Name: Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a avaliar dinâmica de leucócitos ex vivo usando câmara de microfluxo conectada à circulação do camundongo. Este método permite visualização em tempo real de interações leucócito-endotélio sob condições fisiológicas de fluxo.

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Research informou nesta publicação foi apoiada pelo National Eye Institute dos Institutos Nacionais de Saúde, com os números de premiação: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) e P30EY014104. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Apoio adicional foi fornecida pelo Fundo Massachusetts Lions Eye Research (KMC) e um Prêmio Especial Acadêmico de Pesquisa para prevenir a cegueira (para KMC).

Todos os experimentos em animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research, e as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitê Animal Care. O dia antes da experiência: 1. Preparação de tubulação para o fluxo Câmara <ol><li> Para preparar o lado jugular, conecte um centímetro PE10 tubo de polietileno de tubo de silicone 6 centímetros seguido por tubos de polietileno de 5 cm. Para o lado da carótida, preparar de modo semelhante ao lado jugular com a adição de um tubo em T dentro do tubo de silicone 6 centímetros a cerca de 1,5 cm de distância do tubo de polietileno com 1 cm (Figura 1A, B). A fim de inserir o tubo T, alargar o tubo de silicone utilizando uma pinça fina, se necessário. </li><li> Ligue uma extremidade de 10 cm de tubo de silicone para o transdutor de pressão, em seguida, insira a extremidade T da carótida side tubo T para a outra extremidade. Assegurar a ligação sites são apertados e sem vazamento. Aplicar um pequeno pedaço rectangular de parafilme sobre o local onde o tubo se encaixa, se necessário, para evitar fugas (Figura 1C). </li></ol> 2. Revestimento da Câmara <ol><li> Preparar a proteína de revestimento de superfície endotelial (por exemplo, selectina P, molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), proteína vascular-1 de adesão celular (VCAM-1)) em 0,1% de BSA. A título de orientação, 1 ug de proteína em 200 ul de BSA é suficiente para revestir 4-5 câmaras. Usando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25, cada câmara de infusão (0,04 x 0,4 x 50 mm) com a proteína de revestimento de superfície endotelial. Armazenar as câmaras revestidos em um tubo de 15 ml a 4 ° C durante a noite. </li></ol> O dia do experimento: 3. Preparar a Câmara <ol><li> Retirar as câmaras revestidos de 4 ° C e ligar a tubagem jugular e carótida de cada lado. Sele as connections com cuidado esticar um pequeno pedaço rectangular de parafilm sobre onde a tubulação encontra a câmara. Usando uma seringa, encher a câmara e tubos com 0,1% de BSA (verificação de fugas). Incubar durante 45 min. </li><li> Prepara-se uma placa de Petri 35 milímetros para manter a câmara de corte por ranhuras de cada lado do prato. Estabilize a câmara nos entalhes; em seguida, usar uma pequena gota de silicone para fixar a câmara para o prato no local dentada. Certifique-se que a câmara está nivelada por olhar sob o microscópio. Permitir que o silicone para secar durante pelo menos 15 min. </li><li> Encha uma seringa de 60 ml de bloqueio com heparina e conecte-se o transdutor de pressão. Ligue o transdutor de pressão para a tubagem carótida na seguinte ordem: Transdutor, tubagem de silicone, e T-tubo. <ol><li> Use de 1 cm PE50 entre o tubo de silicone ligado ao transdutor e o tubo T, para fixar a ligação. Passar a tubagem de silicone da artéria carótida por meio do grampo de pressão (Figura 1D). Execute 100USP heparina through o tubo eo compartimento até que não haja bolhas de ar. </li></ol></li></ol> 4. Instalação do Software <ol><li> Para preparar o software, ligue o computador, microscópio, e um dispositivo de laboratório aberto. Clique duas vezes sobre o conjunto de aplicativos Leica (LAS) (ou equivalente) e preparar uma pasta para guardar o vídeo: navegar → adquirir → filme → definir seqüência de clips (clips = 15, o tempo de gravação = 30 segundos, e intervalos = 15 sec) em seguida, clique no sinal de &quot;+&quot; para confirmar. </li><li> Para gravar a pressão de fluxo abrir o LabChart (ou equivalente) do arquivo e coordenar o nome do arquivo para a pasta de gravação na etapa 4.1, acima. </li></ol> 5. