Name: Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a detectar interações proteína-proteína in situ na junção neuromuscular de larvas de Drosophila usando Proximity Ligation Assay. Este método permite visualizar complexos proteicos em seu contexto tecidual nativo.

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Agradecemos ao Bloomington Drosophila da Center for fornecendo stocks de voar. Agradecemos também a estudos de desenvolvimento Hybridoma Banco e Dr. Lynn Cooley (Yale University) para a prestação de anticorpos. Um agradecimento especial vai para AhHyun Yoo por sua ajuda no manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações de Ciências Naturais e Engenharia Research Council of Canada (Krieger), o William e Ada Fundo Aço Isabelle (Krieger), e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (Harden).

1. Corpo de parede Preparação NOTA: Preparação do terceiro estádio larvar paredes do corpo (para estudo de NMJs que enervam os músculos da parede corporal) foi realizada como previamente descrito em Brent et al 10, ou Ramachandran e Budnik 11,12, mas com algumas modificações.. <ol><li> Dissecação <ol><li> Elevar existências mosca e cruzes, a 25 ° C durante cinco a seis dias, utilizando 13 procedimentos standard. </li><li> Escolha rastejando larvas de terceiro instar de frascos ou garrafas usando uma pinça fina. </li><li> Lavar as larvas numa pequena placa de Petri contendo tampão de fosfato salino (PBS) para remover quaisquer partículas de alimento. </li><li> Coloque uma única larva em um disco Sylgard e mergulhá-lo em algumas gotas de PBS gelado. Usando PBS gelado vai ajudar atordoar o larva tornando mais fácil de manipular. Ao longo do esvaziamento, assegurar que a preparação está sempre submersa em PBS para evitar que sequem. </li><li> Posicione a larva com o seu lado dorsal voltada para cima, de modo que as duas vias de traqueais são visíveis sob um microscópio de dissecção (Figura 2A). Usando a pinça para agarrar um pino minutien, fixar a larva para baixo na extremidade posterior, perto das spiracles (Figura 2B). Com um outro pino, furar através da cutícula na extremidade anterior perto dos ganchos na boca. Delicadamente, esticar a larva no sentido longitudinal, em seguida, fixá-lo para baixo (Figura 2B). </li><li> Com uma tesoura microdissecção, aperte a extremidade posterior perto do pino para criar uma pequena abertura. A incisão deve ser superficial apenas o suficiente para passar através da cutícula. </li><li> Colocar a ponta da lâmina inferior das tesouras na incisão, cortado ao longo de todo o comprimento da linha média dorsal entre as duas vias de traqueal (Figura 2C). Aponte as lâminas da tesoura ligeiramente para cima quando o corte para evitar danificar os músculos da parede ventral do corpo. </li><li> Faça uma pequena incisão horizontal ligeiramente anterior para o cargoeriorly pino colocado (Figura 2C). Fazer uma outra incisão semelhante ligeiramente posterior ao pino colocado anteriormente (Figura 2C). As incisões deve apenas passar através da cutícula. NOTA: As três incisões de passos 1.1.7 e 1.1.8 combinados deve assemelhar-se um " <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px"> "Quando concluído, ou seja, uma aba esquerda e da direita à mão no lado dorsal do corpo larval deve ser produzido. </li><li> Limpe cuidadosamente os órgãos internos com a pinça. Adicionando algumas gotas contundentes de PBS vai ajudar a substituir os órgãos fora do corpo larval, tornando assim mais fácil para removê-los. Evite cutucando o corpo larval como ele irá causar danos aos músculos da parede do corpo. </li><li> Desfraldar o corpo larval aberto e fixam os cantos para baixo (Figura 2D). Quando fixando, esticar a parede do corpo, tanto horizontal como verticalmente para formar um rectângulo uniformemente-tensionada (SEe Figura 2G para a forma), tomando cuidado para não rasgar os músculos da parede do corpo no processo. </li><li> Terminar de remover qualquer restantes órgãos internos (Figura 2E). </li></ol></li><li> Fixação e permeabilização <ol><li> Mergulhe as paredes do corpo preso em várias gotas de solução de Bouin. Incubar por 15 min no gelo. Alternativamente, usar 4% de