Name: Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a detectar biomarcadores de antígenos HLA em amostras de pacientes com cancro da mama utilizando biossensores sem marcação. Este método permite a estratificação rápida de doentes para imunoterapia personalizada.

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Esses estudos foram apoiados em parte pela Development Corporation of Abilene, que fornece espaço de laboratório e suporte salarial para Experimmune, um Centro de Desenvolvimento Imunoterapêutico no Centro de Ciências da Saúde da Texas Tech University e Resonant Sensors Incorporated.

Declaração de Ética: tecidos e amostras de plasma humanos identificados-De foram obtidos a partir Hendrick Medical Center sob um Comitê de Ética aprovou o protocolo. 1. Adição de anticorpo biotinilado NOTA: O monitoramento desse passo é opcional. Veja protocolo alternativo se não monitoramento. <ol><li> Obter derivativos placas revestidas com avidina comercialmente disponíveis (ver Materiais e Equipamentos Tabela). </li><li> Adicionar 50 ul de fosfato tamponado salino (PBS) pH 7,2 aos poços. NOTA: PBS pré-incubar a 28 ° C para minimizar as mudanças de temperatura de ressonância relacionados. </li><li> Abra o software do scanner bioassay e siga o assistente de configuração para definir o procedimento experimental que inclui seleção de espaços em branco, padrões e amostras no layout da placa, ajuste de temperatura (28 ° C), o número de leituras por min (1), e comprimento de experiência ( 150 min para acomodar para as etapas de preparação). </li&gt; <li> Insira a placa de ensaio preparado no scanner bioassay livre rótulo e iniciar a primeira verificação. Quando a primeira verificação for concluída, selecione &quot;auto de referência para começar&quot;. A linha de base é o conjunto inicial de varreduras recolhidos no início da experiência. Se esta for a primeira leitura realizada nesta placa específica, permitem que o scanner para executar a equilibrar temperatura e eliminar a deriva da linha de base. Veja a Figura 2 para um screenshot de uma linha de base, seguido pela adição de amostra. </li><li> Depois da linha de base se estabilizou, ou, pelo menos, 5 scans, pausar a leitura e ejetar a placa. </li><li> Remover PBS despejando na pia e adicionar 50 ul de anticorpo biotinilado na RL21A [10 ug / ml em PBS pH 7.2], mas a todos os poços de controlo na placa. Adicionar 50 ul de PBS aos poços de controlo. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura até a saturação é atingido, aproximadamente, 1,5 horas. </li><li> Pausa de leitura e ejetar a placa. </li><li> Lava-se a<html> a placa 3 vezes com 200 ul / poço de solução salina tamponada com fosfato + 0,05% Tween 20 (PBST), seguido por 3 lavagens com 200 ul / poço de PBS pH 7,2. Repita com PBS. Toque o excesso de PBS de placa em papel toalha antes de passar para a próxima etapa. NOTA: Este passo pode ser realizado em um lavador de placas automático ou lavar a placa 3 vezes com 200 uL de PBST por operações de imersão líquido para uma pia e substituindo PBST com uma pipeta. </li><li> Adicionar 50 ul de PBS, pH 7,2 a todos os poços activas. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura para monitorar ressonância pós-lavagem. </li><li> Pare a leitura e ejetar a placa. </li></ol> Protocolo alternativo para o Passo 1: <ol start="13"><li> Adicionar 50 ul de anticorpo biotinilado na RL21A [10 ug / ml de PBS] a todos os poços. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1,5 horas ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com 200 ul / poço de PBST seguido por 3 lavagens com 200 ul / poço de PBS como no passo 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. A adição de analito <ol><li> Remover o PBS e adicionar 50 ul por poço de tampão de ensaio apropriada. Para este ensaio, disponível comercialmente de soro humano normal foi utilizado diluído 1:20 em PBS. </li><li> Abra o software do scanner bioassay e siga o Assistente de Configuração para definir procedimento experimental. </li><li> Insira a placa no scanner bioassay e começar uma linha de base ler. Se esta é a primeira leitura realizada nesta placa específica, deixar o scanner prazo para equilibrar a temperatura e eliminar deriva na linha de base. </li><li> Depois da linha de base se estabilizou, ou, pelo menos, 5 scans, pausar a leitura e ejetar a placa. </li><li> Remover o tampão de ensaio a partir dos poços. </li><li> Pico controlos com HLA A * 02: 01 monómero tendo relevante (FLSL) ou (SLLV, YLEV, ou péptidos irrelevantes KVL) em concentrações variando de [0,625-10 jig / ml] em tampão de ensaio. Adicionar 50 ul de padrões para os poços da placa de controle </li><li> Adicionar 50 ul de analito em tampão de ensaio para a amostrapoços da placa. Para este ensaio, cravado soro humano disponível comercialmente foi usado. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura até a saturação é atingido, aproximadamente 30-60 min. </li><li> Pausa de leitura e ejetar a placa. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com 200 ul / poço de PBST seguido por 3 lavagens com 200 ul / poço de PBS como no passo 1.9. </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de ensaio a todos os poços activas. </li><li> Insira a placa de volta ao scanner bioassay e retome a leitura para monitorar ressonância pós-lavagem. </li><li> Pare a leitura e ejetar a placa. NOTA: O tampão de ensaio poderia ser PBS, meios de cultura de tecidos, ou soro humano diluído a 1:20 em PBS, dependendo do objetivo do ensaio. </li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> Analisar o uso do software do scanner bioassay ou exportar arquivos de dados brutos para software de análise estatística preferido. O software do scanner bioassay gera automaticamente a curva de ligação com base nolayout da placa fornecida durante a configuração experimental. NOTA: Se não estiver usando o software do scanner bioassay para análise, siga os passos de 3,2-3,4. </li><li> Subtraia a linha de base e controle negativo de cada ponto de dados subseqüente. </li><li> Calcula-se a média e desvio padrão para poços em replicado em cada ponto de tempo. </li><li> Gerar um gráfico da curva de ligação ou selecione dados finais para gráficos de barras. </li></ol>