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Anestesiar um rato de 8-10 semanas de idade, utilizando uma combinação de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (6 mg / kg), injectada intraperitonealmente (IP). Confirme se a sedação profunda é alcançada dentro de 5-10 min por perda do reflexo interdigital. Se necessário, o isofluranopor máscara pode ser dado como necessário. </li><li> Enquanto sob anestesia, coloque uma almofada de aquecimento por baixo da gaiola e configurada para 37 ° C para manter a temperatura corporal. Uma vez que a anestesia adequada é confirmada, coloque o mouse em uma posição ventral e revestir os olhos com bacitracina pomada para evitar a secura ocular. </li><li> Em seguida, raspar o cabelo no local da incisão usando uma lâmina de barbear e limpe o local com álcool. </li><li> Depois de completamente anestesiado prender o animal com fita mantendo o mouse em uma posição ventral. Expor a área do pescoço com uma tesoura e remover a glândula tireóide para expor a traqueia e os vasos (Figura 2A). </li><li> Limpe a artéria carótida até que esteja totalmente exposto tomando cuidado para não danificar o nervo vago (Figura 2B). Dobre um pedaço de fio de sutura e passar a curva debaixo da artéria carótida em seguida, corte na curva de forma que há agora dois pedaços de sutura debaixo da carótida. Loop cada sutura em nós (não aperte oknots). </li><li> Repetir o mesmo procedimento para expor a veia jugular esquerda (Figura 2C), preparando-se as suturas da mesma maneira (Figura 2D). </li><li> Conecte o tubo para a vasculatura mouse. <ol><li> Heparinizar o mouse através da injeção de 1 ml de IP heparina. </li><li> Apertar a sutura superior na artéria carótida. Coloque o grampo do navio tão baixo quanto ele pode ir na artéria carótida (Figura 3A). Use pinça para segurar o fio de sutura pela artéria superior e fazer uma pequena incisão, cerca de 1/8 da circunferência da artéria, utilizando a microtesoura (Figura 3B). </li><li> Passar a tubagem artéria carótida através do segundo nó da sutura superior e para dentro da incisão feita na artéria. Amarrar a sutura inferior de modo a que a artéria é fechada hermeticamente em torno do tubo (vários nós devem ser tomadas medidas para garantir uma vedação estanque; Figura 3C). </li><li> Repetir o mesmo procedimento para a inserção do tubo de veia jugular (o vasobraçadeira não é necessária para o lado jugular; Figura 3D). </li><li> Teste o fluxo liberando a braçadeira navio. Se não há vazamentos mover o mouse para o microscópio e se conectar a tubulação carótida ea veia jugular à tubulação câmara (veja o vídeo em anexo para demonstração do procedimento cirúrgico). </li></ol></li></ol> 6. Gravação de rolamento Velocity <ol><li> Abrir o grampo carótida para encher a câmara, fazendo com que um circuito com o sistema circulatório do rato. Permitir que o sangue circule para 3-5 min, de modo que as condições de fluxo estabilizar. Durante o período de espera de 3-5 minutos, ajustar a fase de microscópio de modo que a câmara é nível de uma extremidade para a outra com o objectivo de microscópio e o seu bordo é paralela com a janela de gravação de vídeo na tela. </li><li> Encher o prato de Petri contendo modificado da câmara de vidro com água, em seguida, baixar a objectiva de imersão em água 10X para o prato de modo a que as células fluem através da câmara são visíveis.A intensidade de luz pode ter que ser ajustada para uma visualização adequada das células. Geralmente uma intensidade menor é melhor. </li><li> Ajustar o grampo no tubo de modo que o transdutor lê uma constante 30 mm Hg correlacionando a uma pressão média de fluxo fisiológico, ou como desejado. </li><li> Pressione &quot;iniciar&quot; para iniciar a gravação, tanto o vídeo e a pressão com o primeiro lapso de tempo perto do final jugular e move contra o fluxo para a extremidade carótida até concluída. NOTA: Várias condições de revestimento utilizando diferentes moléculas de adesão pode ser estudado no mesmo rato usando várias câmaras. Apenas uma câmara é registada em cada vez. <ol><li> Quando a gravação terminar, fechar a válvula no local de entrada, interrompendo o fluxo de sangue. Remover a câmara e encaixar uma nova