Name: Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a técnica de biobalística regiosseletiva para manipulação genética de fatias organotípicas de cérebro usando gene gun modificado. Este método permite transfecção precisa de regiões específicas preservando características in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a oficina MRC-LMB para a produção do cano da arma gene reforçada. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. David R. Hampson na Universidade de Toronto para o uso de equipamentos e recursos.

A utilização de animais e tecidos de origem animal devem aderir estritamente a aprovação ética comitê sob regras e regulamentos locais. Todos os tecidos obtidos durante este estudo seguiram os critérios de experimentação animais do MRC-LMB. 1 Preparação de Materiais e Meios de Cultura <ol><li> Prepare todas as soluções que utilizam água Millipore; utilizar apenas reagentes de grau analítico. Preparar e armazenar todos os reagentes à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário). </li><li> Adicione 500 ml de solução salina tamponada com HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione 500 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS; de 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Esterilizar em autoclave. </li><li> Preparar meio neuronal, completando DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) com HEPES 25 mM, 10% de soro fetal de vitelo, 30 mM de glucose, 1: 100 N2 supplement, penicilina-estreptomicina 1100 U / ml; pH 7,2. Filtro com uma unidade de filtro estéril de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Faça solução de polivinilpirrolidona (PVP) de ações com 20 mg em 1 ml PVP 100% de etanol. Alíquota isso em 1 ml quantidades, congelar e armazenar a -20 ° C. A solução de trabalho é de 0,05 mg / ml, por conseguinte, adicionam-se 10 ul de solução de reserva de PVP a cada 4 ml de etanol a 100%. </li><li> Prepara-se uma solução de reserva 0,05 M, espermidina em água Millipore; ajustar o pH para 7,2. </li><li> Adicione uma solução de agarose a 2% em DMEM (2 g de agarose grau electroforese em 100 ml de DMEM em um frasco de tampa de rosca esterilizado). Microondas isso até que a agarose foi dissolvida. Guarde na geladeira a 4 ° C durante várias semanas, se necessário. </li></ol> 2 Preparação de Organotípicas Fatias <ol><li> Eutanásia C57 Preto 6 machos da idade desejada por asfixia com CO2, seguido por decapitação. Remover o cérebro usando cortes lateral do crânio, partindo do forame magno e terminando noos lobos olfativos. Suavemente elevar a partir da parte traseira do crânio para expor o cérebro. </li><li> Cortar entre os lóbulos olfactivas e o córtex frontal e rostral ao cerebelo. Suavemente elevar a porção rostral do cérebro e cortar os nervos ópticos. Por fim, retire o cérebro e colocá-lo em uma placa de petri preenchida com soro fisiológico gelado frio HEPES no gelo. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, retire a pia usando uma pinça fina; cuidadosamente remover meninges e vasos sanguíneos em torno do cérebro. </li><li> Coloque o cérebro fresco em um pequeno molde recipiente e cubra-o com a solução de agarose arrefecido a ligeiramente acima da RT. Em seguida, arrefecer rapidamente o molde a 4 ° C, colocando-o em gelo. NOTA: Processar os fatias tão rapidamente quanto possível para evitar a perda de viabilidade. </li><li> Quando a agarose foi definido (5 - 10 min), remoção do cérebro embebidas em agarose a partir do molde (guarnição se necessário) e, em seguida, cola-lo para a plataforma vibroslicer. Coloque isso em uma câmara vibroslicer contendo gelo estéril PBS frio. Disinfect a câmara vibroslicer antes de serem utilizados com etanol a 70% para minimizar as contaminações subsequentes. </li><li> Corte o cérebro usando um vibroslicer personalizado construído ou equivalente comercial. O conceito de modelo foi desenhar um fatiador de tecidos que podem gerar uma grande amplitude e alta frequência de movimentos horizontais para a aresta da lâmina, enquanto minimiza as vibrações verticais. </li><li> Utilizar a frequência de oscilação de 90 Hz, a uma amplitude de 1,5 - 2,0 mm, e a lâmina de corte posicionada num ângulo de 15 ° em relação ao plano horizontal; definir o bloco de montagem prende o cérebro embebidas em agarose a mover-se em 1,7 mm / min, para a lâmina. Recolhe secções (150 um) para um meio contendo gelo cultura câmara fria (DMEM Pen / Strep + 10% de FCS). Ver corte e manipulação das fatias de tecido como um vídeo complementar em Arsenault e O&#39;Brien 13. </li><li> Delicadamente, coloque as fatias em inserções de cultura de células (0,4 um, 30 milímetros de diâmetro) em uma bandeja 6 multi-bem com os med culturaIA no exterior do inserto, e incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: Para a viabilidade do tecido adequado, ser extremamente gentil ao transferir e manipular as fatias. Além disso, o excesso de fluido irá impedir que as fatias organotípicas de aderir à membrana do cartucho do filtro. Se isso acontecer, remova o excesso de fluido ou placa novamente. </li><li> Apesar de os cortes organotypic podem ser cultivadas por algumas semanas, prossiga para a transfecção, o mais tardar quatro dias após o plaqueamento para melhores rendimentos de transfecção. NOTA: Para evitar o crescimento excessivo da glia em condições de cultura de longo prazo, o uso AraC ou meio sem soro 2. </li></ol> 3 Preparação revestido de ADN Micro e Nano-projéteis <ol><li> Prepare nano-projéteis usando 40 nm partículas de ouro diâmetro. Resumidamente, adicionar 50 ul de espermidina 0,05 M, e 10 uL de ADN a 1 mg / ml (pEYFP-N1) e 10 mg de partículas de ouro. <ol><li> Adicionar cálcio e espermidina no mix de soluçãotura durante ADN micro-partículas de ouro de preparação, a fim de auxiliar a ligação de moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro. NOTA: A quantidade de DNA usada por mg de ouro transportadoras (DLR), deve situar-se entre 1 e 5 ug de ADN por mg de ouro 1. Além disso, a quantidade de partículas de ouro transportadoras que vai ser disparado por cartucho (MLQ), em si deve variar de 0,1 a 0,5 mg de ouro. O DLR e MLQ devem ser julgados e otimizado para cada usuário, dependendo do sistema particular sob investigação, bem como o tipo de partícula e gene arma usada. </li></ol></li><li> Misturar utilizando um vórtice enquanto se adicionavam lentamente 50 mL de 1 M de CaCl2 em fracções de 10 - 15 mL. Após 5 min de vórtex ocasional, centrifugar a 1000 xg por 30 segundos, em seguida, remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de partículas de ouro em 3,5 ml de 0,075 M de PVP. </li><li> Desenhar desta suspensão em tubos (diâmetro interno 2,36 milímetros), utilizando uma seringa. Coloque o tubo na estação de preparação de tubulação. Permitir que opartículas de ouro para assentar e remover o sobrenadante por aspiração com uma seringa. Girar o tubo de espalhar uniformemente as partículas de ouro, que foram subsequentemente secas sob uma corrente de azoto constante de 5 L por min. </li><li> Para criar ADN balas, cortar o tubo usando um cortador de tubos em um centímetro de comprimento. Ou imediatamente inserir no interior do cartucho de pistola de genes ou manter desidratado (4 ° C), até ser necessário. </li></ol> 4. Biolistic transfecção em Organotípicas Fatias <ol><li> Execute as seguintes etapas dentro de uma capela de fluxo laminar estéril. </li><li> Insira uma bateria de 9 V e um suporte de cartucho vazio na arma gene Helios. </li><li> Fixe a pistola de genes para o tanque de hélio, com a mangueira de hélio. Fogo 2-3 espaços em branco (espaços vazios) a 50 psi para pressurizar o tubo de hélio e os reservatórios da arma. </li><li> Carregar os cartuchos contendo o ouro revestido de ADN dentro dos suportes de cartucho e carregar o suporte na pistola de genes. </li><li> Desaperte o gene gun espaçador e anexaro cano da arma de genes modificados para a pistola de genes. </li><li> Utilizando uma pinça estéril, colocar um elemento filtrante contendo a fatia organotípica em um prato de plástico estéril. </li><li> Remova a mídia da fatias organotypic. </li><li> Ajuste a pressão do gás a 50 psi. Observação: A proteção dos olhos é essencial e protetores de ouvido aconselhável. </li><li> Coloque a pistola de genes nas distâncias adequadas, utilizando a montagem de medição para 10 mm. Procurar com cuidado o centro do tambor sobre a região desejada para entrega genética. </li><li> Após o disparo, substituir as pastilhas de volta para o seu prato com meio fresco e devolvê-las às condições normais de crescimento, isto é, 37 ° C com 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Uma vez terminado, feche o tanque de hélio, solte a pressão da pistola de genes e retirar a arma gene do tanque de hélio. </li><li> Retire o suporte do cartucho e descartar os cartuchos e limpar a arma gene. </li><li> Verifique o tecido para a morfologia e para a penetração bem sucedida por viLízing as fatias utilizando um microscópio invertido. Se estiver usando micropartículas, dispersar uniformemente o ouro; não deve haver áreas densas de partículas de ouro visto na fatia. As nanopartículas, devido ao seu pequeno tamanho não pode ser visto como unidades individuais por técnicas de microscopia convencional. </li><li> Após o intervalo de tempo apropriado (normalmente 1-2 dias), as fatias de fixar em 4% de paraformaldeído (PFA) para observação microscópica. NOTA: Fixação em PFA nem sempre é desejado. Para imagem de células vivas evitar este passo. </li></ol> 5 Fixação e visualização de fatias do cérebro <ol><li> Após transfecção biolística, fatias lavar duas vezes em PBS durante 2 min. </li><li> Fix fatias por incubação em frescos, gelada PFA a 4% em PBS durante 20 min. </li><li> Lavar as fatias duas vezes em PBS durante 2 min. </li><li> Gentilmente cortar rodada da membrana suporta o uso de um bisturi, sem perturbar as fatias montadas sobre eles. Use uma pinça para colocar cada membrana apoio / fatia em uma lâmina de microscópio. Descanse o organotypic fatias por cima da membrana da lâmina de vidro. </li><li> Adicionar uma gota de meio de montagem por cima da fatia e adicionar uma lamela suavemente sem qualquer força directamente em contacto com a fatia organotípicas. </li><li> Fixe a lamela com uma fina camada de verniz para as unhas. </li><li> Ver as fatias em um microscópio apropriado. </li></ol> 6. Aplicações confocal <ol><li> Visualize as fatias usando uma confocal de varredura a laser microscópio vertical com um 60x / 1,4 abertura numérica (NA) de imersão em óleo lente objetiva. NOTA: A característica mais problemática do microscópio confocal é o tamanho pinhole (fixado em 1 UA), que é capaz de isolar e recolher um plano de foco, eliminando assim o fora de foco &#39;névoa&#39; normalmente visto com uma amostra fluorescente. Os detalhes finos são muitas vezes obscurecido pela névoa e este não pode ser detectada num microscópio nonconfocal. </li><li> Defina o laser de argônio para um comprimento de onda de excitação de 488 nm e otimizar a coleta de lositted luz na banda de 500-520 nm. Tipicamente, recolhem imagens em 1024 x 1024 pixels e com pilhas de z-secções em intervalos de 0,5 micron para abranger toda a largura de cada uma das células do nervo, que foi analisada. <ol><li> Para observar a morfologia do núcleo, contra-coram as células com DAPI (comprimento de onda de excitação fixado em 405 nm e a emissão de luz recolhida entre 420-4 40 nm). Finalmente, para o exame de fluorescência vermelha, colocar o laser em 561 nm para excitação e 565-620 nm para emissão. </li></ol></li><li> Normalmente, aquisição de imagens usando um zoom de 4X varredura que cobriu uma área de 57,6 mM 2; tamanhos de imagem foram na região de 1.024 x 1.024 pixels. Pilhas recordes de z-seções em intervalos de 0,5 micron e projeções de 5-8 quadros combinados. </li></ol>