paraformaldeído (PFA) como um fixador alternativo; incube durante 30 min. </li><li> Lavar três vezes com tampão fosfato salina com Triton (PBT). </li><li> Usando uma pinça fina, retire cuidadosamente os pinos e transferir as paredes do corpo por seus cantos em um siliconized 0,65 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Armazenar as paredes do corpo em PBT a 4 ° C até estar pronto para o PLA. Para melhores resultados, comece imunocoloraï¿½o as paredes do corpo dentro de um ou dois dias de dissecção. NOTA: Para economizar nos reagentes e para assegurar que todas as paredes do corpo são tratados da mesma forma durante o ensaio, diferentes genótipos podem ser colocados em uma únicatubo. Os genótipos podem ser distinguidos através do corte dos cantos das paredes do corpo de forma diferente (ver Figura 2F para exemplos). </li></ol></li></ol> 2. A imuno-histoquímica NOTA: A imunocoloração de terceiro estádio larvar paredes do corpo foi realizada como previamente descrito em Brent et al 14 e Ramachandran e Budnik 11, mas com algumas modificações 11,14.. NOTA: Execute todas as etapas à temperatura ambiente e com agitação suave, salvo indicação contrária. <ol><li> Bloqueio <ol><li> Lavam-se as paredes do corpo com PBT três vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Bloquear com 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) durante 1 h. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Incubar as paredes do corpo com anticorpos de ratinho e de coelho primárias contra as duas proteínas de interesse (diluídos em 1% de BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. Neste caso, usar 1:10 rato anti-Dlg e 1: 250 de um coelhonti-HtsM 15,16. Os anticorpos contra os marcadores que não são feitos em rato ou coelho também podem ser incluídos - por exemplo, usar 1: 200 de cabra anti-HRP para delinear as membranas neuronais. </li><li> Lavar três vezes com PBT durante 10 min cada. </li><li> Incubar com anticorpos secundários conjugados com um fluoróforo para detectar os marcadores (diluídos em 1% de BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. Como o sinal de PLA é depois visualizada com um fluoróforo vermelho, outro fluoróforo deve ser usada para detectar o marcador - por exemplo, usar 1: 200 conjugado com FITC anti-cabra para detectar o anticorpo de cabra anti-HRP. Devido ao uso de reagentes sensíveis à luz, manter os tubos no escuro a partir deste ponto. NOTA: O kit que é usado para PLA permite a ser realizada entre os anticorpos primários desenvolvidos no rato e coelho, com o sinal visualizado no canal vermelho sob microscopia confocal. Se desejado, outros kits disponíveis que permitem o ensaio deve ser feito com primary anticorpos desenvolvidos em outras espécies, e o sinal visualizado em outros canais. </li></ol></li></ol> 3. Proximidade Ligation Assay NOTA: Execute todas as etapas à temperatura ambiente e com agitação suave, salvo indicação contrária. <ol><li> PLA Sondas <ol><li> Lavam-se as paredes do corpo com PBT três vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Incubar com sondas PLA (1: 5 de cada diluição em 1% de BSA) durante 2 horas a 37 ° C. Neste caso, usar 40 ul de sonda de PLA anti-ratinho MENOS, 40 ul de sonda de PLA anti-coelho PLUS e 120 ul de BSA a 1% para assegurar a imersão adequada e mistura de 5-10 paredes do corpo. Até uma diluição das sondas PLA 01:25 ainda pode resultar em uma proporção adequada de sinal-para-ruído (isto é, para esta experiência). </li></ol></li><li> Ligadura <ol><li> Lave as paredes do corpo com Wash Buffer A duas vezes por 5 min cada. </li><li> Incubar com solução Ligadura (diluição 1:40 de ligase em tampão de ligação) durante 1 hora umat 37 ° C. Neste caso, utilizar 5 ul de ligase, 40 ul de tampão de 5 ligadura e 155 ul de água de pureza elevada para assegurar a imersão adequada e mistura de 5-10 paredes do corpo. </li></ol></li><li> Amplificação <ol><li> Lave as paredes do corpo com Wash Buffer A duas vezes para 2 min cada. </li><li> Incubar com solução Amplificação (diluição 1:80 em tampão de polimerase da amplificação) durante 2 horas a 37 ° C. Neste caso, usar 2,5 ul de polimerase, 40 ul de tampão de 5 Amplificação e 