Name: Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de Wnt5a Faz com cistos no peixe-zebra Rins (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a gerar um modelo de doença renal policística em peixe-zebra através do knockdown de wnt5a usando morfolino. Este método permite visualizar a formação de cistos renais por microscopia de fluorescência em embriões Tg(wt1b:GFP).

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Este trabalho foi financiado pelo NIH (DK093625 ao LH, e DK069909 e DK047757 para JHL) eo VA (Prémio de Mérito I01BX000820 para JHL). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Pack e Dr. Jie Ele, na Universidade da Pensilvânia Zebrafish Núcleo de prestação de apoio essencial.

Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School. 1. Preparação Morpholino <ol><li> Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1. NOTA: MOs são enviados como ações liofilizada em garrafas de vidro. </li><li> Adicionar alto grau de água estéril para os frascos de vidro para re-suspender OMs para uma concentração final de 25 ug / uL. Certifique-se de que o oligonucleótido esteja completamente dissolvido. Se alguns restos sólidas, aquecer o frasco contendo a solução de estoque de oligonucleótido a 65 ° C durante 5 a 10 min e agitar com vortex brevemente. </li><li> Guardar a solução estoque MO na RT. Não armazená-los a 4 ° C ou -20 ° C; C, porque temperaturas mais baixas, pode causar o oligonucleótido MO para se ligarem à parede do recipiente. Medir a concentração da solução-mãe usando um espectrofotómetro (consulte a tabela 1) cada vez que uma nova solução de estoque MO é feita. </li><li> Preparar a solução de trabalho de MO no dia da injecção por diluição da solução de reserva com alto grau de água esterilizada para a dose desejada. Adicionar 0,5% de vermelho de fenol para atingir uma concentração de 0,05%. Por exemplo, para fazer a solução de trabalho 5 ul com uma concentração de 15 ng / nL, adicionar solução de estoque 3 ul MO e 0,5 ul de 0,5% de vermelho de fenol para 1,5 ul de água. NOTA: Com esta concentração de trabalho, cada gota (500 pl) de injeção contém 7,5 ng de MO e duas gotas conter 15 ng de MO. </li></ol> 2. Preparação do aparelho de injecção <ol><li> Vidro Compra agulhas pré-puxou (por favor, consulte a Tabela 1 para obter informações detalhadas). Como alternativa, puxe a agulha wi injeção de vidroth um puxador de agulha. </li><li> Ligue o compressor de ar e ajuste a configuração para 50 psi de pressão. Ligue a fonte de luz microscópio de dissecação e Pico bomba de micro-injecção e ajustar as configurações da seguinte forma: segurar a pressão de 20 psi, ejetar 10 psi de pressão, valor do período de 2,5 e 100 ms gama de gating. </li><li> Carregar o vidro pré-agulha puxada com 5 ul de solução de injecção e colocar a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Espere até que toda a solução atingir a ponta da agulha sem bolhas de ar visíveis. Inserir o suporte de agulha numa posição adequada ao lado do microscópio e inserir a agulha no suporte de vidro. Ajustar o ângulo de injecção de 45 graus. </li><li> Traga a ponta da agulha em vista ao microscópio, de alta para fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Quebre a ponta da agulha com uma pinça de ponta fina. </li><li> Coloque uma régua e um tubo capilar com diâmetro interno de 0,15 mm de lado a lado, sob o microscópio;injectar a solução em uma extremidade do tubo capilar para fazer uma coluna de líquido. Ajustar o tempo de ejecção para chegar a cada 17 gotas por 1 milímetro de comprimento da coluna de líquido, então o volume de cada gota nl é 1 (volume da gota π = raio x 2 x comprimento (coluna de líquido) / contagem (de gotas). NOTA: Uma gota com um diâmetro de 0,1 mm dá um volume de injecção de cerca de 500 pl (volume da gota = 4/3 x π raio x 3). </li></ol> 3. Preparação de Fertilized embriões Zebrafish e injeção com Morpholinos <ol><li> Configure Tg (wt1b: GFP) casais reprodutores de peixes-zebra transgénicos acordo com protocolos publicados para criação de peixe-zebra padrão e manutenção. Coletar embriões após desova natural, e mantê-los em uma placa de Petri 10 centímetros cheia de água E3 (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Comece injeção MO imediatamente 13. Monitorar morfologia do embrião sob o microscópio e certifique-se de injeção MO está no um-estágio de célula, ou o mais tardar no estágio de quatro células. <ol><li> Transferir os embriões para a placa de Petri 10 centímetros com cunha em forma de agar calhas. Aspirar a água E3 extra e pressione suavemente os embriões nas calhas. </li><li> Manipular os embriões com a micropipeta para visualizar