Name: Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a quantificar mudanças morfológicas em linfócitos T após estimulação por quimiocinas usando citometria de fluxo por imagem. Este método permite análise rápida e robusta da localização proteica em grandes populações celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem grandemente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert e Louise Rimbault da Facilidade Cochin Imaging. Este trabalho foi apoiado pelo Inserm, CNRS e Ligue Nationale contre le Câncer (Equipe labellisée).

1. Preparação de Linfócitos T <ol><li> Prepare primário do rato ou células T humanas, como descrito 10,11. </li><li> Cultivar células T humanas em meio RPMI completo com 10% de soro humano AB a uma densidade de 2 - 3 x 10 6 células / ml. NOTA: A utilização de soro fetal de vitelo (FCS) em vez de soro humano podem induzir a polarização espontânea de uma grande fracção de células T humanas em cultura. Manter essas células em cultura por 4-5 dias, e outro processo-los a qualquer momento durante esse período. </li><li> Manter as células T de rato em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS a uma densidade celular semelhante. Utilizar imediatamente ou no dia seguinte, depois de uma cultura D / N a 37 ° C na presença de 10 ng / ml IL7. </li><li> Cultivar a linha de células T humanas CEM em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS. </li></ol> 2. Chemokine Estimulação <ol><li> Lave 5 x 10 5 células por condição experimental em meio morno HBSS suplementado com 10 mM Hepes. Para algumas experiências, a co-transfecção de células T humanas primárias no dia anterior com 2 ug pmaxGFP e 8 ug pcDNA3.1 + (vector vazio, o controlo), PKCζ cinase morta, ou plasmídeos Par6 N-terminais. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em meio HBSS morno-Hepes (0,3 ml usar x número de condições experimentais). </li><li> Distribuir as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Portanto, um tubo que corresponde a uma condição experimental único irá conter 5 x 10 5 células em 0,3 mL de meio HBSS-Hepes. Para algumas experiências, adicionar 500 nM Latrunculin A ou veículo (DMSO) e incubar as células durante 30 minutos antes da estimulação de quimiocina. </li><li> Adiciona-se 10 a 500 ng / ml ou CCL19 quimiocina CXCL12 em cada tubo. NOTA: Normalmente, usamos 10-200 quimocina ng / ml para células T humanas. As células CEM não expressam o receptor CCR7 que se liga CCL19. Portanto, células CEM apenas será capaz de responder a um estímulo CXCL12. Além disso, usar concentrações mais elevadas de quimiocinas (300-500 ng / ml) para polarizar as células T do mouse. </li><li> Virar os tubos várias vezes e incubar num banho de água a 37 C para 8 ° ou 10 min para as células T primárias ou CEM, respectivamente. </li><li> Parar o processo de polarização através da adição a cada tubo 0,3 ml de uma solução quente contendo 2% de paraformaldeído (PFA) e Hepes 10 mM em PBS. Virar os tubos e incubá-las a 37 ° C durante 5 min. </li></ol> 3. colorações <ol><li> Transferem-se as células a partir dos tubos de microcentrífuga para tubos de citometria de fluxo. </li><li> Encher os tubos com uma solução completamente RT contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), EDTA 0,5 mM e Hepes 10 mM em PBS. </li><li> Centrifugar os tubos a 460 xg por 4 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 ul de uma solução contendo RT 5% de FCS em PBS. </li><li> Adicionar 5 uL de FITC-anti-HLA-ABC, em cada tubo, eles vórtice, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, longe da luz. </li><li> Lave as células uma vez com PBS contendo 5% de FCS, umnd uma vez com apenas PBS. </li><li> À RT: adicionar 500 uL de 1% de PFA, incubar durante 10 min, em seguida, lavar as células com uma solução contendo 1% de BSA, EDTA 0,5 mM e HEPES 10 mM em PBS. </li><li> Rejeitar o sobrenadante, preencher completamente os tubos com uma solução de PBS contendo 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM e Hepes 10 mM (tampão de permeabilização). </li><li> Lavar as células duas vezes neste meio. </li><li> Virar os tubos para remover o meio e vortex-los para dissociar o sedimento celular. </li><li> Adicionar 0,25 g / ml TRITC-faloidina e / ou uma diluição 1: 100 de anticorpo anti-P-MTC a cada tubo, eles vórtice e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com o tampão de permeabilização. Incubar com anticorpo secundário fluorescente, se necessário. </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de PBS e transferi-las para tubos de microcentrífuga. NOTA: As células estão prontos para a aquisição. Alternativamente, ao mesmo tempo mantendo um volume máximo total de 200 ul por tubo, adicionar PFA concentrada para um final de 1%concentração, a fim de preservar as colorações se as células não estão a ser usados ​​no mesmo dia para processamento adicional. </li></ol> 4. Imagens de Aquisição e Análise <ol><li> Ligue o aparelho (ver Tabela de Specific Reagentes / Equipment) e deixá-lo calibrar-se de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: O software INSPIRE foi usado com uma objetiva de 40X (0,75 NA). O software IDEIAS 3.0 foi utilizado para todas as quantificações relatados. </li><li> Preparar uma série de janelas de aquisição que podem ser salvos em