157,5 uL de água de pureza elevada para assegurar a imersão adequada e mistura de 5-10 paredes do corpo. </li></ol></li><li> Preparação para criação de imagens <ol><li> Lave as paredes do corpo com tampão de lavagem B duas vezes por 10 min cada. </li><li> Lavar com 0.01x Wash Buffer B uma vez para 1 min. </li><li> Equilibrar com algumas gotas de solução de montagem para, pelo menos, 30 min antes da montagem, ou armazenar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Usando uma pinça fina, transferir cuidadosamente as paredes do corpo sobre uma lâmina de plataforma wom suas cutículas voltado para baixo. Posicione as paredes do corpo em fileiras e com a mesma orientação dentro de uma gota ou duas de montagem. Coloque uma 22 mm x 40 milímetros lamela sobre a preparação tomando cuidado para não gerar bolhas de ar, em seguida, selar o slide com unhas polonês claro. </li><li> Guarde os slides no escuro a -20 ° C até que esteja pronto para a imagem latente confocal. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este relatório demonstra como PLA pode ser aplicado para a Drosophila larval JNM. O ensaio é realizado em preparações de músculo da parede do corpo de larvas para a finalidade de detecção de interacções proteína-proteína endógenos presentes na NMJ. Com esta técnica, Dlg e Hts mostram-se em estreita proximidade uns dos outros, e assim existir em um complexo, especialmente na região pós-sináptica 27. Em apoio a esse resultado, um estudo anterior tenha apresentado provas de sua associação com os seguint...

Discos de Drosophila grande (Dlg) é um membro conservada da guanilato-quinase associada à membrana da família de proteínas de andaimes que ajudam a orquestrar a montagem de grandes complexos de proteínas em sítios específicos da membrana plasmática. Originalmente identificado como uma proteína supressora de tumor, Dlg serve como um importante determinante da epitelial 1,2,3 apicobasal polaridade. Dlg também serve como um importante módulo de andaime na junção neuromuscular (JNM) dos neurônios motores glutamatérgicos durante o desenvolvimento larval 4. Dlg desempenha diversos papéis na JNM larval, e a sua pleiotropismo depende da sua capacidade de se associar com várias proteínas de 5,6. Uma dessas proteínas é Hu-li tai Shao (HTS), um homólogo às adducins mamíferos que foram descritos principalmente no que diz respeito às suas funções na regulação da actina-spectrin citoesqueleto 7. Foi previamente mostrado que Dlg e Hts pode formar um complexo com os outros com base em testes in vitro </em&gt; experimentos co-imunoprecipitação envolvendo toda mosca adulta lisados ​​8. Uma desvantagem destes resultados, no entanto, é que elas não indicam onde este formas complexas. Com a utilização de imuno-histoquímica, as distribuições de Dlg e Hts são observados a sobrepor-se na membrana pós-sináptica da NMJs larvas, mas são eles em um complexo na região 8? Como mostrado recentemente e detalhado mais aqui, Proximity Ligation Assay (PLA) é usado para procurar um em associação situ entre Dlg e Hts especificamente no larval NMJ 27. PLA é uma técnica relativamente nova usado principalmente em cultura de células e de tecidos que podem detectar interacções proteína-proteína in situ 9. Neste ensaio, os anticorpos primários contra as duas proteínas de interesse são detectados com um par de anticorpos secundários específicos da espécie, denominados sondas de PLA, que são conjugados com oligonucleótidos (Figura 1A, B). Se as duas proteínass estão em estreita proximidade uns dos outros (isto é, dentro de poucas dezenas de nanómetros), a distância entre as sondas de PLA podem ser ligados em ponte através de hibridação de dois oligonucleótidos de conectores adicionais (Figura 1C). Neste conformação, as extremidades livres dos oligonucleótidos do conector está perto o suficiente para entrar em contacto uns com os outros, e uma molécula de ADN circular, fechada pode ser formada a partir de ligadura situ (Figura 1D). A molécula de ADN circular, serve como molde para a amplificação in situ círculo rolante, o qual é preparado por um dos oligonucleótidos conjugados com as sondas de PLA (Figura 1E). Sequências dentro do amplificado, produto