O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é rotular neurônios sensoriais olfativos in vivo para visualizar a morfologia e o desenvolvimento axonal. Isso é feito primeiro porando o dextrano acoplado ao flúor quatro em neurônios sensoriais olfativos únicos. O segundo passo é esperar 24 horas para permitir que o corante se espalhe para os processos axonais dos neurônios sensoriais.

Em seguida, um girino é anestesiado e uma pilha de imagens tridimensionais do bulbo olfatório é adquirida usando microscopia multifóton. A etapa final é examinar repetidamente o neurônio marcado no mesmo animal após intervalos de tempo especificados. Em última análise, a reconstrução da morfologia celular permite a visualização de mudanças na morfologia axonal.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como os axônios crescem em direção às regiões-alvo no prosencéfalo e como as sinapses são formadas. Antes do experimento. Certifique-se de que a configuração de eletroporação consiste em um microscópio estéreo com uma grande distância de trabalho e está equipada com iluminação fluorescente e conjuntos de filtros para o corante.

Usado para eletroporação, use uma eletroporação de célula única dedicada ou um gerador de pulso quadrado genérico conectado a um osciloscópio. Conecte as saídas de eletroporação a um porta-pipetas e a um eletrodo de banho. Certifique-se de que o porta-pipeta e o eletrodo de banho contenham fios de prata revestidos com uma fina camada de cloreto de prata.

Em seguida, monte o porta-pipetas em um micromanipulador para permitir um posicionamento preciso. Em seguida, fabricar as micropipetas para eletroporação com capilares de vidro de silicato bo com filamento interno. Defina os parâmetros da micropipeta polar para produzir uma haste mais longa e uma micropipeta de abertura de ponta menor com alta resistência à pipeta para eletroporação de célula única.

Em seguida, meça a resistência da pipeta diretamente com a célula única dedicada eletroporada. Neste procedimento, dissolver o dextrano acoplado ao flúor quatro na aneleira de rã a uma concentração de três milimolares. Divida esta solução de estoque em pequenas alíquotas e guarde a que será usada para uso futuro no freezer.

Em seguida, preencha a micropipeta com um a cinco microlitros de solução de dextrana. Agite cuidadosamente a micropipeta para remover as bolhas de ar residuais da ponta da pipeta. Em seguida, monte a micropipeta no suporte da pipeta.

Certifique-se de que o fio de prata dentro da pipeta esteja em contato com a solução de corante. Agora, coloque um pequeno pedaço de tecido em uma placa de Petri e cubra-o com uma pequena quantidade de água contendo 0,02% trica. Em seguida, anestesiar um girino pré-metamórfico na água contendo 0,02% trica.

Confirme a anestesia adequada tocando-a e certificando-se de que não responde. Em seguida, transfira cuidadosamente o girino para a placa de Petri coberta com tecido. Certifique-se de que o eletrodo esteja em contato com o tecido úmido e posicione a ponta da micropipeta perto do órgão olfatório do girino usando um micromanipulador.

Depois disso, penetre na pele que cobre o órgão olfatório. Com a ponta da pipeta, avance cautelosamente a ponta para a camada de neurônios sensoriais localizada centralmente do epitélio olfatório principal ou epitélio nasal MRO. Agora acione os pulsos de voltagem quadrada positiva para transferir o corante para os neurônios sensoriais aplicando um único pólo de voltagem ou trens de pulsos múltiplos.

Em seguida, visualize a extrusão e eletroporação de corante bem-sucedidas usando um microscópio estéreo de fluorescência. O corante se espalha rapidamente no corpo celular e nos dendritos após uma eletroporação bem-sucedida. Depois de repetir os procedimentos para o segundo órgão olfatório do girino, transfira o girino para um copo cheio de água doce para recuperação e permita que o corante eletroporado se espalhe para os neurônios sensoriais e o bulbo olfatório.

Pelo menos 24 horas após a eletroporação, anestesiar o girino na água contendo 0,02% trica. Em seguida, transfira cuidadosamente o girino para uma câmara de imagem. Corte um pequeno retângulo de uma tira de param.

Em seguida, cubra o girino com o parâmetro, deixando o céfalo da cauda anterior através da janela de recorte. Fixe o parapeito com agulhas no prato sem ferir o girino e certifique-se de que o girino esteja submerso em água suficiente contendo 0,02% Trica. Em seguida, monte a câmara de imagem no palco de um microscópio multifóton vertical ou de um microscópio confocal.

Adquira uma pilha tridimensional de imagens do bulbo olfatório e certifique-se de que o procedimento de imagem não exceda 10 a 15 minutos. Depois disso, retorne o girino à água normal em um tanque separado e evite que ele seja exposto à luz. Nesta imagem, quatro fitas de convés acopladas a diferentes quatro flúoras foram eletroporadas em quatro locais distantes do órgão olfatório, lateral indicado por verde, intermediário indicado por amarelo medial indicado por vermelho e o órgão nasal vômer indicado por laranja.

Isso permite a visualização do bulbo olfatório acessório e dos três principais campos de projeção do bulbo olfatório principal. Esta imagem mostra reconstruções tridimensionais de diferentes padrões de crescimento axonal de neurônios sensoriais olfatórios únicos sobrepostos à estrutura do bulbo olfatório, e aqui está um exemplo de um único axônio de neurônio sensorial olfatório projetando-se no bulbo olfatório e formando arborização tufada em glomerular esférico. Como visto aqui em Opus Levu, esses axônios se bifurcam regularmente antes de se conectarem a um, dois ou vários gmer.

Este é um exemplo representativo de um neurônio sensorial olfativo individual repetidamente investigado por imagens de lapso de tempo in vivo mostrando mudanças contínuas na morfologia axonal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular neurônios sensoriais olfativos por meio de eletroporação e como monitorar seu desenvolvimento usando imagens TimeLapse in vivo.