<ol><li>Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Biotechnology. 24, 384-386 (1987).</li>
<li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+culture+from+the+adult+mouse+brain%3A+a+versatile+tool+for+translational+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacolog.%2C+%26+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li>
<li>Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slices%3A+a+model+to+study+the+neurovascular+unit+micro-environment+in+epilepsies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11(2013).</li>
<li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+a+century+of+neuron+culture%3A+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+Journal+of+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).</li>
<li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures%2C+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2013).</li>
<li>Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+testing+neuroactive+drugs+-+link+between+in-vitro+and+in-vivo+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments.</a> Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).</li>
<li>Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+factors+regulating+axon+growth+between+the+cortex+and+spinal+cord+in+organotypic+co-cultures%3A+effects+of+age+and+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors.</a> J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).</li>
<li>Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+cerebral+cortex+in+organotypic+slice+cultures%3A+sustained+basal+forebrain+and+transient+striatal+cholinergic+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections.</a> Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).</li>
<li>Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Cerebellar+Slice+Cultures+Exposed+to+Bilirubin+Evidence+Reactive+Gliosis%2C+Excitotoxicity+and+Impaired+Myelinogenesis+that+Is+Prevented+by+AMPA+and+TNF-alpha+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors.</a> Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).</li>
<li>Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+develop+axonal+projections+to+their+target+areas+in+organotypic+co-cultures+of+the+ventral+mesencephalon+and+the+striatum%2Fprefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex.</a> Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).</li>
<li>Mingorance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Nogo+and+Nogo+receptor+during+the+development+of+the+entorhino-hippocampal+pathway+and+after+adult+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).</li>
<li>Arsenault, J., O'Brien, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+heterologous+transfection+of+viable+adult+organotypic+brain+slices+using+an+enhanced+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun.</a> BMC Research Notes. 6, 544(2013).</li>
<li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
<li>Laywell, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-astrocyte+transition%3A+phenotypic+fluidity+and+the+formation+of+hybrid+asterons+in+differentiating+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres.</a> J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).</li>
<li>Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+neural+stem+cell+markers+suggests+the+occurrence+of+dedifferentiation+in+regenerating+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord.</a> Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).</li>
<li>Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Brien, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+spines+on+the+dendrites+of+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).</li>
<li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-biolistics%3A+a+method+of+biolistic+transfection+of+cells+and+tissues+using+a+gene+gun+with+novel+nanometer-sized+projectiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles.</a> BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).</li>
<li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diolistic+labeling+of+neuronal+cultures+and+intact+tissue+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun.</a> Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).</li>
<li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diolistics%3A+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+LDH+assay+for+assessing+nanoparticle+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity.</a> Toxicology. 287, 99-104 (2011).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).</li>
<li>Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell+damage+in+organotypic+hippocampal+slice+culture+from+adult+mouse%3A+a+potential+model+system+to+study+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection.</a> Brain Research. 1385, 68-76 (2011).</li>
<li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PloS One. 7, 45017(2012).</li>
<li>Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+DNA%2FGold+Nanoparticle+Encapsulated+in+Calcium+Phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 647631(2011).</li>
<li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Appl Phys Lett. 87, 014103(2005).</li>
<li>Meijering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+tracing+in+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Neuron tracing in perspective.</a> Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).</li>
<li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+axon-attached+recording+with+fluorescent+patch-clamp+pipettes+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices.</a> Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+central+nervous+system+after+intracerebroventricular+injection+of+adeno-associated+viral+vectors+in+neonatal+and+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice.</a> Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).</li>
<li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+protease-cleaved+SNARE+fragments+induce+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).</li>
<li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+the+botulinum+type+A+protease+to+growth+factors+and+neuropeptides+allows+selective+targeting+of+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells.</a> Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).</li>
</ol>

O Dr. John A. O'Brien detém patentes para o cano da arma genética aprimorada. Patente dos EUA número 10 / 380.452 e patente europeia número 01974517.3.

