Name: Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprenda a reprogramar fibroblastos dérmicos humanos adultos em células-tronco pluripotentes induzidas livres de fatores usando vetor lentiviral. Este método demonstra a conversão para condições clínicas de grau GMP.

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Gostaríamos de agradecer a Patrick C. Lee, Cyril Ramathal e Saravanan Karumbayaram (SK) por sua assistência na realização dos experimentos de derivação e caracterização do iPSC; Aaron Cooper pela realização dos experimentos de análise iPSC; Vittorio Sebastiano e Renee A. Reijo Pera por dirigir os esforços iniciais de reprogramação; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack e Donald B. Kohn por dirigir o estabelecimento das instalações de GMP da UCLA permitindo a conversão e caracterização de iPSCs de grau clínico; Gustavo Mostoslavsky por nos fornecer o vetor de reprogramação policistrônica STECCA. Este trabalho é baseado em uma colaboração de pesquisa com a Fibrocell Science e a Iniciativa de Investigações Clínicas para Derivados Obtidos Mesenquimalmente Dérmicos (CIDMOD) para gerar terapias celulares personalizadas seguras. Este trabalho foi apoiado por financiamento do Centro Eli e Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Pesquisa de Células-Tronco da UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. e do UCLA CTSI Scholar's Award to JAB.