câmara (revestido com uma molécula de adesão diferente) para o circuito utilizando uma pinça fina em um lado, e uma pinça com ranhuras na outra mão. Retomar a gravação para a nova câmara, conforme descrito nas etapas6,1-6,4. </li></ol></li><li> Eutanásia todos os ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por um deslocamento da medula espinal, no final da experiência. O procedimento é terminal, por conseguinte, os ratinhos são sacrificados por luxação da medula espinal, no final da experiência. </li></ol> 7. Interpretação dos Resultados <ol><li> Para a análise dos dados gravados usar o plugin &quot;M TrackJ&quot; para software ImageJ 23. </li><li> Converta o arquivo em tons de cinza Selecione o arquivo de importação → → → AVI converter em tons de cinza. </li><li> Padronizar os quadros Select → imagem → propriedade → por introduzir os intervalos de quadro (i) → global. Calcular os intervalos de quadro dividindo a duração total video (normalmente 30 segundos) ao número de quadros num vídeo (mostrado no canto superior da janela de vídeo J Imagem). </li><li> Medir o fluxo de cada leucócitos por Select plug-in → M TrackJ → Adicionar faixas → selecionar um dos leucócitos→ Acompanhe-o com cada quadro de 15-20 seg → Mesclar. </li><li> Repita o passo 7.4 para todos os leucócitos em vista. </li><li> Determine a velocidade média de rolamento dos leucócitos da Select medida → duas colunas aparecem → copiar todos os M TrakJ: Trilhas em uma planilha. A coluna denominada &quot;V dizer&quot; é o rolamento de leucócitos medido em pixels / segundo. Converter em um / sec dividindo por 2/3. </li><li> Para analisar o destaque de dados de pressão e de exportação em uma planilha e executar o seguinte cálculo: AP (mm Hg) e t (dina / cm 2) para uma comparação entre cada grupo experimental. Uma vez calculada, copiar os dados para software prisma para a representação gráfica. </li></ol>

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Os autores (L.M., H.S. e K.M.C.) não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

O processo de recrutamento de leucócitos é um passo crucial na resposta inflamatória; que envolve a migração de leucócitos a partir do sistema circulatório em direcção tecidos alvo, onde eles são capazes de exercer a sua função efectora. O recrutamento de leucócitos é parte integrante de uma variedade de condições inflamatórias, tais como placas de aterosclerose, enfarte do miocárdio, isquemia / reperfusão, e cirurgia de transplante de 1, bem como várias condições neuro-inflamatórias relacionadas com o SNC 10-12,20,24,25. Considerando a diversidade das condições de doença que vãos de recrutamento de leucócitos, a câmara de microfluxo autoperfused fornece uma ferramenta indispensável que o examinador a capacidade para estudar a dinâmica de migração de leucócitos. Ao longo das últimas décadas, uma variedade de ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar a dinâmica de adesão celular de leucócitos 26. Infelizmente, todos estes ensaios requerem a extracção deos leucócitos a partir do sangue, a introdução de activação mecânica. Para se aproximar mais o ambiente in vivo, foram feitas adaptações para coletar amostras de sangue total e controlar as condições de escoamento hemodinâmica 16,17. Aqui, vamos estender os avanços anteriores no domínio ligando uma câmara revestida para o sistema circulatório do mouse. Nós somos capazes de regular o fluxo de sangue para uma gama fisiológica e estudar a dinâmica de rolamento dos leucócitos. A câmara revestida nos dá a capacidade de estudar as interações leucócito com moléculas de adesão específicos. Uma vez que o sistema está a funcionar como uma unidade operada por um rato vivo, que imita mais de perto o ambiente natural, o que nos permite estudar as interacções leucócito-endotélio em uma variedade de modelos de ratinho imunológicas. Além disso, este sistema permite-nos tirar proveito dos múltiplos modelos genéticos do rato disponíveis. Embora o sistema não replicar completamente o ambiente in vivo, que proporciona uma plataforma para estudar específic elementos dos leucócitos em condições fisiológicas, um feito que não tenha sido possível. Mesmo que isso nos leva um passo mais perto de um ambiente mais fisiológico existem limitações para o sistema. Não