de ADN concatemeric resultante pode então ser visualizado com marcada com fluorescência, as sondas de oligonucleótidos complementares (Figura 1F). Uma vez que o ADN amplificado permanece ligado a uma das sondas de PLA, a localização subcelular da interacção proteína-proteína withind tecido pode ser facilmente determinada. Vários métodos são comumente usados ​​para detectar interacções proteína-proteína, incluindo técnicas in vitro tais como a co-imunoprecipitação, ensaios de pull-down e levedura de rastreio de dois híbridos, e em técnicas in vivo, tais como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) e Bimolecular Complementação de fluorescência ( BiFC). Um problema das técnicas in vitro é que eles não identificam onde a interacção ocorre endogenamente, enquanto o acima mencionados nas técnicas in vivo envolvem a expressão artificial de proteínas de fusão que pode não reflectir o comportamento nativo dos seus homólogos endógenos. Uma grande vantagem de PLA é que ele é capaz de determinar dentro de um tecido a localização subcelular de proteínas de interactores endógenos que estão em estreita proximidade uns dos outros e provável que formam um complexo, com o grau de proximidade necessária para gerar um sinal a ser comparáveis ​​aos FRET e BiFC. PLA podem detectar interacções com elevada especificidade e sensibilidade devido ao acoplamento de reconhecimento do anticorpo e a amplificação de ADN. Assim, o ensaio pode gerar sinais luminosos discretas, em forma de pontos lacrimais que indicam a posição exacta da interacção. Além disso, os antigénios dificilmente visíveis pode ser detectada. Finalmente, PLA é uma técnica relativamente simples de executar, e já não tem do que um procedimento padrão imuno-histoquímico para ser concluído. Portanto, PLA fornece uma vantagem técnica sobre outros ensaios de interação proteína-proteína que muitas vezes são atormentados com tempos de preparação longa e extensa solução de problemas. Este protocolo demonstra como PLA pode ser aplicado para a Drosophila larval JNM para a finalidade de detecção de interacções proteína-proteína endógenos, in situ. Aqui, PLA é realizada em preparações de músculos da parede do corpo larval onde Dlg e Hts são mostrados para realmente existem em um complexo na região pós-sináptica da NMJs. PLA não tenha sido previamente utilizado para estudar a NMJ larval, e existem, actualmente, apenas um punhado de artigos publicados que utilizaram este ensaio no tecido Drosophila. Espera-se que uma maior exposição do PLA para a comunidade Drosophila resultará em aumento da sua utilização como uma ferramenta adicional para complementar outras, mais comumente utilizados ensaios de interação proteína-proteína.

<table><tbody><tr><td>Fórceps (fino #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Misture a base de elastômero e o agente de cura na proporção de 10:1. Defina por 30 min. Despeje em um molde (por exemplo use uma placa de cultura de células de 12 poços). Deixe curar por pelo menos 24 horas. Cole a tampa de uma tampa de placa de Petri de 60 x 15 mm ao dissecar.</td></tr><tr><td>Pins Minutien (0.0125&nbsp; mm de diâmetro)</td>Tesoura de Microdissecação <td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>(ultrafina)</td><td>Lâminas</td><td></td> de Plataforma Fine Science Tools 15200-00 <td></td></tr><tr><td></td> Cole duas lamínulas de 22 x 22 mm2 em uma lâmina de microscópio com esmalte transparente, deixando um <<td></td><td></td><td> Folga de 20 mm entre elas para montagem de amostras.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>O estoque foi rebalanceado em um balanceador GFP para que mutantes homozigotos possam ser selecionados com base na ausência de sinal GFP.</td></tr><tr><td>1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7,0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Solução de Bouin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (Paraformaldeído): 4% PFA em 1x PBS</td><td></td><td></td><td>PFA (Ciência da Anachemia - 66194-300). Consulte doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 para obter instruções sobre como fazer a solução.