NOTA: Este método foi utilizado na pesquisa, publicada no incrédulo et al 10.. 1. Reprogramação Adulto Human dérmica fibroblastos com STEMCCA <ol><li> Fibroblastos dérmicos humanos (adultos Descongelar HUFS), passagem 4 ou inferior, num banho de água a 37 C ° durante 2 min, tomando cuidado para não mergulhar a parte superior do frasco com água. </li><li> Colocar a suspensão de 1 ml de fibroblastos humanos para um frasco cónico de 15 ml e colocar-se lentamente 4 ml de meio de florins padrão, pré-aquecido a 37 ° C, de uma forma gota a gota, para diluir a sulfóxido de dimetilo (DMSO) e suspender novamente as células. </li><li> Centrifuga-se o frasco a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células num volume adequado de meios para criar uma suspensão de 100.000 células / ml e, em seguida, adicionar 2 ml para um poço de uma placa de seis poços, pré-revestidos durante 20 min com 0,2% de gelatina. NOTA: A irmã bem com igual número de células por linha e condição precisa ser semeado for a contagem de células / multiplicidade de infecção de cálculo (MOI). </li><li> Rocha lado da placa para o lado e para trás e para distribuir uniformemente as células. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. </li><li> No dia da transdução, obter a contagem de células (s) a partir da irmã poço (s) de aproximadamente 24 h após o plaqueamento inicial florins. </li><li> Descongelar 2 x 10 8 TU, ou, concentrado lentivírus equivalente (STEMCCA) e diluir a 1 x 10 8 TU / ml em meio HUF. </li><li> Transduzir células em uma relação de 10-MOI em meios de florins suplementado com 8 ug / ml de agente de transfecção. Misturar uniformemente poços transduzidos e incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. </li><li> Cerca de 24 horas após a transdução de lentivírus, alterar a mídia HUF a célula-tronco pluripotentes humanas (PSC) médio padrão. </li><li> Nos dias 2 a 6, mudar media diária com meio PSC humano. </li><li> No dia 6, dois placa 0,2% placas revestidas com gelatina de 10 cm de1,5-1,75 x 10 6 MEFs derivadas de ratinhos CF1 em media 12 florins. </li><li> No dia 7, tendo o cuidado de não mais do que a centrifugação de 100 x g, temperatura ambiente utilização de tripsina para retirar os fibroblastos reprogramadas dia 7 de um poço da placa de seis poços e passagem a uma razão 1:16, por plaqueamento de todas as células uniformemente entre duas placas de 10 cm, com a mídia PSC humano fresco, que foram semeadas com MEFs no dia anterior. Distribuir os agregados de células num movimento em espiral no sentido horário e no lugar de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado incubadora durante a noite. </li><li> Cerca de 48 horas após a semeadura das células reprogramadas para MEFs e todos os dias a partir daí, mudar para fora da mídia PSC humanos gastos com meios frescos. </li><li> Após 3 a 4 semanas, escolher colónias individuais com morfologia típica CES como com uma agulha de calibre 21 e subclonar-se em um prato de 24 poços colocando aproximadamente 8 a 10 partes individuais de colónias específicas em poços individuais de uma solução a 0,2% de gelatina-revestido placa de 24 poços de pré-lançamentoed com MEFs derivadas de ratinhos CF1 em meio PSC humano. NOTA: Após a expansão das colônias escolhidas, as colônias têm de ser caracterizado como pluripotentes por formação de corpo embryoid e análise de marcadores de pluripotência expressão ao nível da proteína. </li></ol> 2. Vector Integração Análise Site e STEMCCA Excisão <ol><li> Analisar o local de integração STEMCCA por amplificação linear não restritiva de PCR tal como descrito 10. </li><li> Depois de ensaiar a assegurar uma integração numa área desejada do genoma, consumo STEMCCA fora, aspirando o meio de ESC humano de idade. Em seguida, combinar 45 ul de concentrado de vírus adeno-Cre-PuroR com 8 ug / ml de agente de transfecção em 3 ml de meio de PSC padrão durante 24 horas. </li><li> Após o período de incubação de 24 horas, aspirar o sobrenadante virai misto e lavar as células duas vezes com meio de PSC humanos. Coloque frescos media PSC humanos, juntamente com 2 mg / ml ï¿½puromicina por um período de 5 dias, mudando a mídia sagacidade diáriah meios frescos e antibiótico. </li><li> Após 5 dias, subclone restantes colónias com uma agulha de calibre 21 para 0,2% de poços revestidos com gelatina, em uma placa de 12 poços pré-revestidos com MEFs derivados de CF1mice e expandir conforme detalhado acima. NOTA: Depois de expansão suficiente para se obter uma massa congelada, a conversão em condições isentas de alimentação é necessária. Espere pelo menos 95% de morte colônia de células-tronco, como a maioria das células não vai ser transduzidas com sucesso e vai sucumbir ao antibiótico durante o período de cinco dias de incubação. Embora adeno-Cre-PuroR integra a uma eficiência de 0,001-1% em cromossomas hospedeiros de células infectadas, reexposing uma amostra livre de colónias do factor-a puromicina para garantir 100% de morte celular não irá confirmar a integração ocorreu 13. </li><li> Descongelar uma ampola de matriz de membrana basal pré-aliquotado em gelo, ao longo de um período de