um modelo para futuras experiências. Empate histogramas que quantifiquem os valores de gradiente RMS. Da população &quot;In Focus&quot;, selecionado no RMS histograma degradê, delimitar a população &quot;célula Single&quot; em um histograma da Area. Uma vez que o tubo de microcentrifugadora foi inserido na máquina, ajustar a potência do laser, portão em células individuais e adquirir 5.000 linfócitos T. </li><li> Nos Idéias suavesware, abra o arquivo de aquisição e criar um histograma que irá mostrar o valor do valor RMS gradiente de campo para imagens brilhantes (Canal 1) obtidos para cada célula individual. Desenhe um portão no histograma gradiente RMS que considera células exibindo RMS valor inclinação acima de 57. NOTA: O gradiente RMS permite ter em conta na análise apenas os linfócitos T que se encontram no plano focal. Determinou-se empiricamente que as células individuais que exibem um valor de gradiente de RMS são superiores a 57 no plano focal, e pode ser considerado com precisão. </li><li> No menu Análise / Máscaras, criar uma nova máscara, chamado Erode (M01,2) da máscara de morfologia nas imagens brightfield M01, erodidas de 2 pixels. Em seguida, na Análise / menu Recursos, crie um novo recurso do Espaço, calculado sobre a máscara Erode (M01,2). A partir das células selecionadas na porta anterior, abra um histograma mostrando a área de células usando essa máscara recém-criado. Máscaras a morfologia que estão disponíveis por: NOTAdefault são muito maiores do que o tamanho real da célula. Assim, é mais preciso que a corroer-se a 2 pixels. </li><li> Desenhe um portão nas células T individuais, excluindo as contas de calibração e detritos (pequena área) e as dobletos (grande área). Ajuste este portão em cada aquisição. NOTA: As variações no tamanho das células irá afectar a posição da porta. Como células T de rato são menores do que as células T humanas que são eles próprios menores que as células CEM, a área de cada tipo de célula será proporcional ao seu tamanho. </li><li> Considerando-se as células, em foco individuais que foram fechados com os passos anteriores, abrir um gráfico de pontos que consiste em bruto o pixel máximo na coloração de HLA-ABC (canal 2, o eixo x) em função do pixel em bruto Max a faloidina coloração (Channel 4, o eixo y). Criar um portão para excluir os eventos fluorescentes não coradas ou saturadas. Abra duas histogramas mostram a Raw Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) e phalloidin (Channel 4) colorações. </li><li> Na Análise / menu de Máscaras, createA nova máscara, chamado Erode (M02,2) da máscara morfologia das células HLA-ABC coradas (Canal 2), erodidas de 2 pixels. Em seguida, na Análise / menu Funções, criar uma nova característica que consiste no parâmetro circularidade, calculado sobre o Corrmoa (M02,2). NOTA: Este parâmetro mede o desvio da forma da célula a partir de um círculo. Portanto, uma célula T perfeitamente redonda terá um valor alto circularidade enquanto que as células polarizadas alongadas irá apresentar um baixo índice de circularidade. </li><li> Subsequentemente, criar um outro histograma que irá reportar os valores da característica circularidade das células previamente fechadas. Utilizar esta histograma para traçar directamente a distribuição de um indivíduo, a população de células em foco de acordo com o valor da circularidade para cada célula individual. </li><li> Olhando para o formato do histograma para células não estimuladas, para desenhar um portão células polarizadas, começando no valor circularidade mais baixo até ao valor limite circularidade onde a maioria das células não estimuladassão traçados. Olhe para a exibição de estatísticas para a percentagem de células polarizadas entre a população fechado (% fechado). NOTA: Criámos esta porta para valores de índice Circularidade abaixo 13. </li><li> De forma a olhar para a polarização da coloração de actina nas células, para traçar um histograma do detalhe brilhante valor Similaridade R3, comparando a coloração de HLA-ABC (canal 2) e a coloração com faloidina (Canal 4). NOTA: Quanto maior o valor desse recurso, o mais sobrepor as duas colorações são. </li><li> Utilizando a mesma estratégia gating como antes, traçar uma porta em que as células não-estimuladas para a coloração segregada que mostra a percentagem de células com coloração de actina polarizada. </li><li> Quando concluída, a percentagem de células que manifestam uma segregação na distribuição do MHC de Classe I e colorações faloidina, a percentagem de células polarizadas em conjunto com os valores médios dos índices Circularidade e similaridade de todas as células ± desvio padrão são mostrados na correspEstatísticas onding painéis. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Usando uma tecnologia recente de citometria de fluxo de imagem, uma estratégia de propagação rápida e informativo para analisar eventos celulares e moleculares induzidos por estimulação de quimiocina é apresentado. A partir de uma única experiência, pode obter-se dois tipos principais de informação: as alterações na morfologia celular induzida por estimulação de quimiocina e a distribuição subcelular de proteínas diferentes durante o processo de polarização. Curiosamente, os dados também é fornecida para a possibilidade...