replicar completamente a matriz 3D complexo da vasculatura para que só são capazes de avaliar certos elementos de interação leucócito que são restritos ao revestimento de câmara. Além disso, deve-se tomar muito cuidado para garantir um sistema fechado para a circulação do mouse, seguindo todas as etapas mencionadas no protocolo. A introdução de bolhas de ar irá afectar significativamente a precisão e reprodutibilidade dos experimentos. Enquanto nós descrevemos o uso da câmara de Autoperfused Microflow para avaliação da dinâmica de rolamento de leucócitos o procedimento tem o potencial para ser personalizado por investigadores para o estudo de uma variedade de doenças. Por exemplo, metástase das células cancerosas por expressar muitas das integrinas comuns partilhadas pelos leucócitos. Studying sua dinâmica de rolamento em um cenário que imita mais de perto um ambiente in vivo poderia ajudar em nosso conhecimento, e, possivelmente, a previsão, a natureza invasiva de certas células cancerígenas. Uma abordagem possível seria combinar uma técnica de marcação para as células cancerosas, tais como GFP 27, juntamente com o ensaio de câmara de fluxo para acompanhar a dinâmica de rolamento das células cancerosas que expressam GFP. Dada a flexibilidade de revestimento da câmara com uma variedade de substâncias e conectar várias câmaras ao mesmo mouse, será interessante ver como este processo é modificado para uso em outros laboratórios em combinação com camundongos geneticamente modificados e modelos de doenças. A técnica aqui descrita apenas toca em um potencial de aplicação muito mais ampla que é limitado apenas pela criatividade do investigador.

A inflamação é uma resposta universal do corpo a lesões e é um passo crucial para tanto a função do sistema imune inata e adaptativa. Em resposta à lesão e / ou estímulos inflamatórios, células endoteliais upregulate moléculas de adesão específicos; isto leva a extravasão de leucócitos através do endotélio microvascular, principalmente nas vénulas pós-capilares. Este processo inicia-se com tethering dos leucócitos de fluxo livre na corrente sanguínea no endotélio. Laminagem estável e adesão firme dos leucócitos, que por sua vez leva a transmigração e a secreção de agentes citotóxicos, seguir esta amarrar 1,2. As selectinas são conhecidos para mediar os primeiros passos da cascata de 3-5; integrinas são responsáveis ​​pelas etapas posteriores da adesão firme e transmigração 1,6-8. Um crescente corpo de evidências sugere leucócitos e moléculas de adesão endoteliais têm um papel vital em modelos animais de lesão de isquemia e reperfusão, Asma, psoríase, esclerose múltipla, e degeneração macular relacionada com a idade 9-12. Sob estas condições, a resposta inflamatória é ineficaz para atacar o próprio corpo, resultando na destruição de tecido saudável. Existentes agentes anti-inflamatórios (tais como drogas não esteróides anti-inflamatórios, corticosteróides, ou outros agentes quimioterapêuticos), carregam o risco de efeitos secundários graves, com o uso a longo prazo 13. Portanto, é de grande interesse para ter as ferramentas adequadas com a capacidade de identificar moléculas específicas de doenças, que podem, em última análise, ser orientada para ter o efeito anti-inflamatório desejado mantendo-se não tóxica 14. Existente em métodos in vitro tais como o ensaio de adesão de leucócitos estática foram usadas o mais cedo como 1976 15. A câmara de fluxo paralelo foi utilizado pela primeira vez em 1987 in vitro para estudar as interacções leucócito-endotélio sob as condições de fluxo. Nestas experiências, estimulada human leucócitos polimorfonucleares (PMN) a partir de sangue venoso foram perfundidos através de uma monocamada de células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Para controlar as condições de fluxo hemodinâmico, a bomba de seringa Harvard Apparatus foi empregado 16. Alternativamente, para evitar o isolamento de leucócitos artificial, sangue total foi utilizado em combinação com a câmara de vidro revestido com moléculas de adesão 17 imobilizadas. Para evitar a estimulação dos leucócitos e estudar mecanicamente sua interação com as moléculas de adesão em condições fisiológicas aproximados, uma ex vivo autoperfused, extracorporal, circuito arteriovenosa