aproximadamente 2 horas (as recomendações do fabricante), até que a matriz é um líquido e diluir para uma concentração final de 1:30 em meio basal frio. Cono número desejado de poços numa placa de seis poços com 1 ml por poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> -Cross hatch (utilizando uma agulha de calibre 18, ou um vidro ou plástico &quot;ponta&quot;), pelo menos, 20 a 30 colónias a partir de um poço revestido previamente com MEFs. Tenha o cuidado de reduzir MEF edificante e transferir de placa. <ol><li> Gerar o dispositivo de tracejado cruzado através de um número de diferentes abordagens, a partir do aquecimento mais complicados, que puxa, e acabamento de uma pipeta de Pasteur de vidro para uma chama, para o simples uso de uma ponta de pipeta de plástico estéril ou, como no nosso caso, 21- e / ou 18 de bitola agulhas. </li></ol></li><li> Aspirar a matriz do poço após incubação revestido. </li><li> Remover pedaços de colônias por raspagem suave da placa de idade, com uma pipeta de 200 mL e coloque cuidadosamente em 3 ml de mídia combinadas frescos 1 na placa revestida com matriz. Incubar durante a noite em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 humidificada. Troca de mídia 48 horas após passaging. </li><li> Extrai-se o ADN genómico a partir de pós-hiPSCs excisada e sem alimentação convertidos, em mais de 80% da confluência, utilizando kits de extracção de DNA comercial. </li><li> Analisar por excisão adequada com primers específicos para integrações exógenos do lentivírus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-reverse, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Reconstituir primers liofilizados com água PCR-grade para uma solução estoque de 10 mM. </li><li> Executar uma RCP com o protocolo de cinco passos que se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de cada um dos seguintes: desnaturação a 98 ° C durante 20 seg, emparelhamento de iniciador a 62 ° C durante 15 segundos, e extensão a 72 ° C durante 15 seg; seguido por um único ciclo de extensão final a 72 ° C durante 3 min. </li><li> Adicione um gel de agarose a 3% em peso a 1,5 gramas de agarose e colocando-o em 50 ml de tampão 1x Tris-acetato-EDTA. Micro-ondas até agarose é dissolvido e coloque em mancha gel DNA em pdiluição roper, misturar e dispensar volume adequado em cassete gel para solidificar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Carga 12 uL de produto de PCR misturado com 3 ul de corante de carga em gel de agarose a 3%. Submeter o gel durante 30 min a 80 V. </li><li> Visualizar com luz ultravioleta para a ausência de uma banda que indica a excisão correcta. </li></ol> 3. A determinação quantitativa de Diferenças Gene expressão usando PCR quantitativo de Pré e Pós-hiPSCs excisadas <ol><li> Extrato de RNA total de hiPSCs pós-excisadas e livre-feeder convertidos por meio de kits de extração de RNA comerciais. </li><li> Reverse-transcrever-se a 1 ug de ARN total, utilizando-se kits comerciais, de acordo com as instruções do fabricante. Use ancorado-oligo (dT) 18 e os iniciadores de hexâmeros aleatórios. NOTA: Certifique-se de que o protocolo de PCR é adaptada para transcritos do gene de mais de ou menos de 4 kb. Primers específicos terá de ser feito para i qualquer gene STEMCCA originalmente integradonto. </li><li> Reconstituir o iniciador de PCR liofilizado com água de grau de uma solução estoque de 20? M. </li><li> Use de amostra de 5 ng por 20 ul de reacção que consiste de sonda UPL 10 uM, 2x LightCycler 480 Sondas mestre, e 20 uM iniciadores directos e inversos. </li></ol> 4. A conversão em condições GMP-grade <ol><li> No primeiro dia de transição os hiPSCs pós-extirpado durante a condições GMP grau, fazer uma mistura dos meios de comunicação que consiste em PSC humano combinado de mídia (media um combinado 1) e grau clínico boas práticas de fabrico (BPF) de mídia compatível (media combinados 2 ) a uma razão de 80:20. </li><li> Aspirar fora as velhas mídias combinadas 1 e colocar 3 ml de novos meios de comunicação combinados 1 e 2, pré-aquecido, na proporção 80:20. Mudar meios diariamente durante 3 dias com esta proporção específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia 4, fazer a mídia combinado 1 e 2 numa proporção de 50:50. Aspirar fora o velho médio e subste com a mídia pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2, na proporção 50:50. Mudança de mídia durante 3 dias com essa relação específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia 7, fazer a media combinado 1 e 2 na proporção 20:80. Aspirar off do meio velho e substitua-o por meio de pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2, na proporção 20:80. Mudança de mídia durante 3 dias com essa relação específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia 10, fazer os meios de comunicação combinados 1 e 2 em um 0: relação de 100. Aspirar off do meio velho e substitua-o por meio de pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2 no 0: relação de 100. Mudança de mídia todos os dias na mesma proporção específica. As células estão agora em meio isento de xeno completamente definido. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. NOTA: Durante todo este processo de conversão, de passagens em rotina com uma agulha de calibre 18 que é necessário para manter o tamanho da colónia e densidade adequada. Plano de passaging células a cada 4 a 5 dias com base no tamanho da colónia, a confluência, e diferenciação. </li><li> Uma demão poço numa placa de seis poços com um substrato isento de xeno definido como recomendado pelo fabricante. </li><li> Passagem Mecanicamente confluente bem, já convertido em condições mídia xeno-livre, a partir de uma placa de seis bem com uma agulha de calibre 18. Importante, colocar novos media (mídia combinados 2) sobre as células com 1x inibidor ROCHA, durante 1 hora, antes de passaging a pré-condição da mídia. </li><li> Aspirar a solução de substrato sintético para fora da nova placa que as células estão a ser transferido para. Remova todas as mídias contendo os aglomerados de células-tronco a partir da placa de idade e transferir para a nova placa. </li><li> Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 dias, com um mínimo de perturbação física (de preferência placas, uma vez dentro da incubadora, não são directamente atingidas de qualquer forma) para permitir a ligação máxima. NOTA: As células exigirá mudanças mídia diárias. Passagin Continuadag cada 4 dias, será importante. Usando uma agulha de calibre 21, de passagem apenas as partes de colônias com morfologia ESC-como ótima (relação núcleo alto). Isso irá garantir seleção para colônias hiPSC adequadas que vai crescer bem e, eventualmente, produzir colônias homogêneas. Tempo total de derivação da ESC como colônias é entre 15-20 dias após a mudança de mídia combinado inicial. </li><li> Congelar para baixo as hiPSCs post extirpado GMP grau pelo primeiro cross-hatch todas as colônias, utilizando uma agulha de calibre 18. Remover todas as partes fora usando uma pipeta de 200 uL e transferir todos os meios contendo as células para um frasco cónico de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Enquanto as células são centrifugação, fazer um meio de congelamento que consiste em volumes iguais de meio frio combinadas 2 e meio de congelação, com uma concentração final de DMSO de 7,5%. </li><li> Depois de células são sedimentadas, aspirar off meio de idade e gota a gota, re-suspender o pellet com a mídia de congelamento. Imediatamente transfer para frascos de congelamento e colocar em um freezer -80 ° C. </li></ol> 5. hiPSCs Caracterizar GMP-grade Post-excisadas <ol><li> Para assegurar a expressão apropriada de marcadores de pluripotência pós-conversão, uso de QPCR para quantificar a expressão de marcadores de pluripotência chave (SOX2, OCT4, e NANOG) utilizando os iniciadores listados na Tabela 1 com os mesmos passos como mencionado no passo 3. QPCR metodologias a seguir mesmos passos listados na etapa 3. </li><li> Use a citometria de fluxo para detectar o ácido não-humano siálico Neu5Gc (ácido -glycolylneuraminic N), de acordo com as condições padrão listados no kit como publicado anteriormente 10. </li><li> Lavar suavemente as placas de cultura celular com células, utilizando solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS). </li><li> Dissociar colónias usando reagente de dissociação 1x durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Durante o tempo de incubação de 5 min do passo 5.4, preparar a solução de bloqueio (fornecida emkit), fazendo um 0,5% Agente de bloqueio em PBS gelado. </li><li> Rotular o seguinte conjunto de tubos para análise de citometria de fluxo: Unstained; 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) DAPI; Anticorpo de controlo 1: 200; Anticorpo primário 1: 200; Anticorpo secundário 1: 200 de burro anti-IgG de galinha (H + L); MEFs amostra; Células pós-extirpado amostra na matriz; e células em substrato sintético Sample pós-extirpado. </li><li> Gentilmente desalojar agregados celulares a partir da etapa 5.4, adicionando 2 ml de bloquear conteúdos de solução e de transferência para um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 80 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células duas vezes com solução de bloqueio e centrifugar tal como indicado no passo 5.7. </li><li> Gentilmente re-suspender aproximadamente 1 x 10 6 células em 100 ul de solução de diluição com o volume correspondente de cada anticorpo bloqueador. Incubar, com agitação suave a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Repetir lavagens três vezes como no passo 5.8. </li><li> Re-suspender o pellet celular em 400 mL de diluente Buffer (do kit) com 1: 100 de DAPI para tubos de 2, 6, 7 e 8, conforme listado na etapa 5.6. </li><li> Células tensão através de uma peneira de 40 mM e executado através de citometria de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+field+of+induced+pluripotency%3A+Recent+progress+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li>
<li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li>
<li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells%3A+many+rabbits+in+the+hat%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
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</ol>