As quimiocinas são proteínas solúveis pequenos que atraem as células para locais especializados 1. Portanto, eles participam do posicionamento correto de células em tecidos, uma função crucial no desenvolvimento e fisiologia. O sistema imunológico não é excepção a esta regra, uma vez que conta com a ação de muitos tipos diferentes de células que agem em conjunto para montar uma resposta imune eficaz. Ao controlar o local específico de um tipo de célula imune em um determinado estado, as quimiocinas são pré-requerida antes de antigénios estranhos pode ser detectada e neutralizada. Para os linfócitos T, em particular, as quimiocinas se ligam a receptores específicos da superfície que, mediante acoplamento, provocam diversos sinais intracelulares (subida de cálcio, de fosforilação de ERK, activação as Rho GTPases, aumento da afinidade e integrinas alterações do citoesqueleto), que favorecem a motilidade de células T 2,3. Ao nível celular, pode-se observar alterações morfológicas induzidas por estimulação de quimiocinas.Essas mudanças nas formas celulares são especialmente dramática nas células T: células T em repouso têm uma morfologia Conta redonda semelhante ao viajar na corrente sanguínea. No entanto, a detecção da presença de quimiocinas em locais inflamatórios ou na proximidade dos órgãos linfóides vai alterar a forma das células T, que agora adoptar um típico &quot;mão-espelho&quot; morfologia que consiste de uma forma bipolar: um bordo de ataque na frente e um bordo de fuga, ou uropod, na parte de trás 4. Além disso, os componentes intracelulares pode separar em duas regiões opostas de uma célula T polarizada para sustentar a migração. Por exemplo, aumentos de filamentos de actina mediante polimerização de quimiocina estimulação 5 actina polimerizada e acumula-se na parte da frente de uma célula T polarizada 2. Por outro lado, diversas proteínas, tais como proteínas fosforiladas da família Ezrin-radixina-moesina (ERM) que ligam a membrana plasmática para o citoesqueleto de actina F cortical, re-localizar no uropod de polarizadaAs células T 6. Curiosamente, e outros mostraram que este processo de polarização é necessária para a migração de células T. Com efeito, qualquer tratamento que interfere com polarização irá inibir a motilidade celular. Por exemplo, a inibição da actividade dos membros da proteína atípica quinases C (PKC) da família, e PKCζ PKCι blocos t polarização celular e seu processo de digitalização migratório das células dendríticas 7. T polarização celular também é regulada por GTPases Rho. Mostrámos que a modulação da actividade da proteína RhoA por Fam65b recentemente descrito interfere com mudanças na morfologia das células T e a sua capacidade para migrar em um ensaio Transwell 6. Como polarização é um passo de pré-requisito para a motilidade celular, é, portanto, essencial para ser capaz de quantificar, como um visor principal de respostas de quimiocina. Alterações forma da célula foram previamente avaliados manualmente 8. No entanto, este tipo de quantificação é muito demorado, de modo que normalmente apenas algunsdezenas de células são tomadas em consideração. Aqui, um novo método é apresentado para quantificar rapidamente o grau de alterações de forma dos linfócitos T expostos ao estímulo de quimiocina. Um fluxo de citometria de tecnologia de imagem (ver Tabela de Reagentes Específico / Equipamento) é utilizada, a qual combina as vantagens de um citómetro de fluxo e um microscópio 9 para quantificar eficazmente a quantidade de células polarizadas em diferentes condições de estimulação de quimiocina. Para além da quantificação das alterações morfológicas que se pode medir de forma robusta com esta tecnologia, é também possível avaliar as alterações na localização subcelular de algumas proteínas mediante a sinalização da quimiocina.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Soro humano AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pré-aqueça para inativar o complemento.</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pré-aqueça para inativar o complemento.</td></tr><tr><td>Kit de nucleofator de células T humanas</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>As alíquotas são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células.</td></tr><tr>As alíquotas <td>humanas CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células.</td></tr><tr>As alíquotas <td>humanas CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>são descongeladas no gelo antes de adicionar a quimiocina às células. Esta quimiocina também pode ser usada em células T de camundongo.</td></tr><tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td> <td>PFA</td><td>157-8-100</td><td>Esta é uma solução de PFA a 8% em água. Misture volume a volume com 2x PBS para obter uma solução de PFA a 4% em PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC anticorpo</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM anticorpo</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise rápida e robusta de celular e molecular polarização induzida por chemokine signaling

