Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

O objetivo geral deste procedimento é descrever em detalhes um modelo de contusão de lesão medular em camundongos, seguido por um transplante de células-tronco neurais. Isso é feito primeiro rotulando post-mortem, células precursoras neurais ou NPCs PM com o traçador vital PKH 26. Em seguida, uma incisão dorsal é feita no camundongo e a medula espinhal é exposta.

Em seguida, um dispositivo de horizonte infinito ou impactor IH é usado para criar uma lesão na medula espinhal. Finalmente, o PM e os PCs rotulados com PKH 26 são injetados na veia da cauda do mouse. Em última análise, o destino do PKH 20 enxertado às 18:00 e dos PCs no local da lesão é seguido.

O modelo de lesão replica o homem com lesão medular. A lesão mecânica primária é seguida por degeneração secundária progressiva, onde o tratamento celular e farmacológico são estudados. As aplicações descritas podem fornecer uma base metodológica para obter mais insights sobre a fé.

Indução de células-tronco transplantadas para a medula espinhal durante a degeneração e eventos inflamatórios. Demonstrando a lesão estará o Dr. Tony Laja Longo, aluno de doutorado no laboratório. Enquanto a injeção da cauda será realizada pelo Dr.Ache, que é um pós-doutorado no laboratório, começando com células-tronco neurais que atendem aos critérios descritos no protocolo de texto.

Resus suspende as células a uma concentração de um vezes 10 elevado a seis células por 150 microlitros. Prepare pelo menos 1,2 vezes 10 elevado a seis células por camundongo para ter células suficientes para carregar a pipeta. Com meio de células-tronco neurais, lave as células três vezes em um frasco cônico de 10 mililitros, girando a 500 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente para peletar as células.

Após cada lavagem, antes da contagem final de centrifugação, as células aspiram o sobrenadante, deixando cerca de 25 microlitros de líquido para evitar a aspiração de células. Em seguida, prepare uma suspensão de dois X adicionando um mililitro de diluente C ao palato celular e use uma pipetagem suave para ressuspendê-lo imediatamente. Antes da coloração, prepare uma solução de corante dois x no diluente C adicionando quatro microlitros da solução de etanol D PKH 26 a um mililitro de diluente C em um tubo e misture bem.

Para dispersar rapidamente, adicione a suspensão de um mililitro de duas células x a um mililitro de solução de dois XD e misture imediatamente a amostra por pipetagem. Depois de incubar a suspensão da matriz celular por um a cinco minutos, pare a coloração adicionando um volume igual de solução de 1% BSA em HBSS e incube por um minuto. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes G durante 10 minutos e retire cuidadosamente o sobrenadante.

Use 10 mililitros de meio completo para ressuspender o pellet celular para avaliação da recuperação celular, viabilidade celular e intensidade de fluorescência. Centrifugar as células, descartar o sobrenadante e adicionar 10 mililitros de HBSS ao pellet da célula. Lave duas vezes com HBSS e ressuspenda as células em uma solução fisiológica estéril.

Após o preparo da área cirúrgica e um camundongo de acordo com o protocolo de texto, colocar o lado dorsal do animal para cima em um aquecedor de lâminas para evitar hipotermia durante a cirurgia com bisturi, fazer uma incisão vertical sobre a região de interesse de T sete a T 12 usando pinça. Segure a pele e a almofada de gordura superficial encontrada entre o espaço entre o quinto e o sexto processos torácicos sob um microscópio estéreo. Conte o processo sob o vaso sanguíneo como T seis e, em seguida, passe para T sete.

Em seguida, coloque um pequeno rolamento sob o lado ventral do mouse para aumentar a curvatura da coluna e use uma pinça para bloquear a coluna e imobilizá-la. Em seguida, use um bisturi para cortar o parágrafo dos músculos vertebrais bilateralmente de T sete a T 10 no nível vertebral até que a superfície dorsal da lâmina entre em contato com a ponta do bisturi. Em seguida, use um bisturi para marcar a junção de T sete a T 10 no nível vertebral até que a superfície dorsal da lâmina entre em contato com a parada da ponta do bisturi no espaço entre as minúsculas saliências T oito e T nove.

Em seguida, use uma microtesoura para cortar o tecido entre T oito e T nove e T nove e T 10. Agora use o rongeur para remover o processo T nove. Exponha a junção usando uma microtesoura para raspar cuidadosamente a camada muscular.

Continue até que o osso esteja exposto. Use uma pinça para remover os músculos da lâmina e abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Em seguida, insira suavemente a microtesoura sob o osso.

Corte a lâmina em ambos os lados e use a pinça para removê-la, expondo o cordão. Use o ron jour para remover quaisquer fragmentos ósseos livres ou irregulares que sejam deixados para trás. Em seguida, remova a metade superior do processo dorsal T nove.

Após seguir o protocolo do dispositivo de impacto IH, de acordo com as orientações do texto, use quatro pontos absorvíveis para fechar a incisão, cobrindo primeiro a medula espinhal exposta no local da lâmina removida. Tomando cuidado para não beliscar os músculos subjacentes. Use dois ou três clipes reflexos para fechar a pele.

Injete dois mililitros de solução salina na parte inferior das costas por via subcutânea e coloque o mouse em uma gaiola pré-aquecida em uma almofada de aquecimento para se recuperar. Para realizar uma injeção de células na veia da cauda. Ressuspenda as células no tubo de ensaio e carregue 75 microlitros em uma seringa de 0,3 mililitro, garantindo que não haja bolhas na suspensão celular.

Para evitar a sedimentação celular, mantenha a seringa na posição horizontal. Coloque o mouse embaixo da lâmpada de calor para dilatar as veias da cauda. Em seguida, puxe suavemente o mouse para dentro da contenção para visualizar a veia lateral da cauda, que aparece como uma linha azul estreita.

Use um cotonete embebido em álcool para limpar a cauda e, assim que a veia for visualizada, segure a veia da cauda entre o dedo médio e o polegar da mão esquerda. A contusão T nove demonstrada neste vídeo causou a perda transitória da função dos membros posteriores três vezes 10 para as quintas células ou PBS foram injetadas na veia da cauda em três injeções realizadas 30 minutos, seis horas e 18 horas após a lesão. Como mostrado aqui, dentro de duas a três semanas, o PBS tratado ferido, os camundongos melhoraram e a função dos membros posteriores atingiu três pontos da escama basal do camundongo ou camundongos BMS tratados com PM.NPCs, no entanto, mostraram uma recuperação maior e atingiram 4,5 pontos de BMS como visto aqui, a maioria dos NPCs pm enxertados marcados com PKH 26, acumulados nas bordas da lesão formando aglomerados.

Logo após a administração, as células transplantadas migraram ao longo das bordas da lesão e de forma mais difusa, onde se diferenciaram em neurônios. Aos 30 dias após a lesão e o transplante, o corpo celular dos NPCs pm aumentou de tamanho e na maioria das células, os processos semelhantes aos dendríticos eram óbvios e totalmente imunocorados pelos anticorpos específicos para mapear para Ao obter este procedimento profissional, é importante lembrar que forças mais altas podem aumentar a mortalidade no animal devido a lesões mais graves. Assim, sugerimos usar nosso paradigma de paradigma de lesão que é seguido por um processo de recuperação mais reprodutível.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter um modelo experimental reproduzível de lesão traumática da medula espinhal no camundongo usando o impactador de horizonte infinito.