James A. Byrne (JAB) e Agustin Vega-Crespo recebem financiamento de pesquisa da Fibrocell Science, Inc. JAB é consultor científico da Fibrocell Science, Inc. Nenhum outro autor tem interesses conflitantes a divulgar.

Nós descrevemos uma metodologia de derivar hiPSCs livre de fatores e de fazê-los clinicamente relevante, convertendo essas células em condições GMP grau de diferenciação celular downstream em futuras terapêuticas humanas. Embora este protocolo é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células, optou-se por reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, devido à facilidade de extracção a partir do paciente e a sua aplicabilidade terapêutica humana personalizados. Uma vez que as limitações forem corrigidas, tanto qua...

As células humanas adultas demonstraram ser capazes de sofrer remodelação e reprogramação epigenética, como resultado da expressão baseada em lentivírus de quatro fatores-chave de transcrição4,5. Um avanço importante no campo da reprogramação foi o uso de um único de células-tronco lentivirais excisáveis (STEMCCA), que abrigava todos os quatro fatores de transcrição de reprogramação que permitiam uma proporção estequiométrica precisa da expressão da proteína6. Além disso, quando transduzido em uma multiplicidade específica de faixas de infecção, o STEMCCA pode levar a eventos de integração genômica predominantemente únicos durante o processo de reprogramação7. A introdução de uma versão excisável do STEMCCA, que utiliza a tecnologia Cre / loxP seguida pela excisão do vetor de reprogramação após a derivação da linhagem de células-tronco, permitiu que linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) livres de fatores fossem derivadas8. Além disso, a fim de melhorar as aplicações terapêuticas de hiPSCs, uma metodologia nova, rápida e prontamente aplicável para a conversão de linhagens celulares de grau de boas práticas de fabricação (GMP), de condições contendo xeno para condições livres de xeno, precisava ser implementada. Aqui, discutimos uma metodologia relevante que avalia com mais precisão as diferenças de expressão gênica integrada, especificamente quando integradas a um íntron, e a conversão celular de grau clínico em condições putativas de GMP. 
Pesquisas anteriores usaram apenas análises transcricionais de microarray relativamente insensíveis para analisar as diferenças de expressão gênica em genes integrados após a transdução de STEMCCA3,9. Aqui, apresentamos a metodologia de análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa sensível, para examinar melhor as diferenças de expressão gênica integrada. É importante ressaltar que os critérios atuais de porto seguro descartam hiPSCs que possuem genes com integrações virais, limitando assim a aplicabilidade dessas células para terapêutica celular humana a jusante9. Propomos que o status quo pode mudar com o uso de hiPSCs intronicamente reprogramados totalmente caracterizados e livres de transgenes. Além disso, introduzimos um protocolo robusto de conversão celular de grau GMP que pode ser prontamente aplicado a uma variedade de tipos de células diferentes, que foram originalmente derivadas em condições contendo xeno10. Isso oferece oportunidades significativas para o desenvolvimento de futuros experimentos de reprogramação celular, que requerem condições de nível clínico para manter a relevância terapêutica humana. 
Essas metodologias fornecem uma base sobre a qual os critérios atuais de porto seguro podem ser expandidos para incluir linhas hiPSC reprogramadas por STEMCCA caracterizadas que mantêm um perfil de expressão gênica normal após a excisão de STEMCCA do íntron integrado. Além disso, a conversão completa em condições de grau clínico, livres de antígenos animais não humanos, ajudará a incorporar muitos outros tipos de células, que foram previamente reprogramadas e caracterizadas apenas em condições contendo xeno. Essas metodologias, combinadas, são motivos persuasivos para a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA considerar a expansão de sua aprovação limitada de terapias baseadas em células-tronco embrionárias humanas (ESC) para terapias baseadas em hiPSC11. 
Recentemente, detalhamos a derivação de uma linha hiPSC livre de fator que foi totalmente caracterizada e convertida em condições putativas de grau clínico10. Aqui, detalhamos o protocolo para derivação de hiPSC utilizando o lentivírus STESCCA. Essas células-tronco passam por um processo de excisão seguido pela caracterização da expressão gênica. Finalmente, os hiPSCs são convertidos em condições de grau GMP por uma metodologia de conversão lenta.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Meios e reagentes</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (meio basal)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo (MEM) aminoácidos não essenciais (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Descongelar a 4 &graus; C, alíquota e armazenar em &minus; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Knockout substituição do soro</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Descongelar a 4 &graus; C, alíquota e armazenar em &minus; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,5%</td> <td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Diluir o estoque até 0,05% em 1x PBS</td></tr><tr><td>Fator básico de crescimento de fibroblastos</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, EUA)</td> <td>GSR-2001</td><td>Reconstituir para 10 &micro; g/ml de estoque em 0,1% de albumina de soro bovino dissolvido em 1x PBS e armazenar em &minus; 80 &graus; C</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Millipore (Billerica, MA, EUA)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matriz de membrana basal)</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, EUA)</td><td>356231</td><td>Dilua o frasco de Matrigel com 10 ml de DMEM/F12 enquanto estiver em gelo para uma diluição de 1:2. Alíquota e loja em &minus; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>CELLstart (Substrato Sintético)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, EUA)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Sondas LightCycler 480 Master</td><td>Roche (Basileia, Suíça)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Médio/meio de congelamento</td><td>Lonza (Basileia, Suíça)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)</td> <td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EUA)</td> <td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Faça estoque a 0,2% em PBS, autoclave e armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canadá)</td><td>5850</td><td>Combine o suplemento 5x com o meio básico, alíquota e armazene a 4 &deg; C por até 2 semanas.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Meio de Cultura</td><td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>Descongelar a 4 &graus; C O / N, alíquota e armazenar em 4 &deg; C por até 2 semanas.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, EUA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (Reagente de Dissociação)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EUA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Agente de polibreno/transfecção</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</ placas > 12</td></tr> <tr><td>poços</td><td>VWR (West Chester, PA, EUA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 10 cm</td> Agulha <td>de calibre 18</td><td>Sigma-Aldrich</td> Z688819 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de calibre 21</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Flow Cytometer</td><td>KSystem by Nikon (Tóquio, Japão)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Versão 6.1.3 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, EUA)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcritor Kit de síntese de cDNA de primeira fita</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack</td><td>Kit Sialix (Newton, MA, EUA)</td><td>Pacote básico</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Media</td></tr><tr><td>Mídia combinada 1</td><td>StemCell Technologies e Stemgent</td><td></td><td>Consiste em partes iguais de mTeSR1 e Nutristem</td></tr><tr><td>Meios combinados 2</td><td>StemCell Technologies e Stemgent</td><td></td><td>Consiste em partes iguais de TeSR2 e Nutristem</td></tr><tr><td>HUF Media</td><td></td><td></td><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio/F12 [DMEM/F12] suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1x aminoácidos não essenciais, 1x Glutamax e 1x Primocin</td></tr><tr><td>Meio de células-tronco</td><td></td><td></td> pluripotentes humanas <td>DMEM/F12 suplementado com 20% de reposição de soro knockout, 1x Glutamax, 1x aminoácidos não essenciais, 1x Primocin, 1x &beta;-mercaptoetanol e 10 ng/ml de fator básico de crescimento de fibroblastos.</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco' s Águia modificada' s médio/F12; PBS, solução salina tamponada com fosfato.</td></tr></tbody></table>