embriões em estágio 1 de células ao microscópio de dissecação. Penetrar no cório e, em seguida, a gema para injectar uma ou duas gotas de MO na gema (1 gota = 500 pl). Transferir os embriões injectados com 10 cm de placa de Petri com água E3 e incubar a 28,5 ° C. </li></ol></li><li> Após as injeções, remover os embriões mortos e registrar o número de embriões injetados. Substitua a água E3 no prato a cada 24-48 horas. </li></ol> 4. Experimentos Fenótipo de resgate <ol><li> Selecione uma orthologue de outra espécie que tem uma estrutura de pares de bases principal diferente (geralmente 3-7 descasamentos de pares de bases) e é, portanto, resistentes à MO, para o salvamento. Por exemplo, neste experimento, escolhemosrato, porque a sequência de ratinho Wnt5a ARNm é diferente da sequência de peixe-zebra. </li><li> Conceber um conjunto de iniciadores com o iniciador directo de partida no local da translação e o iniciador reverso de perto para o fim da região de codificação do ARNm. Adicionar uma sequência do promotor de T7 na extremidade 5 &#39;da sequência iniciadora para a frente. Neste experimento, foram utilizadas as seguintes as seqüências de primers; para a frente: 5&#39;- taa tac GAC TCA tag cta gga cta tga tgc tgc tga AGC tga a- 3 &#39;e inverter: 5&#39;- TCA ctt gca GAC gta ctg gtc- 3&#39;. </li><li> Executar um 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) com o conjunto de iniciadores (0,5 uM de cada iniciador) concebido de cima e de 0,1 ug de ADN molde contendo a sequência de rato Wnt5a ADNc com o seguinte programa de PCR: 1 ciclo a 95 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 95 ° C (30 s), 58,5 ° C (30 segundos), 72 ° C (1 min); e passo de extensão final a 72 ° C durante 7 min. </li><li> Depois de terminar tele de bicicleta, correr 2 l do produto da PCR em gel de agarose 1% para garantir que a banda é o tamanho certo. Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Verifique concentração de DNA com um espectrofotômetro. Armazenar o produto de PCR purificado a -20 ° C ou se utilizar directamente na tampado transcrição de ARN no passo seguinte. </li><li> Sintetizar in vitro de mRNA tampado com um kit de síntese de ARN tampado acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se o ARNm em 20 ul de ARNase isenta de água e determinar a concentração. Alíquota da RNA e armazenar a -80 ° C. </li><li> No dia da injecção, preparar uma solução de trabalho do mRNA com água estéril livre de RNase. Note-se que 40 pg é geralmente a dose mais elevada de ARN em que os efeitos não específicos ou tóxicos do ARN não ocorrem. Manter a solução de trabalho em gelo. Injectar o embrião com MO e, em seguida, o mRNA de resgate, ou co-injectar os dois juntos. Por exemplo, se a concentração da prepar ARNmed no passo 4.5 é de 0,6 mg / mL, adicionar 0,67 mL de ARNm (0,4 ug) de 4,33 ul de ARNase isenta de água para fazer uma concentração final de 0,08 mg / mL, seguida de uma gota (500 pl) de cada injecção contém 40 pg do ARNm. Prepare MO como descrito na etapa 3. </li></ol> 5. Preparação de embriões injetados para imagens fluorescentes <ol><li> Após incubação a 28,5 ° CO / N, adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água para impedir a melanização E3, que afecta a observação da estrutura pronephros utilizando microscopia de fluorescência. No entanto, não adicione PTU antes gastrulação, porque afeta o desenvolvimento embrionário precoce. </li><li> Às 48 hpf, dechorionate manualmente os embriões com uma pinça fina. Tire fotos de 48 e 72 embriões HPF sob uma dissecção microscópio de luz. NOTA: Estas imagens podem ser tomadas sem anestesia. </li><li> Aproximadamente 10 minutos antes da imagiologia sob o microscópio de fluorescência, anestesiar os embriões, colocando-os emuma placa de Petri contendo 10 centímetros de 160 ug / ml tamponado tricaina. Aguarde 5-10 min, e em seguida, toque levemente o peixe-zebra para confirmar que eles não se movem e, portanto, a anestesia está funcionando. </li><li> Depois os embriões são anestesiados, montá-los em 3% metil celulose e orientá-los em uma posição propensa sob um microscópio de dissecação (consulte a Tabela 1). </li><li> Observe a estrutura pronephros sob um microscópio de fluorescência (consulte a Tabela 1) e tirar fotos em diferentes ampliações (10x e 20x). </li></ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
<li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pronephros%3A+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
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<li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo 14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas que se encontram...