O protocolo descreve abordagens para entregar corantes e materiais genéticos em fatias organotípicas adultas utilizando uma pistola de genes melhorada. Essencialmente, os tipos de corantes e a variedade de possíveis genes fazem deste método multifacetado e passível de responder a uma grande variedade de questões biológicas. O método de entrega regiosseletiva utilizado, neste caso, a região específica do cérebro, abre novos caminhos para a experimentação como modulação de genes heterólogos de áreas localizadas dentro de uma arquitetura biologicamente relevante não foi facilmente exequível antes. Temos previamente determinado que este método pode ser usado em fatias organotípicas adulto, onde sinapses maduras são totalmente formados, tal como revelou melhoria na sobrevivência de células e expressão de genes heterólogos para muitas semanas 13. Com o advento de novas e melhoradas as condições de cultura para o cérebro de mamíferos, bem como outros tecidos, a utilização de modulação genéticas regiosselectiva se tornará cada vez mais úteis para uma grande variedade de BiocheMical analisa. Como vamos destacar aqui e anteriormente mencionado por outros 24, muitos fatores diferentes podem facilmente afetar a precisão e confiabilidade de entrega biobalística. Em primeiro lugar, a preparação das partículas de ouro ligados a corantes ou de DNA deve ser adequadamente equilibrado para evitar a agregação e a fim de facilitar a expulsão da carga do cartucho. Cálcio e espermidina na solução de micro partículas de ADN-ouro pode ajudar a ligação das moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro. A capacidade para as nanopartículas de penetrar nas células, sob pressão reduzida foi previamente determinado 17. Em segundo lugar, a arma gene deve ser montado o mais estável possível com o ângulo ea distância correta. Um manómetro de confiança é também necessário para a reprodutibilidade, para manter a integridade do tecido, e para acelerar adequadamente as partículas de ouro para os seus objectivos pretendidos. Com efeito, a distância, a orientação, e a estabilidade do equipamento também estão factores cruciais para a targeting e precisão de entrega regiosseletiva. Como estas estruturas cerebrais são muito pequenas, pequenas variações no ângulo de disparo poderia facilmente tornar todo o processo mais confiável. E, finalmente, a preparação e manutenção de fatias organotypic viáveis ​​foram repleta de dificuldades para muitas décadas ainda protocolos abundantes e confiáveis ​​para animais diferentes, regiões do cérebro, idades e co-culturas estão disponíveis 2,4,25,26. Estes procedimentos devem ser antes de submeter os tecidos para procedimentos biolística otimizado pelo usuário. Isto irá mais facilmente permitir ao utilizador verificar unbiasedly o impacto das partículas biolística e o efeito do gene heterólogo nas suas próprias culturas. Para este fim, a utilização de genes fluorescentes tais como EYFP EGFP e tanto pode permitir um novo utilizador para testar a precisão de direccionamento e também a seguir a viabilidade celular através da expressão do gene heterólogo ao longo de um período sustentado de tempo 13. Muitos dos passos críticos para fiávele uso reprodutível deste protocolo são destacados nos três parágrafos seguintes. Para a transfecção eficaz, a concentração de DNA deve ser apropriado. As concentrações que são muito baixos prejudicaria o rendimento transfecção enquanto que as concentrações muito altas pode causar aglomeração das nanopartículas. Os agregados de ouro pode reduzir drasticamente a eficiência da transfecção, causar distribuições irregulares, e pode levar a um aumento da citotoxicidade e stress oxidativo. Problemas com a eficácia do revestimento são provavelmente devido à expiração da solução espermidina (deve ser substituído a cada 2 a 3 meses). Para uma propagação biobalística adequada, a rotulagem deve ser mesmo. A marcação não-homogénea da suspensão de nanopartículas de ouro / ADN pode ser devido à solução de PVP. Também deve ser substituído cada 2 a 3 meses. Revestimento das nanopartículas de ouro pode ser visto na electroforese em gel de agarose, como uma faixa de MW mais elevado 27. Cada sist biológicalos sob investigação, bem como cada instrumento diferente usado pode exigir pequenas mudanças na pressão do gás para atingir níveis optimizados de transfecção e propagação biobalística. O parâmetro crítico é a pressão do impulso de hélio necessário para retirar o micro ou nano-transportadores a partir do cartucho de plástico e empurrá-las para o tecido. A pressão do gás de alta vai afetar a sobrevivência da célula, porque vai criar ondas de choque em todo o alvo e interromper ou retirar o tecido da matriz 17. Visando o cano da arma de genes e possuindo o aparelho exatamente perpendicular ao tecido é importante para a entrega precisas biolística. A área seleccionada deve ser colocado no centro do tambor directa, precisamente de 10 mm da abertura exterior. Isto resulta em um diâmetro de 3 mm de distribuição de partículas de ouro em volta do epicentro. O cano da arma gene deve ser limpa com álcool 70% após cada utilização. Para proteger o tecido a partir de grandes agregados de partículas, o tambor também contém uma malha de nylon que should ser substituídas regularmente para manter o desempenho ideal. A fim de substituir as malhas desapertar a tampa, em seguida, inserir uma nova malha de nylon entre a tampa eo O-ring. Células marcadas por fluorescência deveria ser visível pelo menos 1 - 2 dias após a transfecção em torno do epicentro. Ausência ou desalinhamento de rotulagem pode ser resultado de uma preparação inadequada e instabilidade da montagem arma gene. As observações de células usando microscopia confocal depende de uma série de factores: o comprimento de onda da luz de excitação / emissão, o tamanho do orifício, NA da lente objectiva, de índice de refracção dos componentes no caminho da luz, a profundidade do tecido, e o alinhamento de o instrumento. Esses fatores devem ser otimizados para cada sistema sob investigação. Recentes avanços em biolï¿½tica foram exploradas para o sucesso deste método. O cano da arma de genes utilizados no presente estudo foi modificado de modo a reduzir a pressão necessária, assim como canalizar o biolï¿½ticapadrão de dispersão para uma forma mais restrita e específica área de 17,19. Outras modificações barril tentaram restringir a disseminação de biobalística e reduzir a pressão de saída 28 ainda este gene cano da arma projetado projetado pelo Dr. O&#39;Brien é um único componente instalado na arma Helios Gene padrão. Subsequentemente, as partículas sub-micrométricas de ouro foram usadas para reduzir a capacidade de invasão das partículas micrométricas que determinaram previamente causado dano celular e em última instância, a perda de expressão do gene heterólogo sustentada. Estas modificações do procedimento de biolística melhorou a viabilidade global e reprodutibilidade do método 13. Outras melhorias na preparação fatia como solução de problemas em profundidade do processo de corte, usando uma matriz de DMEM-Agarose para preservar o cérebro, e vários outros avanços úteis para organotípica preparação fatia do cérebro relatado anteriormente 13 nos permitiu explorar o uso de fatias de adultos que desenvolveram maduraredes sinápticas. Em nosso estudo, principalmente utilizados corantes e genes heterólogos fluorescentes para visualizar a morfologia das células como uma leitura sobre a eficiência de transfecção e uma capacidade de imagem das características morfológicas dos neurônios nos tecidos cerebrais do rato. A relação sinal-ruído da entrega estocástica dentro de um raio definido nos permitiu isolar completamente porto dendrítica de uma única célula dentro de seu contexto de origem. Como são utilizados numerosos esforços para investigar essas características morfológicas, de mapeamento &#39;conectonomia &quot;ou para marcar células individuais para várias análises, este método pode ser facilmente combinada com protocolos existentes, tais como eletrofisiologia e neurite medições 29,30. Evidentemente, as combinações de genes heterólogos fluorescentes poderia permitir uma delineação muito mais robusta das células individuais como da distribuição estocástica de proteínas fluorescentes, e a sua combinação poderia determinar a cor das células individuais 31,32. A utilização de promotores específicos de células, como a sinapsina e proteína glial fibrilar ácida a montante do exão do gene heterólogo pode também restringir a expressão de 33 subpopulações. Com efeito, a variedade sem fim de material genético pode também ser administrado de uma maneira regio-selectiva por nanopartículas de ouro, utilizando o mesmo procedimento. As regiões totais transfectadas podia assim ser analisados ​​com os métodos tradicionais, tais como a dissecção e submetendo-a região inmunotransferência para analisar o efeito localizado do gene heterólogo. As melhorias nos processos fatia organotypic também permitirá uma maior utilização de tecidos do cérebro para a experimentação de longo prazo, bem como permitir o uso de outros tecidos e co-culturas e facilitaria os procedimentos de transfecção. Lipid e transfecção polímero previamente relatado para afetar a homeostase da membrana, internalização, permeabilidade proteína 34 e freqüentemente mostram uma eficiência muito baixa para transf terminally diferenciado neurônios. Direccionamento celular específico de carga é também susceptível apenas a células que expressam os receptores da superfície celular necessários para a internalização, e embora este método pode ser altamente selectivo, que pode faltar regiosselectividade 35 segmentada. Os vetores virais de outra forma são muitas vezes difíceis e caros de produzir, exigem normas rígidas e têm na ocasião demonstrou preocupações com a segurança. Entrega biobalística, portanto, tem uma capacidade inigualável para transf regiosseletivamente neurônios e outros tipos de células dentro dos tecidos viáveis. Como o ouro é não tóxico, mais avanços no uso de biobalística poderia pavimentar o caminho para usos biomédicos, tais como a administração transdérmica farmacêutica, na entrega gene vivo não invasiva, bem como terapias genéticas não virais localizadas.