derivação e caracterização de um free-transgene human induced pluripotent stem cell line e conversão em definidas condições clínicas de grau

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Humanos induzida células estaminais pluripotentes (hiPSCs) pode ser gerado com metodologias de reprogramação à base de lentivírus. No entanto, os traços de genes potencialmente oncogénicos restantes em regiões activamente transcritas do genoma, limitar o seu potencial para a utilização em aplicações terapêuticas humanas 1. Além disso, os antigénios não-humanos derivados de reprogramação ou a diferenciação de células estaminais em derivados terapeuticamente relevantes impede as referidas hiPSCs de ser usado num contexto clínico humano 2. Neste vídeo, apresentamos um procedimento para a reprogramação e analisar hiPSCs livre de fator livres de transgenes exógenos. Estes hiPSCs então pode ser analisado para anormalidades da expressão do gene específico do intrão contendo a lentivírus. Esta análise pode ser realizada utilizando reacção em cadeia da polimerase sensível quantitativa (PCR), que tem uma vantagem sobre as técnicas menos sensíveis anteriormente utilizada para detectar diferenças de expressão do gene 3. Conversão completa emboas práticas de fabrico clínico-grade (BPF) condições, permite relevância clínica humana. Nosso protocolo oferece um outro que os critérios de admissibilidade atuais irão se expandir e incluir caracterizados derivados baseados em hiPSC livre de fatores para aplicações terapêuticas para-humanos decorrentes hiPSCs GMP-grade, o que deverá eliminar qualquer risco de imunogenicidade devido aos antígenos não-humanos-forneceu metodologia. Este protocolo é amplamente aplicável a lentivirais reprogramado células de qualquer tipo e não fornece um método reprodutível para a conversão de células reprogramadas em condições GMP-grau.

Apresenta-se um protocolo para derivar hiPSCs livre de factor de grau clínico usando a abordagem baseada reprogramação por lentivírus STEMCCA. A Figura 1A mostra uma imagem representativa de três linhas de pré-excisada hiPSC diferentes, depois de reprogramação com a abordagem STEMCCA sobre uma camada de MEFs. A principal vantagem da abordagem de reprogramação STEMCCA reside no sucesso reprogramação consistente conseguida por vários cientistas, em diferentes grupos de pesquisa e locais. A Figura ...