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

As células respondem a quimioquinas estimulação por perder a sua forma redonda num processo chamado de polarização, e alterando a localização subcelular de muitas proteínas. Técnicas de imagem clássicos têm sido usados ​​para estudar esses fenômenos. No entanto, eles requerida a aquisição Manual de muitas células seguido de quantificação demorado da morfologia e a co-localização da coloração de dezenas de células. Aqui, um método rápido e eficaz é descrito para estudar estes fenómenos em amostras que consistem em vários milhares de células, utilizando um fluxo de imagens de citometria tecnologia que combina as vantagens de um microscópio com as de um citómetro. Usando os linfócitos T estimulados com CCL19 e coloração para moléculas de MHC de Classe I e a actina filamentosa, uma estratégia de propagação é apresentada para medir simultaneamente o grau de alterações de forma e a dimensão da co-localização de marcadores que são afectadas pela sinalização CCL19. Além disso, esta estratégia gating nos permitiu observoe a segregação de actina filamentosa (na frente) e fosforilada proteínas Ezrin-radixina-moesin (fosfo-ERM) (na parte traseira) em células T polarizadas após a estimulação CXCL12. Esta técnica também foi útil para observar o efeito de bloqueio em polarização de dois elementos diferentes: a inibição da polimerização da actina por um inibidor farmacológico e expressão de mutantes do Par6 / atípica via de sinalização PKC. Assim, a prova é mostrado que esta técnica é útil para analisar as duas alterações morfológicas e redistribuições de proteína.

O primeiro exemplo aqui escolhido se refere à utilização de linfócitos T primárias humanas estimuladas com CCL19. No entanto, a mesma estratégia pode ser usada com células T de rato primário, linhas de células T ou qualquer outro tipo de células responsivas à estimulação da quimiocina. A estratégia de gating aqui apresentado inclui uma série de janelas que selecionam os eventos temáticos, em seguida, as células individuais. Finalmente, o intervalo de intensidade de fluorescência é seguido aqui como um exemplo de dois ma...