Originalmente, a técnica de biobalística, uma frase da virada para &quot;balística biológicos&quot;, foi criada para a transferência de genes mediada por partículas em células de plantas 1. Este método físico de transformação celular ou nanopartículas micro acelera a velocidade elevada para superar as barreiras físicas das membranas celulares impermeáveis ​​de modo a fornecer cargas, tais como o DNA ou corantes. Porque não dependem de ligando-receptores específicos e / ou as propriedades bioquímicas nas membranas da superfície das células, a transferência de genes mediada por partículas pode ser facilmente aplicado a uma variedade de sistemas biológicos, tais como fatias cerebrais organotípicas. Usando fatias organotypic têm vantagens sobre outros em plataformas in vitro, uma vez que manter muitas propriedades anatômicas e bioquímicas que são pertinentes para in vivo biologia 2-4. As fatias de conservar a maior parte das características arquitetônicas locais de onde eles se originaram e preserve atividade neuroquímica ea conectividade das sinapses. O uso de fatias do cérebro para a pesquisa básica, e em empreendimentos farmacêuticos, concomitantemente tem aumentado com o número de possíveis manipulações biotecnológicas para medir e monitorar os comportamentos neurobiológicos do cérebro em um in vivo como contexto 3,5-7. As grandes vantagens para a utilização de sistemas de ensaio baseados em organotípicas de fatias é que ele proporciona um controlo fácil e experimental permite manipulações precisas de ambientes extracelulares. Proveitosamente, sistemas de cultura organotípica fatia foram estabelecidas a partir de uma variedade de regiões cerebrais, tais como, mas não limitado a, o córtex, medula espinhal e cerebelo de 8-10. Além disso, tem sido demonstrado uma série de co-culturas, o que permite a avaliação da comunicação intercelular entre as regiões cerebrais distais, bem como entre os neurônios e células patológicas 11,12. Muitos protocolos já foram estabelecidos para successfully fatias cultura organotypic e pode manter a viabilidade a longo prazo e muitos estudos recentes agora utilizar os métodos de interface membrana e diversas modificações para ele 13. Este princípio mantém as fatias organotípicas na interface entre o meio e uma atmosfera humidificada da incubadora, colocando as fatias em um filtro de membrana porosa. O meio pode, assim, proporcionar nutrientes suficientes para alimentar as fatias organotípicas através movimento capilar. Normalmente fatias foram preparados a partir de animais pós-natal precoce (3-9 dias de idade; P3 - 9). No entanto, a partir de tecidos cerebrais essas fatias apresentam um elevado grau de plasticidade celular e tem uma resistência inerente às solicitações mecânicas, o que é útil para obter culturas viáveis, ainda sinapses maduras e circuitos neuroanatômico não totalmente desenvolvido in vivo, até 2 a 3 semanas de idade 14. Por exemplo, observações anteriores tinham demonstrado que os obtidos a partir de fatias de hipocampo P0 - 1 neonatos, embora altamente VIABle seguinte preparação, foi perdendo algumas características morfológicas. Essencialmente, eles mostraram-se inadequadas para as culturas de longo prazo, sugerindo células imaturas eram mais propensos a de-diferenciada em comparação com culturas organotypic de animais mais velhos 15,16. Por esta razão, o nosso método foi otimizado para fatias de cérebro organotypic adultos em que a maturação e desenvolvimento arquitetônico tenham atingido os seus estágios terminais 13,17-21. No entanto, este método também é adequado para recém-nascidos e fatias organotípicas juvenis. Uma vez que as fatias organotípicas viáveis ​​foram produzidos toda a placa contendo as fatias pode ser trazido para a montagem biolística e submetidos a entrega regiosselectiva e transfecção. A montagem adequada da pistola de genes (tal como descrito na Figura 1), orientado a 90 °, a uma distância de 10 milímetros directamente sobre as fatias (a partir da abertura para o tecido), permite o fornecimento biolístico rápida dos 40 nm irld cargas de partículas revestidas. Estas cargas, tais como corantes fluorescentes e vectores de ADN, bem como qualquer gene de interesse, são facilmente entregue nas fatias viáveis ​​com facilidade. Este método, portanto, descreve o protocolo necessário para fornecer, de uma maneira regio-selectiva, carga nanopartículas de ouro revestido em fatias de cérebro organotípicas viáveis. O cano da arma gene e montagem ideal pode ser visto na Figura 1. Para mais informações sobre o barril e nanopartículas melhorou balística, consulte O&#39;Brien, et al. 17. Refinamentos subsequentes também são indicados para o utilizador para optimizar as condições, tais como a quantidade adequada de ouro entregue por área alvo, como definido microtransportador quantidade de carregamento (MLQ), e para determinar a quantidade de ADN carregado por mg de ouro, definido como ADN Carregando Proporção (DLR). Antes de precipitar DNA em partículas de ouro e colocá-los na tubulação Tefzel que compreende os cartuchos da arma gene real &#39;9 ;, é necessário para calcular a quantidade de ADN e de ouro necessária para cada transfecção, que podem diferir um pouco entre os tecidos e condições (proporção deve ser mantida entre 1 mg de ouro e 1 ug de ADN de 1: 5). É vital para preparar a proporção adequada de MLQ a DLR em contrário DNA revestido partículas de ouro poderia aderir juntos formando maior do que a aglomeração esperado, o que poderia reduzir a homogeneidade global da propagação biobalística, bem como danos aumento do tecido e citotoxicidade. Este método mostra as recentes melhorias na prestação de biobalística, que foram testados e considerados passíveis de fatias do cérebro organotypic neonatais, jovens e adultos. Além disso, através da exploração de spread reduzido biobalística do cano da arma gene, o usuário agora é capaz de transfecção seletivamente uma região pontual no cérebro. Após o tempo de incubação apropriado, a expressão das proteínas fluorescentes, que atinge os seus valores máximos entre 24 e 48h, pode ser visualizada por microscopia confocal e epifluorescência. Estes fluorophores permitir a análise morfológica e localização das células individuais dentro de estruturas biologicamente relevantes. No entanto, a modulação regiosselectiva das fatias organotípicas de outros genes heterólogos também podem ser monitorizadas por quaisquer outros testes passíveis para estas preparações. Possíveis estratégias úteis para a entrega de genes localizados são apresentados na Figura 2.