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</ol>

Os autores, Debra Wawro Weidanz e Robert Magnusson, são, respectivamente, Diretor Presidente e Diretor de Tecnologia da Resonant Sensores Incorporated, que produz o leitor e ensaio placa placas bioassay utilizados neste artigo.

O método aqui descrito apresenta um sistema de rastreio para o diagnóstico de cancro biomarcador que permitem a rápida detecção de complexos de péptido / HLA solúveis em soro, plasma, urina ou saliva amostras de pacientes em um alto rendimento de formato de 96 ou de 384 poços. Este sistema de ensaio utilizando o receptor de células T imitando anticorpos monoclonais e de um sistema de detecção livre de etiqueta reduz o tempo de análise para menos de 1 h em comparação com 3,5 h por ELISA convencional. Esta abordagem de alto rendimento permite estratificação rápida de pacientes para ensaios clínicos de vacinas contra o câncer terapêuticos ou biofármacos. Os métodos actuais para a detecção de alvos destas doenças requerem purificação por afinidade e HPLC-MS / MS de amostras de doentes individuais, um processo que consome tempo e complicado. Embora este método é susceptível de técnicas de ELISA convencionais, existe a preocupação de que os reagentes de detecção secundárias, tais como o anticorpo anti-microglobulina β2 poderia alterar a estrutura da HL nascenteUma molécula e inibem a ligação para a detecção de limitação TCRm. Detecção de livre-Label alivia essas preocupações. Este procedimento pode ser modificado para ser utilizado em outros sistemas sem etiqueta, tal como um sistema de ressonância de plasmon de superfície. No entanto, isso iria reduzir consideravelmente a capacidade de rendimento mais elevados em comparação com o sistema de bioensaio usado neste estudo. Este protocolo pode ser modificado de forma eficaz para a detecção de marcadores não-HLA no soro e no plasma de pacientes com aderência aos poucos passos críticos. A monitorização do processo de revestimento inicial anticorpo é recomendado para a optimização da superfície, como um &lt;200 pm mudança irá provavelmente resultar em baixo do sinal para a etapa de detecção subsequente. A linha de base e pós-lavagem leituras são úteis para a análise de ponto final como a abundância de proteínas séricas podem mascarar a ligação de baixa concentração de analito. Finalmente, a variação da temperatura de amostras pode resultar na variação de poço a poço. Recomenda-se que todas as amostras de ser pré-incubada umad o biosassay livre controlador de temperatura unidade rótulo fixado em 2-3 ° C acima da temperatura ambiente. As amostras refrigeradas deve dispor de tempo suficiente para alcançar a temperatura de funcionamento. Modificações futuras deste protocolo incluirá multiplexação de TCRm na superfície da placa. O sistema de bioensaio é actualmente passível de manchas de poços a uma densidade de, pelo menos, 8-Plex. Com a introdução de 4-8 TCRm a cada poço, por volumes de amostra de teste são reduzidos e permitir a recolha de dados cada vez mais complexos por paciente. Esta capacidade poderia informar mais pacientes no que diz respeito às opções terapêuticas.