A sinalização de quimiocinas provoca alterações marcantes na morfologia celular e algumas redistribuições importantes de proteínas intracelulares. Aqui, um protocolo rápido e detalhado é fornecido para estudar esses eventos.

Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

O objetivo do procedimento a seguir é quantificar rápida e automaticamente as mudanças na morfologia celular e a localização subcelular de proteínas específicas de interesse em um grande número de células em resposta a um estímulo específico. Isso é feito estimulando primeiro as células T com os tipos de quimioterapia de interesse. Na segunda etapa, as células são marcadas com fluorescência e depois analisadas por citometria de fluxo de imagem.Na etapa final, o número de linfócitos morfologicamente polarizados e a quantidade de segregação dos marcadores fluorescentes podem ser avaliados com base na localização e na intensidade dos pixels para cada coloração, dependendo da máscara escolhida. Em última análise, essa tecnologia de citometria de fluxo de imagem pode ser usada para quantificar de forma rápida e robusta as alterações morfológicas dos linfócitos após a estimulação com quimiocinas, bem como a localização de proteínas específicas de interesse dentro das células polarizadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia, é que um grande número de células pode ser processado repetidamente e analisado automaticamente, garantindo uma análise estatisticamente forte das mudanças morfológicas e da distribuição de proteínas.Nos linfócitos T estimulados por quimiocinas, a estimulação do tipo Boche das células T começa lavando cinco vezes o centro das cinco células por condição experimental em HBSS quente suplementado com 10 HEPs milimolares centrifuga por cinco minutos a 340 vezes G.At temperatura ambiente, remova o supinato e ressuspenda os pellets em 0,3 mililitros de HBSS quente por peça por tubo. Em seguida, transfira as suspensões celulares para tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 10 a 500 nanogramas por mililitro de quimiocina a cada tubo e, em seguida, vire os tubos várias vezes para misturar.Incube as células em banho-maria a 37 graus Celsius. Após oito a 10 minutos, pare a polarização com 0,3 mililitros de paraldeído quente a 2% suplementado com 10 milimolares. Ele ervilhas.Em seguida, misture os tubos com mais inversão e incube-os por mais cinco minutos a 37 graus Celsius para corar as células para análise de imunofluorescência. Em seguida, transfira as células T estimuladas para os tubos de citometria de fluxo correspondentes. Encha os tubos completamente com tampão de coloração.Em seguida, gire as células e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de soro de bezerro fetal a 5% em PBS. Agora adicione cinco microlitros de ZI N-T-H-L-A-A-B-C a cada tubo. Vortice-os e incube as células por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro no final da incubação.Lave as células duas vezes e depois incube-as em 500 microlitros de formaldeído a 1% para. Após 10 minutos, lave as células em mais tampão de coloração e, em seguida, encha os tubos completamente com tampão de permeação. Depois de lavar as células duas vezes no tampão de permeação, deixei os tubos removerem o supinado e, em seguida, os vórtices para dissociar os grânulos celulares.Agora corar as amostras com ponto zero 25 microgramas por mililitro, trixi para lombo, vórtice e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Então, no final do período de incubação, lave as células em tampão de permeação. Mais uma vez, resus.Suspenda os pellets em 200 microlitros de PBS e, em seguida, transfira as células para tubos de microcentrífuga individuais para determinar a porcentagem de células T polarizadas após a estimulação da quimiocina. Primeiro ligue o citômetro de fluxo de imagem e deixe-o calibrar de acordo com as instruções do fabricante. Desenhe histogramas que quantificam os valores de gradiente RMS da população em foco selecionada no gradiente RMS.O histograma delineia a população de células únicas em um histograma da área, uma vez que o tubo de microcentrífuga foi inserido na máquina, ajusta a marcha de potência do laser em células individuais e adquire 5.000 linfócitos T. No software de análise de ideias. Abra os arquivos adquiridos e crie um histograma mostrando o valor RMS do gradiente para as imagens de campo claro obtidas para cada célula individual, desenhando uma porta nas células, exibindo um valor de gradiente RMS acima de 57.No menu de análise, crie uma nova máscara chamada erosão M1 dois da máscara de