dois cantos da tampa, garantindo uma vedação parcial que ainda permite uma boa circulação de ar no interior da câmara. </li><li> Com cuidado, coloque a configuração para o 37 o C incubadora até estágio desejado. </li><li> Coloque recipientes de água na incubadora para ajudar a controlar a humidade, se uma incubadora com humidade controlada não está disponível. Esteriliza-se toda a água nas câmaras de humidade e na incubadora e encher como for necessário durante o período de incubação. 40% de umidade é ideal. </li></ol>

<ol><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
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<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morph%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morph. 88, 49-92 (1951).</li>
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<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Franz-Odendaal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+chicken%2C+Gallus+gallus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus.</a> Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros competitivos em relação às informações apresentadas neste manuscrito.

Ex ovo cultura e de janelas ambos têm vantagens e desafios. Aqui vamos comparar as vantagens e os desafios do isopor cup ex ovo método eo método de janelas para o nosso ex otimizado ovo método mostrado aqui. Nosso método permite a manipulação e fácil observação do embrião de galinha em estágios finais de desenvolvimento e os nossos aperfeiçoamentos da ex tradicional ovo método 1, 2, 3 torná-lo também muito fácil de usar em aulas de graduação de laboratório...

A cultura ex ovo tem desempenhado um papel importante no estudo do desenvolvimento do frango1, 2. Esse método de cultura tem sido usado para estudar doenças neurológicas, desenvolvimento de membros, desenvolvimento craniofacial e como modelo para investigar malformações associadas ao diabetes 3, 4, 5.
Existem muitas variações na técnica ex ovo. A abordagem mais comum é usar um copo de isopor6,7,8 ou uma tigela de vidro5. Nesses métodos, o copo ou tigela é forrado com filme plástico para embalar o embrião, uma tampa é colocada no copo e o embrião é então colocado em uma incubadora com umidade adequada6. Essa configuração, no entanto, pode ser tecnicamente desafiadora. O primeiro desafio é o filme plástico que é usado para embalar o embrião. Este envoltório é difícil de trabalhar e muitas vezes não adere muito bem ao copo. Para resolver esse problema, um elástico é colocado ao redor do copo para manter o envoltório no lugar. Apesar disso, o envoltório ainda pode escorregar, o que é fatal para o embrião. O filme plástico tem o potencial de rasgar ou ser perfurado por pinças ou agulhas que podem ser usadas durante manipulações e observações de embriões. Finalmente, essa configuração não é muito estável e os alunos podem facilmente derrubar os copos. A altura das xícaras também torna muito difícil colocar o embrião sob um estereomicroscópio, que tem um objetivo limitado à altura do palco. Esses desafios tornam difícil para os alunos de graduação trabalhar com embriões vivos de pintinhos em laboratórios de ensino, como cursos avançados de biologia do desenvolvimento. 
Os desafios acima no método ex ovo significaram que os pesquisadores recorrem ao método de janela 9,10 para visualizar o desenvolvimento embrionário de pintinhos. Nesta técnica, um orifício ou "janela" é feito na casca do ovo que cobre o embrião. O orifício pode ser selado novamente com fita adesiva ou cera9 para permitir um maior desenvolvimento embrionário. Embora o método de janela tenha algumas vantagens, como a capacidade de visualizar o desenvolvimento embrionário e fácil manutenção, esse método também tem várias limitações. A primeira é que a janela precisa ser bastante grande para visualizar todo o embrião (especialmente nos estágios finais). Em segundo lugar, grandes janelas são difíceis de selar; Uma vedação inadequada levará a problemas de esterilidade e sobrevivência. Usar cera derretida como selante adiciona outra etapa inconveniente e confusa ao protocolo. Portanto, embora o método de janela possa ser ideal para embriões de pintinhos em estágios jovens (HH 11 – HH 27), a visualização de todo o embrião em estágios tardios não é facilmente realizada. 
Aqui, descrevemos uma técnica de cultura ex ovo simples e aprimorada11 que evita a necessidade de equipamentos de alta tecnologia, é fácil de manusear sob um estereomicroscópio, dá ao embrião suporte suficiente para realizar manipulações microscópicas e permite que os pesquisadores visualizem o crescimento do embrião em sua totalidade até os estágios posteriores de desenvolvimento (até HH 40-41). Com esses avanços na técnica ex ovo, os indivíduos obtêm acesso a uma compreensão mais completa do desenvolvimento embrionário. Por exemplo, o crescimento em estágios posteriores permite que os indivíduos observem processos de desenvolvimento que não ocorrem até esse momento, como ossificação, desenvolvimento de penas e desenvolvimento avançado de membros e olhos. Todo o embrião e as membranas e vasculatura extraembrionárias são claramente visíveis. Pesquisas mais avançadas também podem ser realizadas, como manipulações embrionárias (ou seja, implante de esferas embebidas em inibidores ou inserção de barreiras entre as camadas de tecido), e os pesquisadores podem observar o efeito das manipulações em embriões em estágio posterior.

