Automatizando Experiments chip-seq para gerar perfis epigenéticos em 10.000 células HeLa
10 de dezembro de 2014
Métodos para mapear interações proteína-DNA in vivo estão se tornando cruciais para todos os aspectos da pesquisa genômica, mas são trabalhosos, caros e demorados. Aqui, é apresentado um sistema robótico de manuseio de líquidos disponível comercialmente que automatiza a imunoprecipitação da cromatina para mapear interações proteína-DNA in vivo com quantidades limitadas de células.
O objetivo geral deste procedimento é fornecer aos pesquisadores uma plataforma automatizada capaz de realizar experimentos de imunoprecipitação de cromatina em apenas 10.000 células. Isso é feito preparando primeiro a cromatina cisalhada de alta qualidade para a imunoprecipitação da cromatina. Na segunda etapa, um experimento automatizado de imunoprecipitação da cromatina é criado e bibliotecas automatizadas são executadas com o DNA imunoprecipitado.
O DNA imunoprecipitado é analisado por PCR quantitativo e sequenciamento de próxima geração. Em última análise, o sucesso da tecnologia automatizada pode ser validado através da comparação dos perfis de sequência de imunoprecipitação da cromatina gerados na amostra original de 10.000 células com experimentos realizados em 100.000 células e conjuntos de dados existentes para referência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo epigenético para aprofundar nossa compreensão das funções de biomarcadores específicos em vários tecidos.
Estágios de desenvolvimento e estados de doença. Esta técnica tem implicações para o diagnóstico de múltiplas doenças, pois ajudará a identificar biomarcadores epigenéticos na saúde e na doença, precisos e confiáveis. As tecnologias automáticas são ferramentas importantes para pesquisadores na análise epigenética de tipos específicos de células, subpopulações e biópsias.
Para um experimento de imunoprecipitação de cromatina automatizado padrão, comece adicionando 120 microlitros de tampão de imunoprecipitação de cromatina H a 100 microlitros de cromatina cisalhada de um a 2 milhões de células, reservando de dois a 20 microlitros de cromatina para a amostra de entrada. Em seguida, para configurar o experimento automatizado no IP star compact, selecione os protocolos e clique no ícone de imunoprecipitação da cromatina. Escolha o método direto de imunoprecipitação da cromatina e, na próxima tela, escolha o protocolo de imunoprecipitação da cromatina de 200 microlitros e especifique o número da amostra.
Defina os parâmetros experimentais de imunoprecipitação da cromatina para quatro horas para o revestimento de anticorpos. Etapa 15 horas para a etapa de imunoprecipitação e cinco minutos para cada etapa de lavagem. Em seguida, configure os reagentes seguindo as instruções exibidas na tela de informações do layout e adicione os reagentes apropriados e os anticorpos de grau ChIP-seq altamente validados.
Em seguida, adicione 20 microlitros de proteína, contas magnéticas revestidas com A para cada reação e as amostras de cromatina após o protocolo de chip noturno e a reticulação reversa terminarem. Purifique o DNA com um kit de purificação de DNA baseado em esferas magnéticas. Use um ensaio fluorométrico comercial altamente sensível para quantificar o DNA imunoprecipitado.
Em seguida, usando primers para pelo menos uma região genômica de controle positivo e um negativo. Analisar a qualidade do DNA imunoprecipitado por PCR quantitativo de acordo com os parâmetros apropriados dos materiais para a análise. Os resultados são expressos como a porcentagem da recuperação da entrada para o sequenciamento de próxima geração sob protocolos.
Agora clique no ícone de preparação da biblioteca, escolha a tecnologia de preparação da biblioteca de sua preferência e configure os reagentes de acordo com as instruções na tela de informações do layout. Por exemplo, neste experimento, foram gerados perfis de sequenciamento para seis diferentes modificações de histonas associadas à expressão gênica. A alta correlação de pico observada entre esses marcadores de histonas indica a capacidade do sistema automatizado de gerar dados precisos e confiáveis.