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT (solução salina tamponada com fosfato com Triton): 1x PBS com 0,01% de Triton</td><td></td><td></td><td>Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (albumina de soro bovino): 1% BSA em 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001). Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>camundongo anti-Dlg (Discos grandes)</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>4F3</td><td>Use em uma diluição de 1:10 em 1% BSA.</td></tr><tr><td>coelho anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>Fornecido pela Dra. Lynn Cooley (Universidade de Yale). Use em uma diluição de 1:250 em 1% BSA.</td></tr><tr><td>coelho anti-Pak (quinase ativada por p21)</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use em uma diluição de 1:500 em 1% BSA.</td></tr><tr><td>camundongo anti-Wg (sem asas)</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>4D4</td><td>Use em uma diluição de 1:5 em 1% BSA.</td></tr><tr><td>anti-Hrp de cabra (peroxidase de rábano)</td> <td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Use em uma diluição de 1:200 em 1% BSA.</td></tr><tr><td>Burro conjugado com FITC anti-cabra</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>Use em uma diluição de 1:200 em 1% BSA.</td></tr><tr><td>Sonda PLA In Situ Duolink anti-mouse MENOS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Sonda PLA Duolink In Situ anti-coelho PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de Detecção In Situ Duolink Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Tampão de Lavagem A: 0.01&nbsp; M Tris, 0.15&nbsp; M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Tampão de Lavagem B: 0.2&nbsp; M Tris, 0.1&nbsp; M NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0.01x Tampão de Lavagem B: 2&nbsp; mM Tris, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Duolink Meio de Montagem In Situ com DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de in situ complexos proteína-proteína no drosophila larval junção neuromuscular usando proximity ligation assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discos grandes (Dlg) são um membro conservado da família da guanilato quinase associada à membrana e servem como uma importante proteína de andaime na junção neuromuscular larval (NMJ) em Drosophila. Estudos anteriores mostraram que a distribuição pós-sináptica de Dlg na larva NMJ se sobrepõe à de Hu-li tai shao (Hts), um homólogo das aducinas de mamíferos. Além disso, observa-se que Dlg e Hts formam um complexo entre si com base em experimentos de co-imunoprecipitação envolvendo lisados de moscas adultas inteiras. Devido à natureza desses experimentos, no entanto, não se sabia se esse complexo existe especificamente no NMJ durante o desenvolvimento larval.
O Ensaio de Ligação de Proximidade (PLA) é uma técnica recentemente desenvolvida usada principalmente em cultura de células e tecidos que pode detectar interações proteína-proteína in situ. Neste ensaio, as amostras são incubadas com anticorpos primários contra as duas proteínas de interesse usando procedimentos imuno-histoquímicos padrão. Os anticorpos primários são então detectados com um par especialmente projetado de anticorpos secundários conjugados com oligonucleotídeos, denominados sondas PLA, que podem ser usados para gerar um sinal somente quando as duas sondas se ligam próximas uma da outra. Assim, as proteínas que estão em um complexo podem ser visualizadas. Aqui, é demonstrado como o PLA pode ser usado para detectar interações proteína-proteína in situ na larva de Drosophila NMJ. A técnica é realizada em preparações musculares da parede corporal larval para mostrar que um complexo entre Dlg e Hts realmente existe na região pós-sináptica das JNMs.

Em selvagens terceiro estádio NMJs larvais, Dlg é predominantemente encontrado na membrana pós-sináptica de tipo I boutons glutamatérgicos, com níveis de imunorreatividade Dlg sendo mais pronunciada na boutons tipo Ib que o tipo é boutons (Figura 3A) 4. Hts está presente em todo o músculo, mas concentra-se na região pós-sináptica com Hts níveis imunorreatividade aparecendo igual em ambos os tipos I boutons, e também é encontrada pré-sináptico (Figura 3A ') 8,17. No...

Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a localização subcelular das interações proteicas endógenas na larva de drosófila NMJ. Isso é obtido realizando imunofluorescência usando um par de anticorpos secundários conjugados com oligonucleotídeos denominados sondas PLA, que se ligam aos anticorpos primários contra as duas proteínas de interesse. Em seguida, a lacuna entre as sondas PLA é preenchida por meio da hibridização dos dois oligonucleotídeos conectores.Somente quando as duas proteínas estão próximas uma da outra e uma molécula de DNA circular fechada é formada após a ligação in situ, a amplificação do círculo rolante in situ é realizada para amplificar sequências dentro da molécula de DNA circular fechada, que são subsequentemente detectadas com oligonucleotídeos complementares marcados com fluorescência. O sinal fluorescente resultante gerado a partir de cada produto de amplificação é, portanto, facilmente visível como um ponto brilhante distinto quando visto usando microscopia confocal. Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos existentes, como E dois híbridos de precipitação e ameaça, é que o PLA é capaz de detectar dentro do tecido a localização subcelular de proteínas endógenas que estão localizadas próximas umas das outras e provavelmente formando um complexo.Embora este método forneça informações sobre as redes de interação proteína-proteína que ocorrem especificamente em larva e mj. Também pode ser aplicado a outros sistemas jolo. Sugira os tecidos epiteliais em embriões e discos imaginários.Demonstrando o procedimento estarão hel yu e Ha king, dois técnicos de nosso laboratório. Depois de incubar culturas de drosófilas a 25 graus Celsius por cinco a seis dias, use uma pinça fina para pegar larvas rastejantes de terceiro ínstar dos frascos ou garrafas para lavar as larvas. Transfira-os para uma pequena placa de Petri contendo PBS.Em seguida, coloque uma das larvas lavadas em um disco de charuto S e mergulhe-o em várias gotas de PBS gelado para prejudicá-lo, tornando-o mais fácil de manipular. Posicione as larvas com o lado dorsal voltado para cima, de modo que os dois rastros traqueais sejam visíveis sob um microscópio de dissecação. Em seguida, usando a pinça para segurar um alfinete de nuchin, prenda as larvas na extremidade posterior perto das espirais com outro alfinete, perfure a cutícula na extremidade anterior perto dos ganchos da boca e estique suavemente as larvas no sentido do comprimento antes de prendê-las.Em seguida, usando micro dissecção, uma tesoura aperta a extremidade posterior perto do pino para criar uma pequena abertura, a incisão deve ser superficial o suficiente para passar apenas pela cutícula. Em seguida, coloque a ponta da lâmina inferior da tesoura na incisão e, enquanto aponta as lâminas da tesoura ligeiramente para cima para evitar danos aos músculos subjacentes, corte ao longo de todo o comprimento da linha média dorsal entre os dois tratos traqueais. Agora faça uma pequena incisão horizontal através da cutícula, ligeiramente anterior ao pino colocado posteriormente.Em seguida, faça outra incisão semelhante ligeiramente posterior ao pino colocado anteriormente. Depois de adicionar algumas gotas fortes de PBS ao corpo larval, use o fórceps para limpar cuidadosamente os órgãos internos. Evite cutucar o corpo da larva, pois isso causará danos ao corpo.Os músculos da parede abrem o corpo da larva e, para prender os cantos, estique a parede do corpo horizontal e verticalmente para formar um retângulo uniformemente tensionado. Tomando cuidado para não rasgar os músculos da parede do corpo no processo de fixação do tecido. Mergulhe as paredes do corpo presas em várias gotas de solução de boan e incube no gelo por 15 minutos após a fixação.Use PBT para enxaguar o tecido três vezes. Em seguida, economizar reagentes e garantir que todas as paredes do corpo sejam tratadas igualmente durante o ensaio. Corte os cantos de cada genótipo de forma diferente para distingui-los.E depois de remover os pinos com pinças finas, coloque-os todos no mesmo tubo de microcentrífuga siliconizado de 0,65 mililitro. Para permear o tecido, use PBT para lavar as paredes do corpo três vezes por 10 minutos cada. Depois de remover a lavagem final, adicione 1% BSA para bloquear as amostras e incubar por uma hora.Ao lado da imunocoloração, as paredes do corpo adicionam anticorpos primários de camundongos e coelhos contra as duas proteínas de interesse e incubam por duas horas. Neste caso, um a 10 camundongos anti DLG e um