Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

O objetivo geral do experimento a seguir é derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos reprogramadas baseadas em lentivírus e converter essas células em condições putativas de grau clínico. Isso é feito primeiro reprogramando fibroblastos humanos dérmicos adultos com um único de células-tronco lentivirais de tamanho ex ou carro de haste em HI PSCs. Em seguida, as PSCs HI reprogramadas são expostas ao vírus adeno Cree purr para excisão completa e remoção do carro-tronco do genoma do hospedeiro.

Em seguida, a extração de DNA genômico dos PSCs HI livres de alimentadores, seguida pela análise de agel, confirma a excisão adequada do carro do caule. Finalmente, os IPCs do fator três H são convertidos em condições putativas de grau GMP por uma metodologia de conversão lenta em condições livres de xeno totalmente definidas. Em última análise, a reprogramação viral de fibroblastos dérmicos adultos humanos e a conversão total dos H IPCs em condições de grau clínico ressaltam a ampla aplicabilidade dessa metodologia para reprogramar células humanas adultas e convertê-las em condições clinicamente relevantes.

As implicações dessa técnica se estendem às aplicações clínicas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, pois são completamente livres de fatores e convertidas em condições de grau clínico, tornando-as compatíveis com a terapêutica humana. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de reprogramação, excisão e conversão de grau clínico são difíceis de aprender devido aos principais procedimentos intrincados e específicos que devem ser seguidos para produzir o fator três e as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de grau clínico para iniciar o descongelamento. Fibroblastos humanos dérmicos adultos ou HAFs em banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos.

Tomando cuidado para não submergir a parte superior do frasco na água. Coloque a pasta de um mililitro de células em um frasco de crônica de 15 mililitros para ressuspender as células e diluir o DMSO gota a gota. Adicione lentamente quatro mililitros de meio de huff pré-aquecido centrifugue o violeta 200 vezes G por 10 minutos de temperatura ambiente.

Em seguida, aspire o sup, nacent e reus. Suspenda as células em meio a 100.000 células por mililitro em um poço de uma placa de seis poços a 0,2% de gelatina. Adicione dois mililitros da suspensão celular e, em seguida, adicione dois mililitros de suspensão a um segundo.

Bem, para ser usado para medir a multiplicidade de infecção ou MOI, balance a placa de um lado para o outro e para frente e para trás para distribuir uniformemente as células antes de incubá-las durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada. 24 horas depois, após a contagem das células, descongele duas vezes, centralize as oito unidades de transdução ou S de concentrado lentiviral equivalente e use o meio huff para diluí-lo para uma vez 10 aos oito ts por mililitro usando meio meio suplementado com oito microgramas por mililitro de reagente de transfecção. Transduzir as células em uma multiplicidade de 10 de taxa de infecção.

Misture os poços de transdução uniformemente e incube durante a noite aproximadamente 24 horas após a transdução lentiviral. Remova o meio huff e substitua-o por células-tronco pluripotentes humanas padrão ou meio PSC. Mude o meio diariamente nos dias dois a seis no sexto dia em dois pratos de 10 centímetros revestidos com gelatina a 0,2% placa 1,5 a 1,75 vezes 10 para os seis fibroblastos embrionários de camundongos derivados do fator componente do complemento um ou camundongos CF um em meio no dia sete.

Adicione viagens à temperatura ambiente em um poço de uma placa de seis poços dos fibroblastos reprogramados. Ela gentilmente levanta as células e gira um G 100 vezes com placa média PSC humana fresca todas as células em uma proporção de um para 16 em duas placas de metanfetamina CFI de 10 centímetros. Distribuir os agregados num movimento espiral no sentido dos ponteiros do relógio e incubar durante cerca de 48 horas antes de substituir o meio.

Após três a quatro semanas, use uma agulha de calibre 21 para pegar de oito a 10 pedaços individuais de colônias específicas com morfologia típica de ESC e subclone-os em poços individuais de CFI MFS após a expansão. Confirme se as células são pluripotentes por formação do corpo embrionário e análise da expressão do marcador após verificar o local de integração do carro-tronco, conforme descrito no protocolo de texto anexo. Carro de haste de consumo aspirando primeiro o antigo meio PSC humano em três mililitros de meio PSC padrão combinados.