foi desenvolvido 16. Neste circuito, o sangue flui entre a artéria carótida comum direita e a veia jugular externa esquerda de um rato sob anestesia vivo, que permita a interacção dos LSP nativos dentro de uma câmara de microfluxo vidro revestido com moléculas individuais ou co-adesão imobilizada. Uma grande vantagem do presente systeo símbolo m representa a capacidade de empregar os ratos geneticamente modificadas, em que as vias inflamatórias estão directa ou indirectamente manipulados. Além disso, existe a capacidade de identificar a contribuição isolado de moléculas de adesão de leucócitos à inflamação, livre de activação externa, em condições de escoamento. A aplicação de um regulador de fluxo no ponto de entrada da câmara de fluxo proporciona uma vasta gama de variações experimentais de forças de cisalhamento ou a mimetizam sistemas 18-22 venosas ou arteriais. Aqui nós descrevemos em grande detalhe um protocolo relativamente à preparação e execução do vivo autoperfused ensaio de câmara ex microflow.

<table><tbody><tr><td>Micro câmara de vidro 0,4 x 0,04 x 50 mm</td><td>VitroCom</td><td>2540-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE 60</td><td>Fisher Scientific</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone 002</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Y</td><td>Value Plastics</td><td>Y210-6</td><td></td></tr><tr><td>T Plástico</td><td>de valor do</td> tubo <td>T410-6</td><td></td></tr><tr><td>Loja de ferragens de gel de silicone</td><td>- Home Depo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placa de Petri</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Embalagem Plástica</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de tubo</td><td>FST</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de grampo</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira vascular</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suturas de seda</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-1215-6/0</td><td></td></tr><tr><td>25 x 1 G agulhas</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 x 1/2 G agulhas</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Heparina 100 unidades USP/ml</td><td>Farmácia</td><td></td><td></td> hospitalar</tr></tbody></table>

avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um ex vivo autoperfused microflow câmara assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Interação leucócito-endotélio são eventos precoces e críticos na inflamação aguda e crônica e pode, quando desregulada, mediar lesão tecidual levando a danos patológica permanente. Ensaios convencionais existentes permitem a análise de moléculas de adesão de leucócitos apenas após a extracção de leucócitos a partir do sangue. Isto exige que o sangue passa por várias etapas antes de leucócitos do sangue periférico (PBL) pode estar pronto para a análise, que por sua vez pode estimular PBL que influenciam os resultados da investigação. O ensaio de câmara de fluxo de micro autoperfused, no entanto, permite aos cientistas estudar primeiros leucócitos desregulação funcional usando o fluxo sistêmico de um rato vivo, tendo a liberdade de manipular uma câmara revestida. Por meio de um modelo de doença, a expressão funcional de moléculas de adesão de leucócitos pode ser avaliada e quantificada num micro-câmara de vidro revestido com moléculas de adesão endotelial imobilizadas ex vivo. Neste modelo, o sangue fluientre a artéria carótida comum direita e veia jugular externa esquerda de um rato vivo, sob anestesia, permitindo a interação de PBL nativas na câmara. Análise experimental em tempo real é conseguido com o auxílio de um microscópio intravital, bem como um dispositivo de pressão de Harvard Apparatus. A aplicação de um regulador de fluxo no ponto de entrada da câmara de vidro permite que as condições de fluxo fisiológicas comparáveis ​​entre os experimentos. Velocidade de leucócitos de rolamento é o principal resultado e é medida usando os Institutos Nacionais de Saúde de acesso aberto software ImageJ. Em resumo, o ensaio de câmara de fluxo micro autoperfused fornece um ambiente fisiológico óptimo para estudar a interacção de leucócitos endotelial e permite aos investigadores tirar conclusões precisos quando se estuda a inflamação.