<table><tbody><tr><td>Sistema de pistola de genes</td><td>Helios Bio Rad</td><td>165-2431</td><td>Estação de preparação de pistola e tubo de genes</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83264-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907-100G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-100G</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m unidade de filtro estéril</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>para filtrar o meio</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma</td><td>856568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>277649-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio Rad</td><td>161-3100EDU</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer</td><td>Laica</td><td>VT1200</td><td>Usamos um design personalizado</td></tr><tr>Suporte <td></td><td></td> de<td>arma de gene</td><td>Construído em casa na U of T</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células umidificadas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de ouro</td><td>citodiagnóstico</td><td>G-40-20</td><td></td></tr><tr><td>pEYFP-N1</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tubos</td><td>Bio Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Tefzel</td><td>Bio Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Barril</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida pelo LMB</td></tr><tr><td>Inserção de cultura de células</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>76240 Microscópio</td> de dissecação Fluka <td></td></tr><tr><td>para conveniência</td><td></td> Microscópio confocal definido pelo usuário para uso Lâmina de vidro VWR 2588-CA48323-185 Vidro de microcapa VWR 2448-CA48366-067-1 Mídia de montagem Vectashield Vector laboratories H-1400&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

regiosseletiva biolistic segmentação em organotípicas fatias do cérebro do usando um modificado gene gun

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

A transfecção de DNA tem sido inestimável para ciências biológicas e com os recentes avanços em preparações fatia do cérebro organotypic, o efeito de vários genes heterólogos poderia, assim, ser investigado facilmente, mantendo muitos aspectos da biologia in vivo. Tem havido um interesse crescente para transf neurônios terminalmente diferenciadas para que os métodos de transfecção convencionais têm sido repleta de dificuldades, como os baixos rendimentos e perdas significativas para a viabilidade. Biolistic transfecção pode contornar muitas destas dificuldades ainda apenas recentemente esta técnica foi modificada de modo que é favorável para uso em tecidos de mamíferos. Novas modificações na câmara de acelerador ter maior precisão de tiro da arma do gene e aumentou suas profundidades de penetração ao mesmo tempo, permitindo o uso de menor pressão de gás (50 psi), sem perda de eficiência de transfecção, bem como permitir a propagação regiosseletiva focalizada do paARTIGOS para dentro de 3 mm. Além disso, esta técnica é para a frente e mais rapidamente do que para realizar microinjections fastidiosos. Ambos transitória e expressão estável de nanopartículas são possíveis com bombardeamento onde expressão episómico podem ser detectados dentro de 24 horas e a sobrevivência de células mostrou-se melhor do que, ou igual a, pelo menos, os métodos convencionais. Esta técnica tem contudo uma vantagem importante: ela permite a transfecção para ser localizada dentro de um único raio retido permitindo assim que o utilizador isolar anatomicamente efeitos do gene heterólogo. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para preparar adultos viável fatias organotypic e submetê-los a regiosseletiva transfecção utilizando uma arma gene melhorado.