Os antigénios de classe I de Leucócitos Humanos (HLA) Amostras péptidos de 8-11 aminoácidos de comprimento, derivadas da degradação proteossómica do repertório de proteínas intracelulares e apresenta estes péptidos na superfície de todas as células nucleadas 1,2. O complexo HLA é &quot;biomarcador da natureza&quot;, indicando a saúde de cada célula (Figura 1) para circulação de linfócitos T citotóxicos (CTL). Reconhecimento da doença associada peptídeos resulta em eliminação da célula incriminada por CTL. Assim, a resposta imune adaptativa é altamente eficaz na eliminação de infecções virais e tumores. No entanto, o sistema imunitário exerce uma pressão que muitas vezes promove a selecção de vírus ou tumorais capazes de evadir uma resposta de CTL eficaz. Receptor de células T (imitando TCRm) anticorpos monoclonais (mAbs) que reconhecem específico peptídeo / HLA-A * 02: 01 complexos, tais como aqueles derivados a partir de proteínas associadas com cancro da mama, factor de inibição de migração de macrófagos (MIF19-27) 3 e NY-ESO-1 157-165, permitir a detecção e destruição de células de câncer de mama, na ausência de um anti-tumor eficaz CTL de resposta 4,5. Este trabalho representativo é focado sobre a HLA-A * 0201, que é expressa em cerca de 30% da população. No entanto, a identificação de outros complexos de HLA / péptido relevantes, seguida pela produção de TCRm permite o desenvolvimento de imunoterapias para o diagnóstico de doenças visadas e companheiro, expandir a utilidade do presente trabalho para uma população muito mais ampla. Uma parte dos complexos de péptido / HLA ligados para a superfície da célula é libertado para o plasma. Devido à natureza altamente complexo de peptídeos / piscinas HLA, métodos atuais para a mineração do immunopeptidome de biomarcadores HLA associados são demorados. Este processo requer a purificação por afinidade de HLA solúvel a partir de plasma, a separação de péptidos HLA associados por meio de cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa(RP-HPLC) e sequenciação de péptidos por espectrometria de massa em tandem (MS / MS) 6,7. Embora este processo é uma opção viável para a descoberta de novos alvos terapêuticos, é um processo complicado, como uma ferramenta de diagnóstico companheiro para metas associadas HLA já na vacina terapêutica ou gasoduto biofarmacêutica 8-10. TCRm dirigidos contra estes objectivos fornecer as ferramentas para o desenvolvimento de diagnóstico rápido companheiro destinadas a estratificar pacientes em ensaios clínicos relevantes e fornecer opções terapêuticas mais informadas. Neste trabalho, um sistema de triagem descoberta de biomarcadores para o diagnóstico de câncer é apresentada, que utiliza TCRm e um sistema de bioensaio livre-label que monitora interações biológicas com passos mínimos de processamento. O sistema de bioensaio livre de marcador baseia-se um método, que utiliza o efeito de modo guiado de ressonância (GMR) que ocorre em grelhas de guias de onda dieléctricas 11-14. Quando os contatos de luz de banda larga a difracçãoralar nas placas necessárias para este sistema, dois comprimentos de onda específicos são reflectidas. A interacção da ligação entre um receptor e o seu ligando imobilizado é monitorado em tempo real, seguindo o deslocamento do comprimento de onda de ressonância com um analisador de espectro 12. Picos de ressonância separadas para ocorrer incidente TE (vector eléctrico normal ao plano de incidência) e TM (vector magnético normal ao plano de incidência) estados de polarização que fornecem vários pontos de dados que pode potencialmente aumentar a precisão da detecção 11,14. Usando placas de anticorpo pré-sensibilizados neste sistema de ensaio livre de marcador, o tempo de execução de ensaio com a análise de dados é de aproximadamente 45 min. Além disso, múltiplas amostras pode ser interrogada em um formato de 96 ou de 384 poços, uma clara vantagem sobre um formato baseado em HPLC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Detecção de Bioensaio Sem Rótulo ResoSens</td><td>Sensores Ressonantes Incorporados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas Bionetic de 96 poços Sensibilizadas Avidin</td><td>Sensores Ressonantes Software</td> ResoVu Incorporados <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Sensores Ressonantes</td></tr><tr><td>RL21A TCRm Biotinilado mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A TCRm mAb biotinilado&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 Monômero&nbsp;</td><td>Sequência</td> peptídica completa experimental<td></td><td>: FLSELTQQL</td></tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 Monômero&nbsp;</td><td>Sequência</td> peptídica completa experimental<td></td><td>: SLLMWITQV</td></tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 Monômero&nbsp;</td><td>Sequência</td><td>completa de peptídeos</td>experimental<td></td>: YLEPGPVTV</tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 Monômero&nbsp;</td><td>Sequência</td><td>completa de peptídeos</td>experimental<td></td>: KVLEYVIKV</tr><tr><td>Soro Humano Normal Agrupado&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Sobrenadante de célula</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Células cultivadas em IMDM, 10% FBS e 1% penn/strep. Sobrenadantes colhidos de culturas confluentes de 3 dias.</td></tr><tr><td>Modificação de Iscove do Meio de Dulbecco (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato + 0,05% Tween 20 (PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico]-sal de diamônio (ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>coelho anti-humano &beta; 2 microglobulinas&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugada cabra anti-coelho IgG&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas Nunc&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 leitor de microplacas</td> Kit de reagentes <td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress</td><td>Vector</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact DAB</td><td>Vector</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina QS</td><td>Vector</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>anti-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de leucócitos humanos antigen biomarkers no cancro da mama utilizando tecnologia de biossensores livre-label

