Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling

O objetivo do procedimento a seguir é quantificar rápida e automaticamente as mudanças na morfologia celular e a localização subcelular de proteínas específicas de interesse em um grande número de células em resposta a um estímulo específico. Isso é feito estimulando primeiro as células T com os tipos de quimioterapia de interesse. Na segunda etapa, as células são marcadas com fluorescência e depois analisadas por citometria de fluxo de imagem.

Na etapa final, o número de linfócitos morfologicamente polarizados e a quantidade de segregação dos marcadores fluorescentes podem ser avaliados com base na localização e na intensidade dos pixels para cada coloração, dependendo da máscara escolhida. Em última análise, essa tecnologia de citometria de fluxo de imagem pode ser usada para quantificar de forma rápida e robusta as alterações morfológicas dos linfócitos após a estimulação com quimiocinas, bem como a localização de proteínas específicas de interesse dentro das células polarizadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia, é que um grande número de células pode ser processado repetidamente e analisado automaticamente, garantindo uma análise estatisticamente forte das mudanças morfológicas e da distribuição de proteínas.

Nos linfócitos T estimulados por quimiocinas, a estimulação do tipo Boche das células T começa lavando cinco vezes o centro das cinco células por condição experimental em HBSS quente suplementado com 10 HEPs milimolares centrifuga por cinco minutos a 340 vezes G.At temperatura ambiente, remova o supinato e ressuspenda os pellets em 0,3 mililitros de HBSS quente por peça por tubo. Em seguida, transfira as suspensões celulares para tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 10 a 500 nanogramas por mililitro de quimiocina a cada tubo e, em seguida, vire os tubos várias vezes para misturar.

Incube as células em banho-maria a 37 graus Celsius. Após oito a 10 minutos, pare a polarização com 0,3 mililitros de paraldeído quente a 2% suplementado com 10 milimolares. Ele ervilhas.

Em seguida, misture os tubos com mais inversão e incube-os por mais cinco minutos a 37 graus Celsius para corar as células para análise de imunofluorescência. Em seguida, transfira as células T estimuladas para os tubos de citometria de fluxo correspondentes. Encha os tubos completamente com tampão de coloração.

Em seguida, gire as células e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de soro de bezerro fetal a 5% em PBS. Agora adicione cinco microlitros de ZI N-T-H-L-A-A-B-C a cada tubo. Vortice-os e incube as células por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro no final da incubação.

Lave as células duas vezes e depois incube-as em 500 microlitros de formaldeído a 1% para. Após 10 minutos, lave as células em mais tampão de coloração e, em seguida, encha os tubos completamente com tampão de permeação. Depois de lavar as células duas vezes no tampão de permeação, deixei os tubos removerem o supinado e, em seguida, os vórtices para dissociar os grânulos celulares.

Agora corar as amostras com ponto zero 25 microgramas por mililitro, trixi para lombo, vórtice e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Então, no final do período de incubação, lave as células em tampão de permeação. Mais uma vez, resus.

Suspenda os pellets em 200 microlitros de PBS e, em seguida, transfira as células para tubos de microcentrífuga individuais para determinar a porcentagem de células T polarizadas após a estimulação da quimiocina. Primeiro ligue o citômetro de fluxo de imagem e deixe-o calibrar de acordo com as instruções do fabricante. Desenhe histogramas que quantificam os valores de gradiente RMS da população em foco selecionada no gradiente RMS.

O histograma delineia a população de células únicas em um histograma da área, uma vez que o tubo de microcentrífuga foi inserido na máquina, ajusta a marcha de potência do laser em células individuais e adquire 5.000 linfócitos T. No software de análise de ideias. Abra os arquivos adquiridos e crie um histograma mostrando o valor RMS do gradiente para as imagens de campo claro obtidas para cada célula individual, desenhando uma porta nas células, exibindo um valor de gradiente RMS acima de 57.

No menu de análise, crie uma nova máscara chamada erosão M1 dois da máscara de morfologia nas imagens de campo claro M zero um erodido de dois pixels. Em seguida, no menu de recursos de análise, crie um novo recurso da área calculada na máscara de erosão M1 duas a partir das células criadas na porta anterior. Abra um histograma mostrando a área das células Usando esta máscara recém-criada, desenhe uma porta nas células T individuais, excluindo as esferas de calibração e detritos na área pequena, bem como os gibões na área grande.

Em seguida, abra a. bot consistindo no máximo bruto na coloração H-L-A-A-B-C em função do pixel máximo bruto na coloração Phin no menu de máscaras de análise traseiro para nova máscara chamada erosão M dois dois da máscara morfológica das células de coloração H-L-A-A-B-C erodidas de dois pixels. Em seguida, no menu de recursos de análise, crie um novo recurso que consiste no parâmetro de circularidade calculado na erosão M dois dois.

Em seguida, crie outro histograma para relatar os valores do recurso de circularidade das células previamente fechadas. Em seguida, olhando para a forma do histograma para as células não estimuladas, ágata RO para as células polarizadas, começando no valor de circularidade mais baixo até o valor limite de circularidade, onde a maioria das células não estimuladas são plotadas para avaliar a polarização da coloração de actina dentro das células. Além de um histograma para a semelhança de detalhes brilhantes, R três valor para comparar o H-L-A-A-B-C e o foid na coloração.

Em seguida, usando a mesma estratégia de gating que acabamos de demonstrar, além de um GA nas células não estimuladas para a coloração segregada não colocalizada. O painel de estatísticas mostra a porcentagem de células T com coloração de actina polarizada aqui. Exemplos de linfócitos T estimulados por CCL 19 que caem na porta das células não polarizadas ou polarizadas são mostrados.

Diferenças na morfologia entre as duas subpopulações podem ser claramente observadas. A estratégia de gating recém-demonstrada também pode ser usada para traçar a porcentagem de células que caem na porta polarizada na ausência de presença de CCL 19. Como esperado, está claro que a estimulação com quimiocinas aumenta a porcentagem de células T polarizadas.

O índice médio de circularidade de toda a população celular obtido em ambas as condições também pode ser plotado. De fato, a estimulação CCL 19 provoca uma queda nesse índice. No entanto, como apenas metade das células é polarizada, a mudança no índice de circularidade médio observada na estimulação do CCL 19 é pequena.

Neste experimento, as células T foram seccionadas com GFP juntamente com plasmídeos que codificam para os mutantes negativos dominantes do complexo de polaridade par seis. PKC zeta. O histograma para as células não transfectadas permitiu um gating específico para as células T positivas para GFP relevantes, indicando que uma pequena fração de toda a população de células foi transfectada.

O grau de polarização morfológica dessas células transfectadas foi então quantificado medindo apenas o índice de circularidade das células GFP positivas e uma marcha adicional para as células T. Exibindo baixos valores de circularidade foi criado para estimar a porcentagem de células polarizadas em cada condição tomada. Juntos, esses dados demonstram que a interrupção da função do par seis PK CZ na via de sinalização inibe a polarização das células T induzida pelas quimiocinas CCL 19 e c Xcl 12.

Em linha com descobertas anteriores. Ao tentar este procedimento, é muito importante trabalhar sempre a 37 graus Celsius durante toda a etapa de estimulação da solução e a fixação seguinte para garantir uma polarização morfológica forte e confiável dos linfócitos.