morfologia nas imagens de campo claro M zero um erodido de dois pixels. Em seguida, no menu de recursos de análise, crie um novo recurso da área calculada na máscara de erosão M1 duas a partir das células criadas na porta anterior. Abra um histograma mostrando a área das células Usando esta máscara recém-criada, desenhe uma porta nas células T individuais, excluindo as esferas de calibração e detritos na área pequena, bem como os gibões na área grande.Em seguida, abra a. bot consistindo no máximo bruto na coloração H-L-A-A-B-C em função do pixel máximo bruto na coloração Phin no menu de máscaras de análise traseiro para nova máscara chamada erosão M dois dois da máscara morfológica das células de coloração H-L-A-A-B-C erodidas de dois pixels. Em seguida, no menu de recursos de análise, crie um novo recurso que consiste no parâmetro de circularidade calculado na erosão M dois dois.Em seguida, crie outro histograma para relatar os valores do recurso de circularidade das células previamente fechadas. Em seguida, olhando para a forma do histograma para as células não estimuladas, ágata RO para as células polarizadas, começando no valor de circularidade mais baixo até o valor limite de circularidade, onde a maioria das células não estimuladas são plotadas para avaliar a polarização da coloração de actina dentro das células. Além de um histograma para a semelhança de detalhes brilhantes, R três valor para comparar o H-L-A-A-B-C e o foid na coloração.Em seguida, usando a mesma estratégia de gating que acabamos de demonstrar, além de um GA nas células não estimuladas para a coloração segregada não colocalizada. O painel de estatísticas mostra a porcentagem de células T com coloração de actina polarizada aqui. Exemplos de linfócitos T estimulados por CCL 19 que caem na porta das células não polarizadas ou polarizadas são mostrados.Diferenças na morfologia entre as duas subpopulações podem ser claramente observadas. A estratégia de gating recém-demonstrada também pode ser usada para traçar a porcentagem de células que caem na porta polarizada na ausência de presença de CCL 19. Como esperado, está claro que a estimulação com quimiocinas aumenta a porcentagem de células T polarizadas.O índice médio de circularidade de toda a população celular obtido em ambas as condições também pode ser plotado. De fato, a estimulação CCL 19 provoca uma queda nesse índice. No entanto, como apenas metade das células é polarizada, a mudança no índice de circularidade médio observada na estimulação do CCL 19 é pequena.Neste experimento, as células T foram seccionadas com GFP juntamente com plasmídeos que codificam para os mutantes negativos dominantes do complexo de polaridade par seis. PKC zeta. O histograma para as células não transfectadas permitiu um gating específico para as células T positivas para GFP relevantes, indicando que uma pequena fração de toda a população de células foi transfectada.O grau de polarização morfológica dessas células transfectadas foi então quantificado medindo apenas o índice de circularidade das células GFP positivas e uma marcha adicional para as células T. Exibindo baixos valores de circularidade foi criado para estimar a porcentagem de células polarizadas em cada condição tomada. Juntos, esses dados demonstram que a interrupção da função do par seis PK CZ na via de sinalização inibe a polarização das células T induzida pelas quimiocinas CCL 19 e c Xcl 12.Em linha com descobertas anteriores. Ao tentar este procedimento, é muito importante trabalhar sempre a 37 graus Celsius durante toda a etapa de estimulação da solução e a fixação seguinte para garantir uma polarização morfológica forte e confiável dos linfócitos.

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Este vídeo demonstra o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos usando um método all-on-chip. O método permite o isolamento direto de neutrófilos do sangue total por seleção imunomagnética negativa seguida de ensaio de quimiotaxia em um chip microfluídico.

Um método baseado em chip microfluídico para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos usando sangue total

Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.

Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Aprenda a quantificar mudanças morfológicas em linfócitos T após estimulação por quimiocinas usando citometria de fluxo por imagem. Este método permite análise rápida e robusta da localização proteica em grandes populações celulares.

Análise rápida e robusta de Celular e Molecular Polarização Induzida por Chemokine Signaling

Explorar mais vídeos