Além disso, esses gráficos mostram a distribuição dos picos para as diferentes modificações de histonas em regiões genômicas específicas. Finalmente, para um experimento automatizado de imunoprecipitação de cromatina para amostras com baixo número de células, defina o protocolo automatizado de imunoprecipitação de cromatina de 200 microlitros no sistema de automação conforme demonstrado. Em seguida, carregue o sistema com o ChIP-seq, anticorpos e reagentes de grau otimizados para trabalhar em quantidades de cromatina entre 10.000 e 100.000 células usando apenas 10 microlitros de proteína, esferas magnéticas revestidas A para cada reação.
Após o chip, execute a preparação da biblioteca, selecione o protocolo de preparação da biblioteca micro plex e configure os reagentes seguindo as instruções exibidas na tela de informações do layout. Nesta PCR quantitativa representativa de uma imunoprecipitação de cromatina de uma amostra inicial de 10.000 células, foram observados enriquecimentos significativos com os anticorpos anti-histonas nas regiões de controle positivo e sinais insignificantes nas regiões de controle negativo. Aqui, uma série de 10 reações de imunoprecipitação que foram reprodutíveis e altamente comparáveis com um experimento de imunoprecipitação manual de cromatina são mostradas, demonstrando a capacidade do sistema automatizado de trabalhar com baixas quantidades de células sem aumento visível na variabilidade de experimento para experimento em comparação com a imunoprecipitação manual.
Esses dados ilustram as análises de bioinformática das bibliotecas de sequências de 10.000 e 100.000. Ele a S3 após a imunoprecipitação da cromatina, demonstrando excelentes resultados das amostras de imunoprecipitação de cromatina de baixo número de células. Este conjunto de dados, que corresponde ao experimento com 10.000 células de material de partida, contém baixo ruído de fundo com picos de enriquecimento altamente confiáveis que são confirmados pelo conjunto de dados de 100.000 células e pelo conjunto de dados de referência do Broad Institute.
Para o projeto de codificação, é importante observar que os dados de 10.000 células demonstram picos quase idênticos aos dados do Broad Institute com uma taxa de sobreposição de 98% dos melhores 40% dos picos classificados pela pontuação significativa usada no projeto de código final. O sistema automatizado IP star requer intervenção mínima do operador, reduzindo o tempo prático da imunoprecipitação da cromatina para apenas uma a duas horas. Além disso, o processo automatizado substitui as inúmeras etapas propensas a erros da imunoprecipitação manual da cromatina e fornece resultados altamente consistentes.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a boa imunoprecipitação da cromatina e uma boa seleção de anticorpos altamente específicos e sensíveis são fundamentais para o sucesso do experimento. Essa tecnologia abriu caminho para pesquisadores em todos os campos da biologia melhorarem a precisão, reprodutibilidade e consistência da terapia. Estudos epigenéticos.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma plataforma automatizada para imunoprecipitação de cromatina (ChIP) que pode processar eficientemente um baixo número de células, especificamente 10.000 células. O método tem como objetivo racionalizar o mapeamento de interações proteína-DNA, essencial para a pesquisa genômica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Epigenética
- Técnicas Laboratoriais Automatizadas
Contexto
- As interações proteína-DNA são cruciais para compreender a regulação gênica.
- Os métodos tradicionais de ChIP são trabalhosos e exigem um grande número de células.
- A automação pode aumentar a eficiência e a reprodutibilidade em experimentos genômicos.
- Este estudo foca em um sistema robótico que minimiza a intervenção manual.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método automatizado de ChIP para baixos números de células.
- Validar a eficácia do sistema automatizado em comparação com métodos tradicionais.
- Facilitar a identificação de biomarcadores epigenéticos na saúde e na doença.
Métodos Utilizados
- Preparação de cromatina fragmentada de alta qualidade a partir de 10.000 células.
- Automação do processo de ChIP utilizando um sistema robótico de manipulação líquida.
- Análise do DNA imunoprecipitado por meio de PCR quantitativa e sequenciamento de nova geração.
- Comparação dos resultados com dados obtidos de amostras maiores de células e conjuntos de dados existentes.
Resultados Principais
- O sistema automatizado produziu resultados confiáveis e reprodutíveis, comparáveis aos métodos manuais.