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos 1 larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval 2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente simples quando comparado com os metanefros de mamífero, o terceiro e último rim para desenvolver em mamíferos. O néfron é a unidade de trabalho do rim, com cada rim humano que contenham entre 500,000-1,000,000 néfrons 3,4 e cada rim do rato tendo aproximadamente 13.000 néfrons 5, o que torna difícil observar a estrutura de néfrons único in rins humanos ou do mouse. O peixe-zebra tem apenas dois nefrónios, cada nefrónio peixe-zebra e contém todos os componentes principais encontrados nos glomérulos e túbulos de ratos e seres humanos 6 e tipos de células renais especializadas semelhantes. Comparado a outros modelos de vertebrados, como Xenopus, o néfron zebrafish mais se assemelha a de néfrons mamíferos porque tem um sistema fechado 7. Nos últimos anos, o genoma do peixe-zebra foi sequenciado, permitindo a ampla introdução de ferramentas genéticas, amplos recursos mutantes, e coleções de linhas repórter transgênicos em modelos de peixe-zebra. Os peixes-zebra pronephros formas entre 12-72 h pós fertilização (hpf) e podem ser facilmente visualizados em embriões transparentes. Proteína tumor do Wilm WT1 é um fator essencial para o desenvolvimento do rim. Linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostram GFP expression especificamente localizados em regiões pronephric em embriões de peixe-zebra, a partir de 17 hpf 8. Nephronophthisis (NPHP), uma doença do rim autossómica recessiva cística, é causada por mutações de genes NPHP 9. NPHP4 knockdown por morfolino causou a formação de cistos na Tg (wt1b: GFP). Fish 10 Portanto, este peixe transgênico é um modelo adequado para a observação de estruturas renais e formação de cistos durante o desenvolvimento do rim. Importante, a influência de moduladores de desenvolvimento do rim pode ser estudada usando esta estirpe em um tempo de trabalho e modo eficiente. Nosso trabalho descreve o uso de Tg (wt1b: GFP) de peixe como um modelo para visualizar a formação de cistos nos rins depois de modulação gene. Usamos partida e emenda local anti-sense MOs derrubar o gene Wnt5a no peixe-zebra. Wnt5a é uma glicoproteína segregada não canónicas da família Wnt, que desempenha um papel importante no desenvolvimento de vários órgãos e pós-natal celularfunção 11. Wnt5a funciona através de vias de Wnt não canónicas, incluindo a via de polaridade celular planar (PCP), que tem sido encontrado para desempenhar um papel na divisão celular orientada durante o alongamento tubular renal. Wnt5a regula a via Wnt / PCP, formando um complexo com o receptor de tirosina cinase semelhante (Ryk), que transduz mais Wnt5a sinalização através da formação de um complexo com a proteína da polaridade celular planar VANGL 2 (Vangl2), promovendo assim a estabilidade Vangl2 12. Os defeitos na via de PCP pode resultar na divisão celular aleatória e causar a formação de quistos renais. Utilizou-se o Tg (wt1b: GFP) linha peixe-zebra para observar a formação de cistos nos rins seguinte Wnt5a knockdown. A Tg (wt1b: GFP) modelo de peixe-zebra permite imagens ao vivo e observação oportuna da estrutura renal. Após Wnt5a knockdown, formação de cistos nos rins foi encontrado com início às 24 hpf; a 72 hpf, os cistos podem ser encontrados nos glomérulos e dos túbulos proximais. Este método também poderia ser usado para screen outros genes que podem causar a formação de cistos nos rins.