45 microlitros de adeno Cree pur ou vírus concentrado com oito microgramas por mililitro de agentes de transfecção. Em seguida, adicione às células e incube por 24 horas após a incubação, aspire o supinato viral, induza o meio PSC humano a lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione o meio HPSC com dois microgramas por mililitro de micina pura e substitua diariamente após cinco dias, subclone as colônias restantes e expanda-as conforme descrito anteriormente no vídeo.

Em seguida, descongele um frasco de matriz de membrana basal pré-Eloqua em gelo e dilua o meio basal frio até uma concentração final de um a 30. Use um mililitro por poço para revestir o número desejado de poços de uma placa de seis poços e deixe a placa descansar em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, usando uma agulha de calibre 18, cruze pelo menos 20 a 30 colônias de um poço previamente revestido com mes.

Tome cuidado para reduzir a elevação e a transferência das células da placa. Após uma hora de incubação, aspirar a matriz do poço revestido com uma pipeta de 200 microlitros. Remova os pedaços das colônias raspando-os suavemente da placa velha e coloque-os cuidadosamente em três mililitros de meio recém-combinado, um em uma placa revestida com matriz.

Após incubação por 48 horas, troque o meio diariamente quando os PSCs HI convertidos pós-extirpados e sem alimentador atingirem 80% de fluência co. Use um kit comercial de extração de DNA para extrair o DNA genômico usando os primers mostrados aqui que são específicos para integrações exógenas do lentivírus do carro-tronco. Analise o DNA por PCR para excisão adequada para fazer a transição dos PSCs HI pós-extirpados para condições de grau GMP.

Misture HPSC combinado meio um e meio compatível com GMP de grau clínico ou meio combinado dois em uma proporção de 80 a 20 pré-aquecimento a 37 graus Celsius. Aspire o meio combinado antigo das células e substitua por três mililitros da nova solução de meio quente. Substitua o meio diariamente por três dias passando de acordo com o protocolo de texto para manter o tamanho e a densidade adequados da colônia no quarto dia, substitua o meio por uma mistura 50 50 de meios combinados quentes um e dois incubar por três dias.

Substituindo o meio diariamente no sétimo dia, mude para uma proporção de 20 a 80 de meios combinados aquecidos um e dois, respectivamente, e substitua diariamente por três dias. No dia 10, mude para o meio morno 100% combinado e mude diariamente. As células estão agora em meio livre de xeno completamente definido.

Em seguida, depois de usar um substrato livre de xeno definido para revestir um poço de uma placa de seis poços, substitua o meio livre de xeno em um poço de células de confluência por meio fresco contendo uma rocha x. Depois de incubar por uma hora, use uma agulha de calibre 18 para mecanicamente as células recém-preparadas. Bem, permita que as células incubem sem serem perturbadas por dois dias para permitir a fixação máxima antes de caracterizar as células de acordo com o protocolo de texto.

Esta figura mostra uma imagem representativa de três diferentes linhas H-I-P-S-C pré-excisadas após a reprogramação com a abordagem do carro-tronco em uma camada de mes mostrada aqui está o gel de PCR de transcrição reversa pós-excisão mostrando um subclone específico completamente livre do lentivírus do carro-tronco, como evidenciado pela falta de uma banda de amplicon específica para uma sequência específica endógena ao carro-tronco. Nesta figura, os IPCs pré-convertidos em uma matriz contendo xeno e os IPCs pós-excise livres de GMP grau H sem xeno em matriz sintética são mostrados quantificação de fatores associados à pluripotência padrão, incluindo SOX dois, OCT quatro e nanog. O uso do QPCR é ilustrado aqui.

Finalmente, como visto aqui, PSCs HI pré-convertidos e pós-convertidos para condições de grau GMP foram testados por citometria de fluxo para o ácido siálico e ácido neurônico glicol indicativo de antígenos não humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reprogramar fibroblastos dérmicos adultos humanos com o vírus de reprogramação stemco, extirpar o vírus do genoma e, em seguida, converter totalmente essas HI PSCs em condições de grau clínico totalmente compatíveis com a terapêutica humana. Não se esqueça de que trabalhar com staca, um vetor antiviral de terceira geração, pode ser extremamente perigoso e precauções.

Um EPI adequado e uma sala de cultura de tecidos VSL dois plus devem ser usados durante a realização deste procedimento.