Viabilidade fatia organotípicas pode ser monitorizado com a actividade de lactato desidrogenase, rotulagem iodeto de propídio, e coloração dUTP como foi anteriormente relatado 13,22. Evidentemente, a viabilidade ea integridade das fatias são importantes para a expressão sustentada a longo-prazo da carga genética entregue. Após a entrega biolï¿½tica nas fatias organotípicas, a expressão do gene heterólogo fluorescente foi monitorizado por microscopia confocal. O aperto da propagação biolï¿½tica usando o barril modificado pode ser visto na Figura 3A. Figura 3B mostra uma imagem representativa da região do hipocampo transfectadas utilizando ADN nanopartículas de ouro revestido. Figura 4 mostra imagens representativas de fatias organotípicas adulto rato transfectadas. Como pode ser observado na Figura 4A, um neurónio, com um porto de Purkinje dendrítica notável encontrada na interface da camada de Purkinje e da camada molecular do cerebellum mostra rotulagem pronunciado após transfecção transitória com biolï¿½tica pEGFP-N1. Figura 4B mostra uma ampliação maior do que estes dendritos espinhas podem ser observadas. Figura 4C mostra uma célula piramidal encontrada na região CA1 do hipocampo após o fornecimento biolístico de nanopartículas de ouro revestidas pDSredFP . Corantes fluorescentes codificado em vez de cargas de DNA também pode ser usado de um modo semelhante ao visualizar as características morfológicas em fatias organotípicas. DiO, que marca as membranas de plasma, pode delinear mais rapidamente morfologias celulares individuais ou pode ser utilizado em conjunto com um biolística de ADN revestido entregues para a mesma região para confirmar a regioselection. Como pode ser visto na Figura 5A um neurónio coradas com DiO no hipocampo, também mostra longos dendritos com numerosos espinhos. Uma seta indica o axónio o qual é identificado pela presença de boutons sinápticas em comparação com o dentritic espinhas nos outros neurites. Figura 5B mostra um outro exemplo de CA1, que destaca numerosas saliências do hipocampo, com um contra-corante de DAPI para marcar o núcleo. Figura 5C mostra uma ampliação maior destes tipos de dendrites paralelas com numerosos espinhos. Evidentemente, essas imagens ilustram características morfológicas seguintes rotulagem celular. Nada impede que a mesma metodologia a ser aplicada para entrega de qualquer número de genes exógenos que revestem as nanopartículas de ouro. Para permitir a confirmação visual da transfecção bem sucedida, um único plasmídeo pode ser construída para co-expressar tanto o gene de interesse e uma proteína repórter fluorescente no mesmo vector. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg"> Figura 1 Gene cano da arma e de montagem. (A) A melhorar d barril desenvolvido pelo Dr. O'Brien no MRC-LMB, que tem uma distribuição restrita biolistico que minimiza os danos de tecidos, diminuindo a pressão necessária para a aceleração de partículas. (B) A vista lateral de uma pistola de genes optimizados montagem desenvolvido pelo Dr. Henderson e Dr. Andras Nagy, da Universidade de Toronto. A montagem segura a arma de genes, precisamente 90˚ perpendicular às fatias organotípicas enquanto permite ao utilizador controlar com precisão a distância de distribuição biolistica. Para condições ideais biolística a abertura barril deve ser colocado diretamente sobre a região de interesse a uma distância de 10 mm da fatias organotypic. (C) Vista traseira da arma gene montagem. A região de interesse para ser transfectada necessita de ser colocado directamente por baixo da abertura do tambor. Segmentação pode ser confirmado com corante (diolistic) ou transfecção proteína fluorescente (biobalística).ank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg"> Figura 2. preparação organotípicas fatia e direccionamento regiosselectiva. (A) Um DMEM incorporado cérebro do rato adulto pronto para corte. (B) O molde foi colada sobre a montagem com a lâmina pronta para cortar uma fatia vibroslicer. (C) regiosseletiva expressão de genes heterólogos estratégias para entrega biolï¿½tica coronais em fatias de cérebro organotípicas. Imagens preparados a partir de imagens obtidas a partir dos Atlas Cerebral Allen atlas de referência anatômica 23. O painel esquerdo mostra duas regiões diferentes do cérebro direccionadas, tal como um exemplo. Para restringir a expressão do gene (1) para a área cortical do hemisfério esquerdo. Para restringir a expressão de genes heterólogos (2) a região do hipotálamo no cérebro. Painel do meio mostra that a expressão de dois genes heterólogos (3 e 4) pode ser isolado e compara o hipocampo dos dois hemisférios na mesma fatia organotípica, eliminando essencialmente qualquer tendência de utilizar secções diferentes e / ou que assegurem a possibilidade de tratar a diafonia distal dos efeitos do esses genes. O painel direito mostra a possível sobreposição de entrega transgénico para expressar o primeiro gene (5) em uma região cortical preciso ao expressar um outro gene (6) em uma díspar ainda sobreposição área cortical. Isso permite analisar o efeito da modulação genética de cada gene heterólogo sozinho e também em combinação dentro da mesma fatia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg"> Figura 3 padrão de dispersão Biolistic visto em filter imagem de baixa ampliação e papel. (A) O tambor foi disparado melhorada sobre papel de filtro para determinar a propagação de partículas de ouro. O lado esquerdo mostra a distribuição do barril melhorada enquanto o painel da direita mostra o tambor normal. Preto bar: 1 cm. A imagem obtida a partir de O'Brien et al. 17. (B) imagem baixa ampliação que mostra o padrão de transfecção estocástica dentro dos três milímetros propagação biolï¿½tica dentro da região do hipocampo de ratinhos seis semanas de idade. Branco bar.: 100 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg"> Figura 4. Biolistic entrega de proteína fluorescente de ADN codificados em fatias organotípicas de seis semanas ratos velhos. (A) inverted imagens confocais de uma fatia organotípicas fixo do cerebelo de uma célula de Purkinje pEGFP-N1 partículas de ouro revestidas transfectadas. A imagem foi tirada em 40X. Preto bar.: 30 mm (B) mostra uma ampliação de porto dendrítica de outra célula Purkinje para destacar as espinhas 60x. Preto bar.: 5 m (C) mostra uma imagem confocal de fatias fixos retirados na região do hipocampo em 60x ampliação de quatro DSredFP transfectadas células piramidais. Preto bar.: 10 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg"> Figura 5 Diolistic entrega de corantes fluorescentes de rotulagem membrana em fatias organotípicas. (A) mostra a imagem ao vivo de um neurónio do hipocampo labeled com DiO sob ampliação 20X. As espinhas dendríticas pode claramente ser observada, bem como o axónio como identificados pela ausência de espinhas dendríticas e a presença de boutons sinápticas indicados por uma seta branca. Branco bar: (B) coloração 30 mm pronunciada da região do hipocampo marcado com DiO e contrastado com DAPI.. Barra branca:. De 30 um (C) Maior ampliação (60x) de espinhas dendríticas encontrados na região CA1 do hipocampo. Branco bar.: 5 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Melhorias recentes nas preparações organotípicas de fatias de cérebro permitiram sua exploração para aplicações biotecnológicas. As fatias organotípicas mantêm características estruturais locais da biologia in vivo, incluindo conexões sinápticas funcionais. Aqui apresentamos um método de entrega biolística regiosseletiva para rotular e manipular geneticamente essas fatias.

Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

O objetivo deste procedimento é transfectar ou rotular de forma rápida e eficiente regiões distintas de fatias organotípicas usando uma arma genética. Isso é feito preparando primeiro fatias organotípicas viáveis do cérebro ou de outros tecidos. O segundo passo é produzir DNA ou partículas de ouro decodificadas para entrega biótica.Em seguida, a fatia organotípica é colocada sob um suporte de pistola de genes estabilizado e as partículas revestidas são disparadas no tecido ou transformação ou rotulagem episódica. A etapa final é observar ou analisar o efeito de genes heterólogos entregues às regiões isoladas. Em última análise, essa abordagem permite ao usuário transfectar com precisão regiões distintas das fatias de órgãos com vários genes heterólogos.A principal vantagem desse método sobre os métodos existentes é que a biologística permite que o transfecto diferencie terminalmente as células, além de limitar o raio de ação a um pequeno diâmetro. Este método pode ajudar a entender as principais questões neurobiológicas, como entender a contribuição regional de um único gene. Comece este procedimento colocando um cérebro fresco em um pequeno molde receptor.Cubra-o com a solução ARO, que foi chamada para um pouco acima da temperatura ambiente. Em seguida, resfrie rapidamente o molde a quatro graus Celsius, colocando-o no gelo. Quando o aros se apôs.Após cinco a 10 minutos, remova o cérebro embutido em aros do molde. Depois disso, cole-o na plataforma do fatiador de fibro. Em seguida, transfira a plataforma para a câmara do fatiador Vibra contendo PBS estéril e gelado.Após o corte, coloque delicadamente as fatias nas inserções de cultura de células em uma bandeja de seis poços com meios de cultura na parte externa da inserção. Incube-os em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Neste procedimento, prepare os nano projéteis usando partículas de ouro de 40 nanômetros de diâmetro, adicionando primeiro 50 microlitros de espermatozóides 0,05 molar e 10 microlitros de DNA a um miligrama por mililitro a 10 miligramas de partículas de ouro.Em seguida, adicione cloreto de cálcio na mistura de solução para ajudar na ligação das moléculas de DNA às nanopartículas de ouro. Em seguida, coloque a solução no tubo com uma seringa. Coloque a tubulação na estação de preparação da tubulação.Permita que as partículas de ouro se assentem. Em seguida, remova o supinado por aspiração Com uma seringa. Gire o tubo para espalhar uniformemente as partículas de ouro.Em seguida, seque as partículas sob um fluxo constante de nitrogênio a cinco litros por minuto. Para criar balas de DNA, corte o tubo em pedaços de um centímetro usando um cortador de tubos. Em seguida, insira-os imediatamente no cartucho cultivado em genes ou mantenha-os dessecados a quatro graus Celsius até o uso em uma capela de fluxo de lâmina estéril, carregue o cartucho contendo o ouro revestido de DNA no suporte do cartucho.Em seguida, carregue o suporte na pistola genética. Prenda o cano da arma genética modificada a ele usando uma pinça estéril. Coloque um filtro contendo uma fatia organotípica em um prato de plástico estéril.Remova a mídia da fatia organotípica. Em seguida, defina a pressão do gás em 50 PSI usando o suporte. Coloque a arma genética a uma distância de 10 milímetros acima da região desejada da fatia para entrega genética.Em seguida, mire cuidadosamente no centro do cano e dispare as partículas revestidas no tecido. Após a transfecção biótica, lave a fatia suavemente duas vezes com PBS. Em seguida, fixe a fatia incubando em 4% de PFA gelado em PBS por 20 minutos.Depois disso, lave a fatia duas vezes em PBS. Novamente, corte suavemente a membrana da inserção usando um bisturi sem perturbar a fatia. Em seguida, coloque o suporte da membrana em uma lâmina de microscópio com uma pinça e deixe a fatia organotípica descansar sobre ela.Em seguida, adicione uma gota de mídia de montagem na fatia. Coloque uma lamínula com cuidado, sem qualquer força diretamente em contato com o tecido. Em seguida, prenda a lamínula com uma fina camada de esmalte.Esta figura mostra a entrega biótica de DNA codificado por proteína fluorescente na fatia organotípica de um camundongo de seis semanas de idade. Como pode ser visto aqui, um neurônio do biquíni com um notável porto dendrítico encontrado na interface da camada do biquíni e da camada molecular do cerebelo mostra uma marcação pronunciada após a transfecção biótica transitória com a PEG. Aqui está uma ampliação maior dos dendritos com os espinhos, e aqui está uma célula parametálica encontrada na região ca um do hipocampo.Após a entrega biótica da nanopartícula de ouro revestida com PDS Red FP Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em apenas algumas horas durante o período de três a quatro dias após este procedimento. Outros métodos, como a microscopia confocal, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como como certos neurônios estão conectados a regiões vizinhas.

regioselective-biolistic-targeting-organotypic-brain-slices-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo demonstra a dissecção e incubação de retina de coelho e de partículas mediado por transferência de genes de codificação de plasmídeos GFP ou uma variedade de marcadores subcelular em células ganglionares da retina.

Cultura organotípicas de Retina Coelho Adulto

Nós descrevemos um método para preparar balas DNA revestido de ouro e demonstrar o uso de balas tais biolistically transfectar neurônios em cultura de fatias do hipocampo.

Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem...

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Aqui nós apresentamos um protocolo, projetado usar ferramentas chemogenetic para manipular a atividade de progenitores corticais do interneurônios transplantados no córtice de ratos pós-natal adiantados.

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Aprenda a técnica de biobalística regiosseletiva para manipulação genética de fatias organotípicas de cérebro usando gene gun modificado. Este método permite transfecção precisa de regiões específicas preservando características in vivo.

Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

Explorar mais vídeos