<table><tbody><tr><td>0,5% Fenol-Vermelho</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Indicador de cor para injeção</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td> <td>(personalizado)</td> <td>Personalizado projetado para o gene de interesse</td></tr><tr><td>Agulha pré-puxada</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>Se for necessária uma grande quantidade de agulha, você também pode comprar um extrator de agulha e preparar a agulha no laboratório</td></tr><tr><td>Kit T7 mMessage</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>Para transcrição in vitro para fazer mRNA tampado para experimento de resgate</td></tr><tr><td>N-Feniltioureia</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Para prevenção de melanização</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Também chamado de etil 3-aminobenzoato, para anestesia de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>Para posição de peixe-zebra&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Purificação PCR QIAquick&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Para purificação de produto de PCR para síntese de RNA cap.</td></tr><tr><td>Mistura Promega</td><td></td><td>U1511</td><td>do dNTP para a</td></tr><tr><td>polimerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td> do ADN da etiqueta do PCR <td>para</td></tr><tr><td>o espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td> do PCR <td>NanoDrop para o morpholino da medida e a concentração do RNA</td></tr><tr><td>Compressor de ar</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Fonte de ar para injeção</td></tr><tr><td>Bomba de microinjeção Pico</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Outros tipos de sistema de microinjeção podem ser usados.</td></tr><tr><td>Micro-fabricante</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Destro (MMJL para canhotos)</td></tr> <tr><td>Suporte de agulha</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>Para segurar agulha para micromanipulação</td></tr><tr><td>Dumont Pinças</td><td>Cirúrgicas Finas</td><td>Ferramentas 11253-20</td><td>Para quebrar a ponta da agulha</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica M205C&nbsp;</td><td></td><td>Para observação e imagem de embriões de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>Para imagens de peixe-zebra pronephros</td></tr><tr><td>Tubo capilar (ID 0,15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>Para medir o volume de cada gota injetada</td></tr></tbody></table>

um modelo possível zebrafish da doença renal policística: knockdown de wnt5a faz com cistos no peixe-zebra rins

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A doença renal policística (PKD) é uma das causas mais comuns de doença renal terminal, uma doença devastadora para a qual não há cura. Os mecanismos moleculares que levam à formação de cistos na PKD permanecem um tanto obscuros, mas acredita-se que muitos genes estejam envolvidos. Wnt5a é uma glicoproteína não canônica que regula uma ampla gama de processos de desenvolvimento. Wnt5a funciona através da via de polaridade celular planar (PCP) que regula a divisão celular orientada durante o alongamento das células tubulares renais. Descobriu-se que defeitos da via PCP causam a formação de cistos renais. Nosso artigo descreve um método para desenvolver um modelo de doença renal cística de peixe-zebra por knockdown do gene wnt5a com oligonucleotídeos wnt5a antisense morfolino (MO). O peixe-zebra transgênico Tg(wt1b:GFP) foi usado para visualizar a estrutura renal e os cistos renais após o knockdown de wnt5a. Dois MOs antisense distintos (AUG - e splice-site) foram usados e ambos resultaram em fenótipo de cauda encaracolada e formação de cistos após o knockdown de wnt5a. A injeção de mRNA Wnt5a de camundongo, resistente aos MOs devido a uma diferença na estrutura do par de bases primárias, resgatou o fenótipo anormal, demonstrando que o fenótipo não foi devido a efeitos "fora do alvo" do morfolino. Este trabalho apóia a validade do uso de um modelo de peixe-zebra para estudar a função wnt5a no rim.

Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múltiplos, incluind...

Descrevemos um método de geração de um possível modelo de peixe-zebra de doença renal policística. Usamos peixes Tg(wt1b:GFP) para visualizar a estrutura renal. O knockdown de wnt5a foi por injeção de morfolino. A formação de cistos pronéfricos após o knockdown de wnt5a foi observada neste peixe-zebra transgênico GFP.

Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de Wnt5a Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar um possível modelo de peixe-zebra de doença renal policística. Isso é conseguido injetando morph contra Wind five A em embriões de peixe-zebra transgênicos WT one BGFP no estágio de uma célula. Em seguida, um experimento de resgate é realizado por microinjeção de camundongo Wint cinco A Mr.Nna, com o Wint cinco um morfo.Em seguida, os embriões injetados são anestesiados e incluídos 48 e 72 horas após a fertilização, a fim de monitorar a estrutura renal e a formação de cistos. Após o knockdown do vento cinco A, os resultados mostram que o knockdown do vento cinco A causa a formação de cistos renais pronos em peixes-zebra transgênicos WT one BG FP com base na microscopia de fluorescência de estruturas renais pronas. As implicações dessa técnica se estendem à construção de um modelo de doença renal porque a transparência do êmbolo de peixe coberto com o uso de proteína fluor transgênica específica para o rim permite uma visão direta das estruturas renais em um organismo AL.Este método pode fornecer informações sobre a vitória cinco um knockdown causando a formação de cisto renal de peixe-zebra. Também pode ser aplicado para testar muitos outros genes suspeitos de causar a formação de cistos renais. Este protocolo é simples e menos demorado.Depois de projetar e sintetizar os morfos de acordo com as instruções do fabricante, adicione água estéril de alta qualidade às garrafas de vidro para ressuspender completamente até uma concentração final de 25 microgramas por microlitro. Use um espectrofotômetro para medir a concentração e armazene a solução estoque em temperatura ambiente no dia da injeção, use água estéril de alta qualidade para diluir os morfos até a concentração desejada e a 0.5% de vermelho de fenol até uma concentração final de 0.05% Em seguida, ligue o compressor de ar e ajuste a configuração de pressão para 50 si. Em seguida, ligue a fonte de luz do microscópio de dissecação e a bomba de microinjeção pico e ajuste as configurações da seguinte forma.Use cinco microlitros de solução de injeção para carregar uma agulha de vidro pré-puxada e coloque a agulha na posição vertical com a ponta apontando para baixo quando não houver bolhas de ar visíveis, insira a agulha no suporte. Ajuste o ângulo de injeção para 45 graus. Traga a ponta da agulha à vista ao microscópio, bem no alto do palco, e concentre-se na região mais fina da ponta.Em seguida, use uma pinça de ponta fina para quebrar a agulha. Dica, coloque um tubo capilar com um diâmetro interno de 0,15 milímetros sob o microscópio. Injete a solução em uma extremidade.Ajustando o tempo de ejeção na bomba de microinjeção pico até que 17 gotas formem uma coluna de líquido, com um milímetro de comprimento. Isso faz com que o volume de cada gota seja igual a um nanolitro. Configurar casais reprodutores de peixe-zebra transgênicos WT one BG FP de acordo com os protocolos publicados para criação e manutenção padrão de peixe-zebra.Após uma desova natural, colete embriões e transfira-os para uma placa de Petri com E três águas. Usando os embriões entre o estágio de uma e quatro células, transfira-os para uma placa de Petri de 10 centímetros com calhas helicoidais em forma de cunha. Depois de aspirar o meio, pressione suavemente os embriões nas calhas Sob o microscópio de dissecação, oriente os embriões para visualizar a célula.Em seguida, com a agulha de injeção, penetre o Corian e depois a gema para injetar uma ou duas gotas de morpho na gema. Transfira os embriões injetados para uma placa de Petri de 10 centímetros com E três água e incube a 28,5 graus Celsius. Registre o número de embriões injetados viáveis para realizar um experimento de resgate de fenótipo.Selecione um orto logaritmo de um gene de outra