Descrevemos um protocolo para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de fatores reprogramadas e caracterizadas baseadas em lentivirais e conversão em condições putativas de grau clínico.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

O objetivo geral do experimento a seguir é derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos reprogramadas baseadas em lentivírus e converter essas células em condições putativas de grau clínico. Isso é feito primeiro reprogramando fibroblastos humanos dérmicos adultos com um único de células-tronco lentivirais de tamanho ex ou carro de haste em HI PSCs. Em seguida, as PSCs HI reprogramadas são expostas ao vírus adeno Cree purr para excisão completa e remoção do carro-tronco do genoma do hospedeiro.Em seguida, a extração de DNA genômico dos PSCs HI livres de alimentadores, seguida pela análise de agel, confirma a excisão adequada do carro do caule. Finalmente, os IPCs do fator três H são convertidos em condições putativas de grau GMP por uma metodologia de conversão lenta em condições livres de xeno totalmente definidas. Em última análise, a reprogramação viral de fibroblastos dérmicos adultos humanos e a conversão total dos H IPCs em condições de grau clínico ressaltam a ampla aplicabilidade dessa metodologia para reprogramar células humanas adultas e convertê-las em condições clinicamente relevantes.As implicações dessa técnica se estendem às aplicações clínicas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, pois são completamente livres de fatores e convertidas em condições de grau clínico, tornando-as compatíveis com a terapêutica humana. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de reprogramação, excisão e conversão de grau clínico são difíceis de aprender devido aos principais procedimentos intrincados e específicos que devem ser seguidos para produzir o fator três e as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de grau clínico para iniciar o descongelamento. Fibroblastos humanos dérmicos adultos ou HAFs em banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos.Tomando cuidado para não submergir a parte superior do frasco na água. Coloque a pasta de um mililitro de células em um frasco de crônica de 15 mililitros para ressuspender as células e diluir o DMSO gota a gota. Adicione lentamente quatro mililitros de meio de huff pré-aquecido centrifugue o violeta 200 vezes G por 10 minutos de temperatura ambiente.Em seguida, aspire o sup, nacent e reus. Suspenda as células em meio a 100.000 células por mililitro em um poço de uma placa de seis poços a 0,2% de gelatina. Adicione dois mililitros da suspensão celular e, em seguida, adicione dois mililitros de suspensão a um segundo.Bem, para ser usado para medir a multiplicidade de infecção ou MOI, balance a placa de um lado para o outro e para frente e para trás para distribuir uniformemente as células antes de incubá-las durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada. 24 horas depois, após a contagem das células, descongele duas vezes, centralize as oito unidades de transdução ou S de concentrado lentiviral equivalente e use o meio huff para diluí-lo para uma vez 10 aos oito ts por mililitro usando meio meio suplementado com oito microgramas por mililitro de reagente de transfecção. Transduzir as células em uma multiplicidade de 10 de taxa de infecção.Misture os poços de transdução uniformemente e incube durante a noite aproximadamente 24 horas após a transdução lentiviral. Remova o meio huff e substitua-o por células-tronco pluripotentes humanas padrão ou meio PSC. Mude o meio diariamente nos dias dois a seis no sexto dia em dois pratos de 10 centímetros revestidos com gelatina a 0,2% placa 1,5 a 1,75 vezes 10 para os seis fibroblastos embrionários de camundongos derivados do fator componente do complemento um ou camundongos CF um em meio no dia sete.Adicione viagens à temperatura ambiente em um poço de uma placa de seis poços dos fibroblastos reprogramados. Ela gentilmente levanta as células e gira um G 100 vezes com placa média PSC humana fresca todas as células em uma proporção de um para 16 em duas placas de metanfetamina CFI de 10 centímetros. Distribuir os agregados num movimento espiral no sentido dos ponteiros do relógio e incubar durante cerca de 48 horas antes de substituir o meio.Após três a quatro semanas, use uma agulha de calibre 21 para pegar de oito a 10 pedaços individuais de colônias específicas com morfologia típica de ESC e subclone-os em poços individuais de CFI MFS após a expansão. Confirme se as células são pluripotentes por formação do corpo embrionário e análise da expressão do marcador após verificar o local de integração do carro-tronco, conforme descrito no protocolo de texto anexo. Carro de haste de consumo aspirando primeiro o antigo meio PSC humano em três mililitros de meio PSC padrão combinados.45 microlitros de adeno Cree pur ou vírus concentrado com oito microgramas por mililitro de agentes