Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

O objetivo geral deste procedimento é medir o antígeno leucocitário humano ou antígenos tumorais associados ao HLA em fluidos de pacientes para estratificação de pacientes para imunoterapia relevante. Isso é feito pela primeira imobilização de anticorpos que imitam o receptor de células T, conhecidos como TCRM, na superfície da MICROPLACA. O segundo passo é adicionar a amostra do paciente junto com a diluição seriada dos monômeros HLA do peptídeo alvo para gerar uma curva padrão, que permite a quantificação do antígeno alvo em amostras de pacientes.

Em seguida, a ligação do antígeno alvo ao anticorpo no sistema de bioensaio de rótulo livre é monitorada até que o equilíbrio seja alcançado. A etapa final é analisar os dados resultantes usando a curva padrão para quantificar a quantidade de antígeno-alvo em amostras de pacientes. Em última análise, a tecnologia de biossensor sem rótulo é usada para detectar biomarcadores de câncer em amostras de pacientes.

A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas existentes, como lc MSS, é a rápida detecção de alto rendimento de antígenos associados ao HLA. Isso permite a rápida estratificação de pacientes com câncer para modalidades de tratamento, pois serve como uma plataforma de detecção de biomarcadores. Embora esse método esteja relacionado à triagem de biomarcadores de câncer, o sistema na verdade é aplicável a muitas aplicações, incluindo ensaios baseados em células, triagem híbrida de imunofenotipagem ou triagem de bibliotecas de pequenas moléculas.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos desenvolvendo um anticorpo terapêutico que imita o receptor de células T. Nós nos perguntamos, como identificaríamos os pacientes que mais se beneficiariam com esse tipo de terapia? Demonstrando este procedimento estará Kristen Dahl, uma estudante de pós-graduação em biotecnologia que trabalha em meu laboratório.

Comece pré-incubando a solução salina tamponada com fosfato ou PBS a 28 graus Celsius para minimizar as mudanças de ressonância relacionadas à temperatura. Adicione 50 microlitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS pH 7,2 aos poços de placas revestidas com derivados de avadon. Em seguida, abra o software do scanner de bioensaio.

Siga o assistente de configuração para definir o procedimento experimental, que inclui a seleção de brancos, padrões e amostras no layout da placa, ajuste de temperatura, número de varreduras por minuto e duração do experimento. Em seguida, insira a placa de ensaio preparada no scanner de bioensaio sem etiquetas e inicie a primeira varredura. A linha de base é o conjunto inicial de varreduras coletadas no início do experimento.

Se esta for a primeira leitura realizada nesta placa específica, deixe o scanner funcionar por tempo suficiente para equilibrar a temperatura e eliminar o desvio na linha de base. Depois que a linha de base se estabilizar ou após pelo menos cinco varreduras, pause a leitura e ejete a placa. Despeje o PBS e adicione 50 microlitros de RL 21, um anticorpo biotinilado, a todos os poços de controle, exceto aos poços de controle na placa.

Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS aos poços de controle. Em seguida, insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura até atingir a saturação. Após aproximadamente 1,5 horas, pause a leitura e ejete a placa.

Em seguida, lave a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBS mais 0,05% Tween 20 ou PBST. Siga a lavagem com três enxágues de 200 microlitros por poço de PBS pH 7,2 sem detergente. Bata o excesso de PBS do prato em toalhas de papel antes de passar para a próxima etapa.

Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS a todos os poços ativos. Em seguida, insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura para monitorar a ressonância pós-lavagem. Após a leitura, pare a leitura e ejete a placa.

Para adicionar o analito. Remova o PBS e adicione 50 microlitros por poço de um tampão de ensaio apropriado para este ensaio. O soro humano normal disponível comercialmente foi diluído de um a 20 em PBS.

Em seguida, abra o software do scanner de bioensaio e siga o assistente de configuração. Para definir o procedimento experimental, insira a placa no scanner de bioensaio e inicie uma leitura de linha de base Após a estabilização da linha de base ou após pelo menos cinco varreduras, pause a leitura e ejete a placa. Em seguida, remova o tampão de ensaio dos poços.

Em seguida, crave os controles com monômero HLAA oh 2 0 1 contendo peptídeos relevantes ou irrelevantes em concentrações que variam de 0,625 a 10 microgramas por mililitro no tampão do ensaio. Em seguida, adicione 50 microlitros dos padrões aos poços de controle da placa. Em seguida, adicione 50 microlitros do analito em tampão de ensaio aos poços de amostra da placa.

Para este ensaio, foi utilizado soro humano enriquecido disponível comercialmente. Insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura até que a saturação seja atingida aproximadamente 30 a 60 minutos após a saturação, pause a leitura e ejete a placa. Prossiga para lavar a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST, seguido de três enxágues com 200 microlitros por poço de PBS como antes, em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de ensaio a todos os poços ativos.

Agora insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura para monitorar a ressonância pós-lavagem antes de parar a leitura e ejetar a placa. Por fim, analise os dados usando o software de scanner de bioensaio ou exporte arquivos de dados brutos para o software de análise estatística preferido. O software do scanner de bioensaio gera automaticamente a curva de ligação com base no layout da placa fornecido durante a configuração experimental.

RL 21 A-T-C-R-M ou IgG dois A biotinilados foram imobilizados na placa de ensaio AVID AVIDAN, resultados representativos mostram a detecção do antígeno tumoral alvo F-L-S-L-H-L-A em uma amostra de plasma do paciente em equilíbrio e pós-lavagem. IgG dois A é usado como controle para seções de tecido de ligação inespecíficas foram coradas com um controle positivo e controles negativos. E para RL 21, uma coloração do tecido tumoral por RL 21 A confirma a apresentação de complexos F-L-S-L-H-L-A.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir biomarcadores associados ao HLA em fluidos de pacientes usando anticorpos que imitam o receptor de células T e monitorando a ligação do antígeno alvo ao anticorpo no sistema de bioensaio sem marcador. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incubar todos os tampões de amostra antes de usar para evitar picos de temperatura e usar o tampão de amostra correto para cada etapa.