espécie que tenha uma estrutura de par de bases primária diferente que, portanto, seja resistente ao morfo. Neste exemplo, o mouse foi cinco A foi escolhido. Projete um conjunto de primers com o primer direto começando no local de início translacional e o primer reverso próximo ao final da região do código MR NA.Adicione uma sequência promotora T seven na extremidade cinco primos da sequência de primer direto com os primers e um micrograma de DNA molde contendo o vento do camundongo. Cinco sequências A-C-D-N-A. Configure uma reação de PCR de 50 microlitros e execute usando o programa mostrado aqui.Depois de verificar o tamanho do produto de PCR, purificá-lo e verificar a concentração, use um kit de síntese de RNA tampado para sintetizar o mRNA capeado in vitro. De acordo com as instruções do fabricante, use 20 microlitros de água livre de RNAs para diluir o MR NA e determinar a alíquota de concentração e armazene o RNA a 80 graus Celsius negativos no dia da injeção. Preparar uma solução de trabalho de MR NA que irá fornecer uma dose de 40 picogramas ou inferior para evitar efeitos inespecíficos ou tóxicos para o embrião.Manter a solução de MNA no gelo injeta morfoses e, em seguida, mRNA nos embriões ou co-injeta as soluções. No dia seguinte, remova os embriões mortos e verifique se os embriões sofreram gases. Em seguida, adicione 0,003% de fenil THREA ou PTU à água E três para evitar o melão 48 horas após a fertilização.Use uma pinça fina para revestir manualmente os embriões antes de usar um microscópio de dissecação para tirar imagens imediatamente e 72 horas após a fertilização, aproximadamente 10 minutos antes da imagem sob um microscópio de fluorescência, anestesiar os embriões colocando-os em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo 160 microgramas por microlitro de trica tamponada. Use 3% de metilcelulose para montar os embriões e, sob um microscópio de dissecação, oriente-os em decúbito ventral. Em seguida, usando imagem de ampliação de 10 vezes e 20 vezes.Os embriões sob um microscópio de fluorescência wind five Um knockdown foi alcançado pela introdução de morpho bloqueador de tradução, também chamado de morpho UG ou morpho de emenda de borda de introdução de éxon, também chamado de morpho de emenda para embriões de peixe-zebra. No estágio de uma célula, o morfo A UG tem como alvo o códon inicial e, portanto, inibe a expressão materna e zigótica de cinco a win. A morfologia de emenda tem como alvo o terceiro local doador de emenda e inibe apenas o transcrito zigótico de ganhar cinco A Como demonstrado aqui, o UG A e as morfinas de emenda se copiaram fenologicamente com vários defeitos, incluindo cauda encaracolada, eixo do corpo para baixo e edema pericárdico.Esta figura mostra que o camundongo foi cinco um mRNA resgata parcialmente o fenótipo de morfologia, demonstrando que não é devido aos efeitos fora do alvo mostrados aqui. O peixe transgênico WT one BGFP expressa GFP impulsionado pelo promotor WT one B e delineia a estrutura profic. Os peixes apresentaram formação de cistos glomerulares após o vento cinco a knockdown 48 horas após a fertilização.Os peixes controle injetados apenas com vermelho de fenol apresentaram desenvolvimento frico propenso normal, formando glomerular fundido em forma de U com túbulos que se estendem lateralmente às 72 horas após a fertilização. As estruturas glomerulares se desenvolveram ainda mais com alças vasculares e os embriões injetados com A UG e splice morph desenvolveram cistos nos glomérulos e tubos proximais, como visto nesta figura coloração HNE das seções histológicas transversais de 72 horas após a fertilização, embriões morantes revelaram formação de cistos, estruturas glomerulares interrompidas e tubos renais dilatados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um possível modelo de fase gery de doença renal cística por knockdown do envelhecimento do vento e observar a formação do sistema com a linha facial do relatório de gripe.Uma vez demonstrado que a mutação genética resulta na formação de cistos renais em peixes-zebra, outros experimentos podem ser conduzidos para investigar os mecanismos detalhados de formação de cistos renais.

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