a 250 coelhos anti HTS em 1% BSA são usados. Anticorpos contra marcadores também podem ser adicionados após a incubação.Use PBT para lavar as paredes da carroceria três vezes por 10 minutos cada. Em seguida, adicione quatro anticorpos secundários marcados com flúor contra quaisquer marcadores em 1% BSA e incube no escuro a quatro graus Celsius durante a noite na manhã seguinte. Use PBT para lavar as paredes da carroceria três vezes por 10 minutos cada.Iniciar o ensaio com uma diluição de um a cinco em pelo menos 200 microlitros. Volume total da sonda PLA, anti-rato menos e sonda PLA anti-coelho mais em 1% BSA para incubar as paredes do corpo por duas horas a 37 graus Celsius após usar o tampão de lavagem A para lavar as paredes do corpo duas vezes por cinco minutos cada em uma diluição de um a 40 de Ligase em solução de Ligase, incubar durante uma hora a 37 graus Celsius após a incubação. Use o tampão de lavagem A para lavar as paredes do corpo duas vezes por dois minutos cada antes de adicionar uma diluição de uma a 80 da polimerase na solução de amplificação.Incube por duas horas a 37 graus Celsius para preparar as amostras para imagens. Use o tampão de lavagem B para lavar as paredes do corpo duas vezes por 10 minutos cada. Em seguida, use uma diluição de 100 x do tampão de lavagem B para fazer uma lavagem final por um minuto.Equilibre as paredes do corpo em algumas gotas de solução de montagem por pelo menos 30 minutos usando uma pinça fina. Transfira cuidadosamente as paredes do corpo para uma corrediça de plataforma com o espaçamento da cutícula para baixo. Posicione-os em linhas na mesma orientação dentro de uma ou duas gotas de solução de montagem.Coloque uma lamínula de 22 milímetros por 40 milímetros sobre a preparação, tomando cuidado para não gerar bolhas de ar. Em seguida, use esmalte transparente para selar o slide. Armazene as lâminas a 20 graus Celsius negativos até que estejam prontas para a imagem confocal.Como mostrado aqui em njs larvais do tipo selvagem, DLG é predominantemente encontrado na membrana pós-sináptica do tipo um bhuton glutamatérgico com níveis sendo mais pronunciados no tipo um B do que no tipo um S bs HTS é encontrado em todo o músculo, mas se concentra na membrana pós-sináptica com níveis iguais em ambos os tipos um Bhuton, DLG e HTS se sobrepõem amplamente na região pós-sináptica para determinar se DLG e HTS existem em um complexo. No N-M-J-P-L-A foi realizado com anticorpos anti DLG e anti HTS como visto aqui. O sinal de PLA entre as duas proteínas é observado especificamente no tipo selvagem NMJ, o sinal localiza-se principalmente circunferencialmente à membrana pré-sináptica marcada por HRP.Assim, DLG e HTS estão próximos e provavelmente formam um complexo na região pós-sináptica. O resultado é específico como um controle negativo envolvendo mutantes HTS que não possuem. A imunorreatividade HTS não mostra sinal PLA observável As vistas de alta ampliação do bns mostram que a imunorreatividade DLG e HTS se sobrepõem grosseiramente na membrana pós-sináptica.Em contraste, o PLA entre as duas proteínas resulta em PUNCTA discreto, indicando que apenas um subconjunto do total de proteínas DLG e HTS está em complexo Uma vez dominado. Esta técnica não leva mais do que um procedimento imuno-histoquímico padrão para ser concluída. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o PLA é usado para detectar a localização subcelular da interação proteína-proteína endógena que ocorre na larva NMJ.

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Este vídeo demonstra a visualização das interações proteína-proteína na junção neuromuscular (NMJ) Drosophila usando o Ensaio de Ligação de Proximidade (PLA). Depois de isolar as paredes do corpo, as proteínas que interagem são sondadas com anticorpos primários e anticorpos secundários conjugados com PLA. A proximidade das proteínas que interagem facilita a ligação de sondas com oligonucleotídeos conectores, formando DNA circular, que é então amplificado por amplificação de círculo rolante. As...

Detecção de interações proteína-proteína em larvas de Drosophila usando um ensaio de ligação de proximidade

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Aprenda a detectar interações proteína-proteína in situ na junção neuromuscular de larvas de Drosophila usando Proximity Ligation Assay. Este método permite visualizar complexos proteicos em seu contexto tecidual nativo.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

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