- Um enriquecimento significativo de modificações de histonas foi observado em regiões controle positivo.
- Uma alta correlação com conjuntos de dados de referência indicou a precisão da abordagem automatizada.
- A intervenção mínima do operador reduziu significativamente o tempo de manipulação.
Conclusões
- O método automatizado de ChIP é eficaz para pequenos números de células.
- Essa tecnologia pode impulsionar a pesquisa epigenética e a descoberta de biomarcadores.
- A automação aumenta a consistência e a confiabilidade das análises genômicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A automação da ChIP-seq para entradas com baixo número de células resolve um gargalo crítico na validação de alvos epigenéticos, permitindo a desmistificação mecanicista de hipóteses usando populações celulares primárias escassas ou raras. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao gerar perfis epigenômicos reprodutíveis a partir de amostras limitadas, apoiando a triagem de portfólios e decisões guiadas por biomarcadores. A tecnologia posiciona os ensaios epigenômicos como ferramentas de descoberta escaláveis e reutilizáveis, alinhadas à continuidade translacional desde a identificação de alvos até a validação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas e a clarificação de vias utilizando perfis de modificação de histonas a partir de amostras com baixa quantidade de material.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica e a validação funcional de alvos ao gerar dados reprodutíveis de ChIP-seq a partir de 10.000 células.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios por meio de leituras epigenômicas confiáveis que se correlacionam com conjuntos de dados de referência e padrões manuais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo fluxos de trabalho padronizados e automatizáveis de ChIP-seq.
- Valor Operacional: Aborda a padronização do ensaio, a reprodutibilidade e as saídas quantitativas por meio da automação baseada em microesferas magnéticas e leituras de qPCR/NGS.
- Escalabilidade: Destaca a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma por meio da redução do tempo de manipulação manual e da intervenção mínima do operador.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Discute a relevância para doenças por meio da identificação de biomarcadores epigenéticos em estados de saúde e doença utilizando ChIP-seq com baixo número de células.
- Alinhamento Pré-clínico: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo um perfil epigenômico consistente em diferentes tamanhos de amostras.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões por meio de dados reprodutíveis e com baixo fundo, confirmados frente a conjuntos de dados de 100.000 células e de referência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método automatizado de ChIP-seq integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, permitindo o perfilamento epigenômico em estágios iniciais com material limitado.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao gerar perfis de modificações de histonas a partir de entradas com baixo número de células.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio e reprodutibilidade por meio da preparação automatizada de bibliotecas e métricas quantitativas de recuperação de DNA.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes por meio de qPCR (% de recuperação do input) e correlação de picos em NGS para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica por meio de perfis epigenômicos alinhados a biomarcadores, validados contra conjuntos de dados ortogonais.
- Reutilização Corporativa: Apresenta a plataforma robótica como uma capacidade reutilizável para ensaios epigenéticos em diversos projetos, reduzindo redundâncias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em estudos de mecanismos epigenéticos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade alcançadas por meio de manipulação automatizada de líquidos e minimização de etapas manuais.
- Valor Estratégico: Decisões de prosseguimento ou interrupção mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados por meio de dados epigenômicos confiáveis com baixa necessidade de entrada.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, apoiadas por resultados de ChIP-seq reprodutíveis e correlacionados a referências.
Considerações de Implementação
- Exige experiência na preparação de cromatina, validação de anticorpos e operação de sistemas automatizados de manipulação líquida.
- Requer instrumentação incluindo uma plataforma robótica (por exemplo, IP-Star Compact), manipulação de microesferas magnéticas e infraestrutura analítica de qPCR/NGS.
- Exige padronização entre equipes na seleção de anticorpos, fragmentação da cromatina e parâmetros do protocolo para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao escalar de 10.000 a 100.000 células ou ao aplicar o método em biópsias primárias e subpopulações.
- As limitações práticas incluem a dependência de anticorpos altamente específicos e de alta qualidade, bem como uma fragmentação ideal da cromatina para sucesso com baixa quantidade de material inicial.