de transfecção. Em seguida, adicione às células e incube por 24 horas após a incubação, aspire o supinato viral, induza o meio PSC humano a lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione o meio HPSC com dois microgramas por mililitro de micina pura e substitua diariamente após cinco dias, subclone as colônias restantes e expanda-as conforme descrito anteriormente no vídeo.Em seguida, descongele um frasco de matriz de membrana basal pré-Eloqua em gelo e dilua o meio basal frio até uma concentração final de um a 30. Use um mililitro por poço para revestir o número desejado de poços de uma placa de seis poços e deixe a placa descansar em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, usando uma agulha de calibre 18, cruze pelo menos 20 a 30 colônias de um poço previamente revestido com mes.Tome cuidado para reduzir a elevação e a transferência das células da placa. Após uma hora de incubação, aspirar a matriz do poço revestido com uma pipeta de 200 microlitros. Remova os pedaços das colônias raspando-os suavemente da placa velha e coloque-os cuidadosamente em três mililitros de meio recém-combinado, um em uma placa revestida com matriz.Após incubação por 48 horas, troque o meio diariamente quando os PSCs HI convertidos pós-extirpados e sem alimentador atingirem 80% de fluência co. Use um kit comercial de extração de DNA para extrair o DNA genômico usando os primers mostrados aqui que são específicos para integrações exógenas do lentivírus do carro-tronco. Analise o DNA por PCR para excisão adequada para fazer a transição dos PSCs HI pós-extirpados para condições de grau GMP.Misture HPSC combinado meio um e meio compatível com GMP de grau clínico ou meio combinado dois em uma proporção de 80 a 20 pré-aquecimento a 37 graus Celsius. Aspire o meio combinado antigo das células e substitua por três mililitros da nova solução de meio quente. Substitua o meio diariamente por três dias passando de acordo com o protocolo de texto para manter o tamanho e a densidade adequados da colônia no quarto dia, substitua o meio por uma mistura 50 50 de meios combinados quentes um e dois incubar por três dias.Substituindo o meio diariamente no sétimo dia, mude para uma proporção de 20 a 80 de meios combinados aquecidos um e dois, respectivamente, e substitua diariamente por três dias. No dia 10, mude para o meio morno 100% combinado e mude diariamente. As células estão agora em meio livre de xeno completamente definido.Em seguida, depois de usar um substrato livre de xeno definido para revestir um poço de uma placa de seis poços, substitua o meio livre de xeno em um poço de células de confluência por meio fresco contendo uma rocha x. Depois de incubar por uma hora, use uma agulha de calibre 18 para mecanicamente as células recém-preparadas. Bem, permita que as células incubem sem serem perturbadas por dois dias para permitir a fixação máxima antes de caracterizar as células de acordo com o protocolo de texto.Esta figura mostra uma imagem representativa de três diferentes linhas H-I-P-S-C pré-excisadas após a reprogramação com a abordagem do carro-tronco em uma camada de mes mostrada aqui está o gel de PCR de transcrição reversa pós-excisão mostrando um subclone específico completamente livre do lentivírus do carro-tronco, como evidenciado pela falta de uma banda de amplicon específica para uma sequência específica endógena ao carro-tronco. Nesta figura, os IPCs pré-convertidos em uma matriz contendo xeno e os IPCs pós-excise livres de GMP grau H sem xeno em matriz sintética são mostrados quantificação de fatores associados à pluripotência padrão, incluindo SOX dois, OCT quatro e nanog. O uso do QPCR é ilustrado aqui.Finalmente, como visto aqui, PSCs HI pré-convertidos e pós-convertidos para condições de grau GMP foram testados por citometria de fluxo para o ácido siálico e ácido neurônico glicol indicativo de antígenos não humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reprogramar fibroblastos dérmicos adultos humanos com o vírus de reprogramação stemco, extirpar o vírus do genoma e, em seguida, converter totalmente essas HI PSCs em condições de grau clínico totalmente compatíveis com a terapêutica humana. Não se esqueça de que trabalhar com staca, um vetor antiviral de terceira geração, pode ser extremamente perigoso e precauções.Um EPI adequado e uma sala de cultura de tecidos VSL dois plus devem ser usados durante a realização deste procedimento.

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Biology

Biologia

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Aprenda a reprogramar fibroblastos dérmicos humanos adultos em células-tronco pluripotentes induzidas livres de fatores usando vetor lentiviral. Este método demonstra a conversão para condições clínicas de grau GMP.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau (Vídeo) | JoVE Journal

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

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