Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

O objetivo geral deste procedimento é criar um circuito fechado arteriovenoso ex vivo para avaliar as interações dos leucócitos com as moléculas de adesão endotelial em condições fisiológicas de fluxo. Isso é feito primeiro revestindo uma câmara de vidro fina com a molécula de adesão endotelial de interesse. Na segunda etapa, tubos de polietileno e silicone são conectados à câmara e, em seguida, cirurgicamente ao mouse.

Em seguida, o sangue da artéria carótida pode fluir através do tubo. E as interações subsequentes dos leucócitos nativos com a câmara de vidro revestida são registradas em tempo real. Em última análise, os efeitos de vários tratamentos no deslocamento e na velocidade de rolamento dos leucócitos à medida que interagem com as moléculas de adesão imobilizadas podem ser calculados ao longo do tempo.

A principal vantagem desta técnica sobre a técnica existente, como uma análise por citometria profissional, é que, com esta técnica, a interação dos leucócitos com as moléculas endoteliais é avaliada em condições fisiológicas de fluxo. No dia anterior ao experimento, conecte um centímetro de tubo de polietileno PE 10 a um pedaço de tubo de silicone de seis centímetros, seguido por cinco centímetros de tubo de polietileno. Para preparar a configuração do tubo para o lado jugular do animal para o lado carotídeo, conecte o tubo como acabamos de demonstrar com a adição de uma TTU dentro do tubo de silicone de seis centímetros, a cerca de 1,5 centímetros de distância do tubo de polietileno de um centímetro.

Em seguida, conecte uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone de 10 centímetros ao transdutor de pressão e insira a extremidade T do tubo T do lado carotídeo na outra extremidade. Certifique-se de que os locais de conexão estejam apertados e sem vazamentos. Em seguida, use uma seringa de um mililitro conectada a uma agulha de calibre 25 para infundir cada câmara de microfluxo com a proteína de revestimento de superfície endotelial recém-preparada de interesse e armazene as câmaras revestidas em um tubo de 15 mililitros a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.

Para conectar o tubo jugular e carotídeo à câmara de microfluxo, conecte um tubo de silicone de um centímetro a cada lado da câmara e, em seguida, sele as conexões com um pequeno pedaço retangular de parapeito esticado com o tubo encontra a câmara. Use uma seringa para encher a câmara e o tubo com 0,1% de albumina de soro bovino. E depois de verificar se há vazamento, incube na câmara por 45 minutos.

À temperatura ambiente perto do final da incubação, estabilize a câmara de microfluxo em um entalhe na placa de Petri com uma pequena gota de silicone em cada entalhe. Em seguida, conecte os tubos jugular e carotídeo a cada lado da câmara. Em seguida, enquanto o silicone está secando, conecte uma seringa de travamento de 60 mil cheia de heparina ao transdutor de pressão e passe heparina de grau 100 USP pela tubulação e pela câmara até que não haja bolhas de ar.

Antes de conectar o mouse à câmara de microfluxo, ligue o computador, o microscópio e o dispositivo de registro de pressão apropriado. Depois que o software estiver configurado, prenda um mouse de 10 a 12 semanas. Na posição ventral, faça uma incisão na região do pescoço com uma tesoura e, em seguida, disseque a glândula tireoide para expor a traqueia e os vasos.

Limpe a artéria carótida até que esteja totalmente exposta. Tomando cuidado para não danificar o nervo vago. Em seguida, passe a dobra de um pedaço dobrado de sutura por baixo da artéria carótida e corte a sutura na curva.

Portanto, há duas peças de sutura embaixo da artéria. Enrole cada sutura em nós sem apertar e, em seguida, coloque as suturas para a veia jugular esquerda da mesma maneira. Quando as suturas jugulares estiverem no lugar, injete um mililitro de heparina no ip do camundongo.

Após a injeção, aperte a sutura superior na artéria carótida e coloque uma pinça de vaso o mais baixo possível na seção exposta da artéria. Use uma pinça para segurar a artéria pela sutura superior e, em seguida, use uma microtesoura fina para fazer uma pequena incisão com cerca de um oitavo da circunferência da artéria perto da sutura superior. Agora insira o tubo da artéria carótida usando um suporte de tubo através da incisão feita na artéria e passe-o pela sutura inferior.

Em seguida, amarre a sutura inferior seguida pela superior. Assim, a artéria é selada ao redor da tubulação, fazendo vários nós para garantir uma vedação firme. Depois de repetir o mesmo procedimento para o tubo jugular, menos a pinça do vaso, abra temporariamente a pinça do vaso no tubo da artéria carótida para testar o fluxo.

Se não houver vazamentos, mova o mouse para o microscópio e conecte o tubo da veia carotídea e jugular ao tubo da câmara de microfluxo para registrar a velocidade de rolamento dos leucócitos através da câmara de microfluxo. Solte totalmente a pinça carotídea para encher a câmara. Deixe o sangue circular por três a cinco minutos para que as condições de fluxo se estabilizem.

Enquanto isso, ajuste o microscópio stage para que a câmara fique nivelada com a objetiva do microscópio e sua borda fique paralela à janela de gravação de vídeo na tela. Em seguida, construa uma placa de Petri com água em temperatura ambiente e, em seguida, abaixe a objetiva de imersão em água de 10 x na placa para que as células que fluem através da câmara sejam visíveis, ajustando a intensidade da luz conforme apropriado para simular uma pressão de fluxo fisiológico média, ajuste a braçadeira na tubulação para que o transdutor leia 30 milímetros de mercúrio constantes. Em seguida, pressione start para iniciar o registro do tráfego de leucócitos e da pressão com o primeiro lapso de tempo próximo à extremidade jugular da câmara e movendo-se contra o fluxo em direção à extremidade carotídea até ser concluído.

Quando a gravação terminar, feche a válvula no local de entrada para interromper o fluxo sanguíneo e substitua a câmara por uma nova câmara revestida com uma molécula de adesão diferente, se desejar. Durante cada gravação, apenas leucócitos em interação são evidentes dentro da câmara. Por exemplo, em cada uma dessas imagens, as pontas das setas brancas indicam leucócitos individuais que foram capturados pela molécula de adesão de interesse e que estão rolando ao longo da câmara entre as outras células de fluxo livre.

Dentro do fluxo sanguíneo, um artefato comum fora da câmara pode ser visto com as grandes esferas escuras em todas as imagens, o que pode ajudar o espectador a apreciar o movimento dos leucócitos em relação a um ponto fixo. O gráfico ilustra um gráfico final dos dados. Observou-se que o primeiro tratamento experimental diminuiu a velocidade de rolamento evidente como um deslocamento para a esquerda, e o segundo tratamento experimental aumentou a velocidade aparecendo como um deslocamento para a direita, ambos em comparação com a velocidade de rolamento de controle em combinação com este procedimento.

Outros métodos, como a rotulagem do leucócito e vivo x Viva, podem ser utilizados para responder a outras perguntas, como a contribuição da progressão da doença de certos subtipos de leucócitos.