Durante cada gravação leucócitos apenas interagindo são evidentes na câmara. Os resultados de uma experiência representativa pode ser visto na Figura 4. As setas brancas indicam a leucócitos individuais que foram capturados por a molécula de adesão de interesse e estão rolando ao longo da câmara entre outras que fluem livremente dentro do fluxo sanguíneo. Um artefacto comum no exterior da câmara pode ser visto com os grandes esferas escuras em todas as imagens. As esferas escuras ajudar o leitor a apreciar o movimento dos leucócitos em relação a um ponto fixo. Leucócitos avanço ao longo de um período de 22 segundos pode ser visto em relação às esferas. O gráfico na mesma figura mostra um gráfico final dos dados, onde Tx1 diminui a velocidade de rolamento (um desvio para a esquerda) e Tx2 aumenta a velocidade (um desvio para a direita) em comparação com o controlo. 0 "/&gt; Figura 1: Preparação de tubagem para a câmara de fluxo. (A) Ferramentas necessárias para a tubulação e montagem de câmara (câmara de vidro micro 0,4 x 0,04 x 50 mm, polietileno PE10 tubulação, tubos de polietileno PE60, silício tubulação 002, tubo Y, tubo T, 35 milímetros placa de Petri, uma pinça fina, tesoura fina, suporte do tubo, o grampo vascular, 7-0 sutura de seda. (B) Preparação da artéria carótida e veia jugular para tubos de re-orientar o fluxo de sangue do rato através da câmara de revestimento. (C) Ligação da artéria carótida tubagem para o transdutor de pressão. (D) Passe o tubo do transdutor através do grampo para ajustar a taxa do fluxo de sangue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700"> Figura 2:. A exposição da artéria carótida e veia jugular (A) cortado cuidadosamente a área do pescoço para expor a traqueia (B) Limpar a artéria carótida direita, de modo que um pedaço de fio de sutura pode ser passada por baixo do vaso (pontilhado amarelo. linha descreve a artéria carótida). (C) Limpe a veia jugular esquerda, de modo que um pedaço de fio de sutura pode ser passado sob o vaso (linha amarela pontilhada descreve a veia jugular). (D) Organizar frouxamente amarrados suturas nas regiões superiores e inferiores da artéria carótida e veia jugular (setas indicam as regiões superiores e inferiores dos vasos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700"> Figura 3: Ligação da tubagem para tele artéria carótida ea veia jugular. (A) Apertar o nó superior na carótida e coloque o grampo abaixo do nó inferior. (B) Usando a microtesoura, fazer uma pequena incisão na carótida, cerca de 1/8 da circunferência (círculo amarelo pontilhada indica a incisão). ( C) Insira o tubo na carótida e seguro, com pelo menos duas suturas (linha pontilhada verde mostra a tubulação e a linha pontilhada amarela da artéria carótida). (D) Do mesmo modo inserir tubulação na jugular (linha pontilhada verde mostra a tubulação e a amarelo linha pontilhada a veia jugular). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700"> Figura 4: curso de leucócitos rolando através do cham fluxo tempo Representanteber (Escala bar = 100 mm) (setas brancas apontam leucócitos rolando). Gráfico mostra resultados representativos após a exportação em um programa de gráficos (Tx1 e Tx2 são grupos de tratamento experimental e CTR é o grupo controle). Tx1 representa um tratamento em que os leucócitos abrandar levando a uma diminuição na velocidade de leucócitos e um desvio para a esquerda do gráfico em comparação com o grupo não tratado (CTR) de rolamento, enquanto Tx2 leva a um deslocamento para a direita o que reflecte um aumento na velocidade de rolamento de leucócitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um