<table><tbody><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>Faça pequenas alíquotas para evitar eventos de congelamento/descongelamento</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td><td>de Petri quadrada</td><td>9,5 cm x 9,5 cm</td></tr><tr><td>Pesar Barco</td><td>Fischer Scientific</td><td>8732113</td><td>88 x 88 x 23 mm</td></tr><tr><td>Recipiente Ziplock</td><td>Ziplock</td><td>N/A</td><td>12 cm x 12 cm x 6 cm</td></tr></tbody></table>

otimizado ex-ovo a cultura de chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

A pesquisa em anatomia, embriologia e biologia do desenvolvimento tem se baseado amplamente no uso de organismos modelo. Para estudar o desenvolvimento em embriões vivos, organismos modelo, como a galinha, são frequentemente usados. A galinha é um excelente organismo modelo devido ao seu baixo custo e manutenção mínima, porém apresenta desafios observacionais por estar encerrada em uma casca de ovo opaca. Para visualizar adequadamente o embrião à medida que ele se desenvolve, a casca deve ser janela ou removida. Ambas as técnicas de janela e ex ovo foram desenvolvidas para auxiliar os pesquisadores no estudo do desenvolvimento embrionário. No entanto, cada um dos métodos tem limitações e desafios. Aqui, apresentamos uma técnica simples e otimizada de cultura ex ovo para embriões de galinha que permite a observação do desenvolvimento embrionário desde o estágio HH 19 até os estágios finais de desenvolvimento (HH 40), quando muitos órgãos se desenvolveram. Essa técnica é fácil de adotar tanto em aulas de graduação quanto em laboratórios de pesquisa mais avançados, onde são realizadas manipulações de embriões.

Este ex ovo método permite a observação de embriões a partir de estágios iniciais de desenvolvimento (HH 19/20) para estágios finais de desenvolvimento (HH 40-41) (Figura 1A e 1B). Configurando a cultura no HH 19-20 aumenta a capacidade de sobrevivência dos embriões na cultura. Antes do giro (antes de 53 hpf) a capacidade de sobrevivência é muito baixa em cultura e após a etapa 21, o embrião tende a ficar mais para o shell sobre a remoção de modo são obtidas menos embriões inta...

Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).

Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

O objetivo geral deste método é apresentar uma técnica otimizada de cultura X ovo para embriões de galinha, que permite a observação do desenvolvimento embrionário desde o estágio 19 de hambúrguer e Hamilton até os estágios finais de desenvolvimento até o estágio 40. Este método é útil para estudantes em um ambiente de laboratório de biologia do desenvolvimento, bem como pesquisadores que desejam usar o embrião de galinha como organismo modelo para configurar este método de cultura X ovo. Primeiro, os ovos são preparados.Os ovos foram incubados a 37 graus Celsius com 40% de umidade por aproximadamente três dias e meio, o que se correlaciona aproximadamente com o hambúrguer e o estágio 19 de Hamilton. Os ovos são preparados pulverizando-os com etanol 70% para que, quando a casca for rachada, o embrião não seja contaminado. Depois que os ovos são pulverizados, eles são deixados momentaneamente para secar.Enquanto a câmara de umidade é preparada, a câmara de umidade é feita de um recipiente Ziploc. O primeiro passo na construção da câmara de umidade é adicionar uma camada de um a dois centímetros de enchimento absorvente. Nesse caso, o lenço Kim, embora camadas de acolchoamento de algodão também possam ser usadas.Esta camada de acolchoamento absorvente se encaixa na base do recipiente Ziploc mostrado aqui. Uma vez que a camada absorvente está no lugar, aproximadamente 150 mililitros de água destilada são despejados na base do recipiente. A maior parte dessa água deve ser absorvida pelo Padding.A câmara de umidade agora está completa e pode ser colocada de lado. Um barco pequeno e estéril é usado para embalar o embrião quando ele é removido da casca. O caminho barco mede 8,8 centímetros quadrados devido à orientação dos ovos na incubadora, o embrião está localizado na superfície superior do ovo e, portanto, a casca deve ser rachada no lado oposto.A casca é então quebrada suavemente e o ovo é colocado muito perto do barco de passagem. Em um movimento suave, o ovo é separado, liberando o embrião suavemente no caminho Barco. O embrião é então inspecionado para garantir que o jugo ainda esteja intacto e que o embrião seja viável, como mostrado aqui com batimentos cardíacos visíveis e sem anormalidades óbvias.Em seguida, adicionamos um antibiótico ao embrião para ajudar a combater a infecção. A estreptomicina de penicilina a uma concentração de 5.000 unidades de penicilina e cinco miligramas de estreptomicina por mil é alocada para minimizar a frequência de congelamento e descongelamento. Eventos. 40 microlitros são retirados da alíquota e adicionados à albumina circundante usando uma pipeta.Agora o embrião está pronto para ser cuidadosamente colocado na câmara de umidade. Uma vez na câmara de umidade, o embrião recebe uma tampa para ajudar a prevenir a contaminação. Uma tampa quadrada de placa de Petri medindo nove centímetros e meio quadrados é colocada sobre o barco de caminho.É importante garantir que não haja umidade na borda do barco de referência para que não se forme uma vedação entre a placa de Petri e o barco de passagem, o que restringiria o oxigênio ao embrião. Em seguida, para completar a câmara de umidade, uma tampa é colocada no recipiente Ziploc. No entanto, apenas dois cantos da tampa são pressionados no lugar, deixando os outros cantos abertos e permitindo que o fluxo de ar alcance o embrião.Uma vez concluída a câmara de umidade, ela é colocada em uma incubadora de 37 graus para que o embrião possa continuar se desenvolvendo após quatro dias e meio. A câmara de umidade pode ser removida da incubadora e o embrião pode ser observado aproximadamente no estágio 34. Neste ponto, os alunos podem observar facilmente o embrião, incluindo a vasculatura, o olho grande e os botões dos membros.O embrião pode ser observado posteriormente sob um microscópio de dissecação, e pesquisas mais avançadas podem ser realizadas, como manipulações embrionárias. Depois de observar o embrião nesta fase, ele pode ser devolvido a uma incubadora de 37 graus e continuaria a se desenvolver até pelo menos o estágio 40, que é de 14 dias de incubação. Em conclusão, este método mostra a otimização do cultivo de embriões de pintinhos fora da casca do ovo.Ele oferece uma oportunidade para os alunos observarem o desenvolvimento de embriões de galinha em um ambiente de laboratório movimentado e, além disso, fornece aos pesquisadores acesso a embriões se estiverem fazendo manipulações.

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Este protocolo descreve três métodos sobre como obter e usar embriões de frango de 5 a 8 dias de idade e sua membrana corioalantóica (CAM) como um modelo in vivo para estudar imagens de ultrassom com contraste e entrega de drogas mediadas por microbolhas.

A preparação de embriões de frango ex ovo e vasos de membrana corioalantóica como modelo in vivo para imagens de ultrassom com contraste e estudos de liberação de drogas mediados por microbolhas

Uma plataforma aprimorada para a cultura de embriões integrais permite o desenvolvimento contínuo e robusto do ex útero de embriões de camundongos pós-implantação por até seis dias, desde estágios de pré-estresculação até organogênese avançada. Neste protocolo, detalhamos o procedimento padrão para a cultura de embriões bem sucedida usando placas estáticas e sistemas de garrafas rotativas.

Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

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