Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

O objetivo deste procedimento é transfectar ou rotular de forma rápida e eficiente regiões distintas de fatias organotípicas usando uma arma genética. Isso é feito preparando primeiro fatias organotípicas viáveis do cérebro ou de outros tecidos. O segundo passo é produzir DNA ou partículas de ouro decodificadas para entrega biótica.

Em seguida, a fatia organotípica é colocada sob um suporte de pistola de genes estabilizado e as partículas revestidas são disparadas no tecido ou transformação ou rotulagem episódica. A etapa final é observar ou analisar o efeito de genes heterólogos entregues às regiões isoladas. Em última análise, essa abordagem permite ao usuário transfectar com precisão regiões distintas das fatias de órgãos com vários genes heterólogos.

A principal vantagem desse método sobre os métodos existentes é que a biologística permite que o transfecto diferencie terminalmente as células, além de limitar o raio de ação a um pequeno diâmetro. Este método pode ajudar a entender as principais questões neurobiológicas, como entender a contribuição regional de um único gene. Comece este procedimento colocando um cérebro fresco em um pequeno molde receptor.

Cubra-o com a solução ARO, que foi chamada para um pouco acima da temperatura ambiente. Em seguida, resfrie rapidamente o molde a quatro graus Celsius, colocando-o no gelo. Quando o aros se apôs.

Após cinco a 10 minutos, remova o cérebro embutido em aros do molde. Depois disso, cole-o na plataforma do fatiador de fibro. Em seguida, transfira a plataforma para a câmara do fatiador Vibra contendo PBS estéril e gelado.

Após o corte, coloque delicadamente as fatias nas inserções de cultura de células em uma bandeja de seis poços com meios de cultura na parte externa da inserção. Incube-os em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Neste procedimento, prepare os nano projéteis usando partículas de ouro de 40 nanômetros de diâmetro, adicionando primeiro 50 microlitros de espermatozóides 0,05 molar e 10 microlitros de DNA a um miligrama por mililitro a 10 miligramas de partículas de ouro.

Em seguida, adicione cloreto de cálcio na mistura de solução para ajudar na ligação das moléculas de DNA às nanopartículas de ouro. Em seguida, coloque a solução no tubo com uma seringa. Coloque a tubulação na estação de preparação da tubulação.

Permita que as partículas de ouro se assentem. Em seguida, remova o supinado por aspiração Com uma seringa. Gire o tubo para espalhar uniformemente as partículas de ouro.

Em seguida, seque as partículas sob um fluxo constante de nitrogênio a cinco litros por minuto. Para criar balas de DNA, corte o tubo em pedaços de um centímetro usando um cortador de tubos. Em seguida, insira-os imediatamente no cartucho cultivado em genes ou mantenha-os dessecados a quatro graus Celsius até o uso em uma capela de fluxo de lâmina estéril, carregue o cartucho contendo o ouro revestido de DNA no suporte do cartucho.

Em seguida, carregue o suporte na pistola genética. Prenda o cano da arma genética modificada a ele usando uma pinça estéril. Coloque um filtro contendo uma fatia organotípica em um prato de plástico estéril.

Remova a mídia da fatia organotípica. Em seguida, defina a pressão do gás em 50 PSI usando o suporte. Coloque a arma genética a uma distância de 10 milímetros acima da região desejada da fatia para entrega genética.

Em seguida, mire cuidadosamente no centro do cano e dispare as partículas revestidas no tecido. Após a transfecção biótica, lave a fatia suavemente duas vezes com PBS. Em seguida, fixe a fatia incubando em 4% de PFA gelado em PBS por 20 minutos.

Depois disso, lave a fatia duas vezes em PBS. Novamente, corte suavemente a membrana da inserção usando um bisturi sem perturbar a fatia. Em seguida, coloque o suporte da membrana em uma lâmina de microscópio com uma pinça e deixe a fatia organotípica descansar sobre ela.

Em seguida, adicione uma gota de mídia de montagem na fatia. Coloque uma lamínula com cuidado, sem qualquer força diretamente em contato com o tecido. Em seguida, prenda a lamínula com uma fina camada de esmalte

Esta figura mostra a entrega biótica de DNA codificado por proteína fluorescente na fatia organotípica de um camundongo de seis semanas de idade. Como pode ser visto aqui, um neurônio do biquíni com um notável porto dendrítico encontrado na interface da camada do biquíni e da camada molecular do cerebelo mostra uma marcação pronunciada após a transfecção biótica transitória com a PEG. Aqui está uma ampliação maior dos dendritos com os espinhos, e aqui está uma célula parametálica encontrada na região ca um do hipocampo.

Após a entrega biótica da nanopartícula de ouro revestida com PDS Red FP Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em apenas algumas horas durante o período de três a quatro dias após este procedimento. Outros métodos, como a microscopia confocal, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como como certos neurônios estão conectados a regiões vizinhas.