circuito fechado arteriovenoso ex vivo para avaliar as interações dos leucócitos com as moléculas de adesão endotelial em condições fisiológicas de fluxo. Isso é feito primeiro revestindo uma câmara de vidro fina com a molécula de adesão endotelial de interesse. Na segunda etapa, tubos de polietileno e silicone são conectados à câmara e, em seguida, cirurgicamente ao mouse.Em seguida, o sangue da artéria carótida pode fluir através do tubo. E as interações subsequentes dos leucócitos nativos com a câmara de vidro revestida são registradas em tempo real. Em última análise, os efeitos de vários tratamentos no deslocamento e na velocidade de rolamento dos leucócitos à medida que interagem com as moléculas de adesão imobilizadas podem ser calculados ao longo do tempo.A principal vantagem desta técnica sobre a técnica existente, como uma análise por citometria profissional, é que, com esta técnica, a interação dos leucócitos com as moléculas endoteliais é avaliada em condições fisiológicas de fluxo. No dia anterior ao experimento, conecte um centímetro de tubo de polietileno PE 10 a um pedaço de tubo de silicone de seis centímetros, seguido por cinco centímetros de tubo de polietileno. Para preparar a configuração do tubo para o lado jugular do animal para o lado carotídeo, conecte o tubo como acabamos de demonstrar com a adição de uma TTU dentro do tubo de silicone de seis centímetros, a cerca de 1,5 centímetros de distância do tubo de polietileno de um centímetro.Em seguida, conecte uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone de 10 centímetros ao transdutor de pressão e insira a extremidade T do tubo T do lado carotídeo na outra extremidade. Certifique-se de que os locais de conexão estejam apertados e sem vazamentos. Em seguida, use uma seringa de um mililitro conectada a uma agulha de calibre 25 para infundir cada câmara de microfluxo com a proteína de revestimento de superfície endotelial recém-preparada de interesse e armazene as câmaras revestidas em um tubo de 15 mililitros a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.Para conectar o tubo jugular e carotídeo à câmara de microfluxo, conecte um tubo de silicone de um centímetro a cada lado da câmara e, em seguida, sele as conexões com um pequeno pedaço retangular de parapeito esticado com o tubo encontra a câmara. Use uma seringa para encher a câmara e o tubo com 0,1% de albumina de soro bovino. E depois de verificar se há vazamento, incube na câmara por 45 minutos.À temperatura ambiente perto do final da incubação, estabilize a câmara de microfluxo em um entalhe na placa de Petri com uma pequena gota de silicone em cada entalhe. Em seguida, conecte os tubos jugular e carotídeo a cada lado da câmara. Em seguida, enquanto o silicone está secando, conecte uma seringa de travamento de 60 mil cheia de heparina ao transdutor de pressão e passe heparina de grau 100 USP pela tubulação e pela câmara até que não haja bolhas de ar.Antes de conectar o mouse à câmara de microfluxo, ligue o computador, o microscópio e o dispositivo de registro de pressão apropriado. Depois que o software estiver configurado, prenda um mouse de 10 a 12 semanas. Na posição ventral, faça uma incisão na região do pescoço com uma tesoura e, em seguida, disseque a glândula tireoide para expor a traqueia e os vasos.Limpe a artéria carótida até que esteja totalmente exposta. Tomando cuidado para não danificar o nervo vago. Em seguida, passe a dobra de um pedaço dobrado de sutura por baixo da artéria carótida e corte a sutura na curva.Portanto, há duas peças de sutura embaixo da artéria. Enrole cada sutura em nós