Uso de Nucleotídeos stopped-flow de fluorescência e rotulados para analisar o ciclo de rotatividade ATP de cinesinas

O objetivo geral deste procedimento é medir a cinética de ligação e dissociação de nucleotídeos durante o ciclo de renovação de A TP de uma cinesina. Isso é feito preparando primeiro a proteína cinesina, livre de nucleotídeos ou carregada com nucleotídeo marcado com fluorescência. Em seguida, a cinesina preparada é misturada com nucleotídeo usando um fluorímetro de fluxo interrompido e a mudança na fluorescência associada à ligação ou dissociação do nucleotídeo marcado com fluorescência é observada.

Em seguida, a mudança na fluorescência é ajustada a uma função exponencial para obter uma constante de taxa. Finalmente, as constantes de taxa medidas são devolvidas e as constantes de taxa são atribuídas a transições específicas do ciclo de rotatividade A TP. Em última análise, a combinação de nucleotídeo marcado com fluorescência e fluorescência de fluxo interrompido é usada para medir a cinética de ligação e dissociação de nucleotídeos.

CIN: Demonstrando o procedimento estarão Jennifer Patel, pós-doutorada, e Hannah Belch, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Depois de determinar a intensidade de fluorescência da cinesina após a ligação do nucleotídeo marcado com o homem, conforme descrito no protocolo de texto, a uma solução de até 20 cinesinas micromolares em tampão livre de magnésio a um milimolar de EDTA e um milimolar de DTT, incubar a solução por 15 minutos a 25 graus Celsius, configurar uma coluna de filtragem de gel G 25 SX de fluxo por gravidade e equilibrar com pelo menos três volumes de coluna de um magnésio livre buffer. Em seguida, carregue a solução de essina na coluna para separar os nucleotídeos livres e o EDTA da cinesina.

Reparar um tubo de colheita adicionando um volume de solução de cloreto de magnésio a 100 milimolares ao tubo vazio, de modo a que a concentração final de cloreto de magnésio seja de um milimolar. Após a coleta da solução de cinesina, usando um tampão livre de magnésio apropriado, elua rapidamente a cinesina. A presença de cloreto de magnésio no tubo de coleta ajuda a estabilizar a cinesina imediatamente após Ian da coluna, armazenar a cinesina no gelo e usar dentro de uma a duas horas.

Enquanto isso, prepare para um homem uma série de concentração TP. Escolha a faixa de concentrações de acordo com a concentração disponível de cinesina. Para cada concentração de mant, um TP prepare uma concentração adequada de cinesina de modo que o nucleotídeo marcado pelo homem tenha um excesso molar de cinco a dez vezes mais sobre os locais de ligação do nucleotídeo da cinesina.

Defina o comprimento de onda de excitação no fluorímetro de fluxo parado em 365 nanômetros e o comprimento de onda de emissão acima de 400 nanômetros com um filtro passa-longo. Em seguida, começando com a concentração mais baixa de Manta TP, use o fluorímetro de fluxo parado para misturar o manta TP e a cinesina livre de nucleotídeos em uma proporção de volume para volume de um para um. Usando a fórmula a seguir, ajuste a mudança na medida de intensidade de fluorescência para ensinar a concentração de mant A TP a uma função exponencial, mais uma linha de inclinação negativa constante para explicar o fotobranqueamento do grupo mant.

A partir desses ajustes, determine uma constante de taxa em cada concentração de mant. Um TP então devolve as taxas de associação e dissociação usando fio dental contra a concentração de mant. A TP Em seguida, ajuste esses dados a uma função linear para obter o gradiente e a interceptação do eixo y.

O gradiente representa a constante de taxa para man uma associação TP com unidades por molar por segundo. A interceptação representa a constante da taxa de dissociação com as unidades por segundo. Para medir a taxa de dissociação, fermentar constantemente um DP para uma solução de dois cinesina micromolar em um tampão adequado a 50.

Micromolar significava uma incubadora DP de 25 graus Celsius por 30 minutos. Depois de usar uma coluna G 25 Sedex para remover fre mant, A DP da cinesina, carregada com mant A DP, e definir o fluter de parada de fluxo conforme descrito anteriormente neste vídeo, use o fluxo interrompido para misturar o complexo mant A DP Kinine com um excesso molar de 50 vezes ou mais de A TP não rotulado em um ajuste de proporção de volume para volume de um para um. A diminuição da intensidade de fluorescência observada ao longo do tempo para uma única função exponencial, além de uma linha de inclinação negativa constante para permitir o fotobranqueamento do grupo.

O kops determinado a partir deste ajuste é a constante de taxa para dissociação de mant A DP com unidades de por segundo. A magnitude da mudança de sinal na ligação ou dissociação do nucleotídeo da madeira mantológica depende da cinesina específica. Portanto, é útil primeiro realizar medições de equilíbrio para confirmar a presença e a magnitude de uma mudança de intensidade fluorescente.

Espectros fluorescentes fermentam um TP e significam um DP tanto em solução quanto em complexo da cinesina M CAC são mostrados aqui. Esta figura mostra a reação que ocorre ao misturar o homem com um TP com cinesina livre de nucleotídeos. O aumento na intensidade de fluorescência que ocorre após a ligação do homem A TP ao M CAC é mostrado aqui, ajustando a constante de taxa em relação ao homem.

Uma concentração de TP para uma função linear, como visto aqui, permite a deconvolução da constante de taxa que contribui para kops e fornece a postura da taxa de associação e dissociação fermentar A TP. Esta figura mostra a diminuição da intensidade de fluorescência observada fermento A DP após a dissociação de M CEC, conforme ilustrado aqui. A constante de taxa para dissociação de mant A DP de Kinesin é determinada ajustando esses dados a uma função exponencial. Uma vez dominados, esses protocolos podem ser concluídos em menos de três horas.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a cinesina, ele também pode ser aplicado a outras proteínas de ligação a nucleotídeos, como miosina e proteínas G. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar nucleotídeos marcados com fluorescência e um medidor de vazão de parada para medir a cinética de ligação e dissociação de nucleotídeos para uma cinesina.