sem apertar e, em seguida, coloque as suturas para a veia jugular esquerda da mesma maneira. Quando as suturas jugulares estiverem no lugar, injete um mililitro de heparina no ip do camundongo.Após a injeção, aperte a sutura superior na artéria carótida e coloque uma pinça de vaso o mais baixo possível na seção exposta da artéria. Use uma pinça para segurar a artéria pela sutura superior e, em seguida, use uma microtesoura fina para fazer uma pequena incisão com cerca de um oitavo da circunferência da artéria perto da sutura superior. Agora insira o tubo da artéria carótida usando um suporte de tubo através da incisão feita na artéria e passe-o pela sutura inferior.Em seguida, amarre a sutura inferior seguida pela superior. Assim, a artéria é selada ao redor da tubulação, fazendo vários nós para garantir uma vedação firme. Depois de repetir o mesmo procedimento para o tubo jugular, menos a pinça do vaso, abra temporariamente a pinça do vaso no tubo da artéria carótida para testar o fluxo.Se não houver vazamentos, mova o mouse para o microscópio e conecte o tubo da veia carotídea e jugular ao tubo da câmara de microfluxo para registrar a velocidade de rolamento dos leucócitos através da câmara de microfluxo. Solte totalmente a pinça carotídea para encher a câmara. Deixe o sangue circular por três a cinco minutos para que as condições de fluxo se estabilizem.Enquanto isso, ajuste o microscópio stage para que a câmara fique nivelada com a objetiva do microscópio e sua borda fique paralela à janela de gravação de vídeo na tela. Em seguida, construa uma placa de Petri com água em temperatura ambiente e, em seguida, abaixe a objetiva de imersão em água de 10 x na placa para que as células que fluem através da câmara sejam visíveis, ajustando a intensidade da luz conforme apropriado para simular uma pressão de fluxo fisiológico média, ajuste a braçadeira na tubulação para que o transdutor leia 30 milímetros de mercúrio constantes. Em seguida, pressione start para iniciar o registro do tráfego de leucócitos e da pressão com o primeiro lapso de tempo próximo à extremidade jugular da câmara e movendo-se contra o fluxo em direção à extremidade carotídea até ser concluído.Quando a gravação terminar, feche a válvula no local de entrada para interromper o fluxo sanguíneo e substitua a câmara por uma nova câmara revestida com uma molécula de adesão diferente, se desejar. Durante cada gravação, apenas leucócitos em interação são evidentes dentro da câmara. Por exemplo, em cada uma dessas imagens, as pontas das setas brancas indicam leucócitos individuais que foram capturados pela molécula de adesão de interesse e que estão rolando ao longo da câmara entre as outras células de fluxo livre.Dentro do fluxo sanguíneo, um artefato comum fora da câmara pode ser visto com as grandes esferas escuras em todas as imagens, o que pode ajudar o espectador a apreciar o movimento dos leucócitos em relação a um ponto fixo. O gráfico ilustra um gráfico final dos dados. Observou-se que o primeiro tratamento experimental diminuiu a velocidade de rolamento evidente como um deslocamento para a esquerda, e o segundo tratamento experimental aumentou a velocidade aparecendo como um deslocamento para a direita, ambos em comparação com a velocidade de rolamento de controle em combinação com este procedimento.Outros métodos, como a rotulagem do leucócito e vivo x Viva, podem ser utilizados para responder a outras perguntas, como a contribuição da progressão da doença de certos subtipos de leucócitos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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