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

De acordo com a American Cancer Society, mais de 200.000 mulheres serão diagnosticadas com câncer de mama invasivo em cada ano e aproximadamente 40.000 morrerão da doença. A classe I amostras de antigénio de leucócitos humanos (HLA) de péptidos derivados de degradação proteossómica de proteínas celulares e apresenta estes fragmentos na superfície celular para serem interrogados pelo circulantes linfócitos T citotóxicos (CTL). Geração de imitador do receptor de células T (TCRm) anticorpos monoclonais (mAbs) que reconhecem o cancro da mama específico peptídeo / HLA-A * 02: 01 complexos, tais como aqueles derivados de factor de inibição de migração de macrófagos (MIF 19-27) e NY-eso 1 157-165 permitir a detecção e destruição de células de câncer de mama, na ausência de uma resposta eficaz CTL anti-tumor. Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células de câncer de mama e representam biomarcadores de câncer potencialmente relevantes. Neste trabalho, um sistema de triagem avanço biomarcador para o diagnóstico de câncers incorporando receptor de células T anticorpos monoclonais imitam combinados com um romance, livre de marcador de biossensor utilizando ressonância de modo guiado (GMR) tecnologia de sensor é apresentado. Detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada. O impacto deste trabalho poderia revolucionar a medicina personalizada através do desenvolvimento de diagnósticos de doenças de companhia para immunotherapies alvejados.

Um conjunto representativo de experiências foi realizada utilizando o bem caracterizado TCRm, RL21A, um anticorpo IgG2a monoclonal murino que reconhece especificamente um péptido (MIF ou FLSL 19-27) dentro do contexto de HLA-A * 02: 01 3 molécula. O monómero de péptido / HLA cognato, bem como irrelevante HLA monómero 15, foi usado para demonstrar o procedimento descrito. A Figura 3 ilustra o formato de ensaio. RL21A é específico para o monómero FLSL / HLA, com pouca reactividade cruzada com o outro péptido / HLA 3 complexos. Esta especificidade, se condensa com o sistema de bioensaio livre de marcador (Figura 4). A sensibilidade do sistema de bioensaio livre etiqueta para esta experiência é na gama nanomolar baixa, tal como determinado por titulação do anticorpo RL21A em FLSL imobilizado / monómero de HLA (Figura 5). Embora o sinal de fundo é aumentada de forma significativa em amostras de soro, sPecific detecção de monómero FLSL / HLA no soro humano cravado é alcançado na Figura 6 e um gradiente de concentração é facilmente discernível nestas amostras. Finalmente, os sobrenadantes de linha celular MDA-MB-231, previamente demonstrado que apresentam o FLSL / HLA-A * 02: 01 molécula, são mostrados para conter monómero solúvel FLSL usando esta plataforma de ensaio isento de etiqueta (Figura 7). A subsequente adição de monómero FLSL / HLA aumenta o sinal em RL21A (Figura 7). Devido à sensibilidade do sistema, bem à variação bem incluindo deslocamentos de ressonância negativos podem ocorrer como resultado das flutuações de temperatura como pode ser visto como uma função dos desvios padrão das Figuras 4 e 5. Estas variações podem ser drasticamente reduzida por pré-incubação de todas as amostras e o leitor de placas de bioensaio a uma temperatura em ligeiro excesso de temperatura ambiente (isto é, 28 ° C). Na Figura 8, brevemente, 96-bem placas de poliestireno foram revestidos com [10 ug / ml] de RL21A durante 2 horas à temperatura ambiente, lavada com PBST, bloqueadas com 0,5% de leite com baixo teor de gordura, lavados com PBST e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente, com diluições em série de FLSL HLA monómero em soro humano normal diluído a 1:10 em PBS, para gerar uma curva padrão, ou plasma do paciente diluído a 1:10 em PBS. A placa foi lavada com PBST, incubadas 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo de coelho anti-humano β2 microglobulina [1: 5000] a detectar HLA intacto, e lavou-se em PBST. As placas foram então incubadas durante 30 minutos com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho [1: 10.000] e lavadas com PBST. Detecção colorimétrica foi realizada utilizando ABTS (2,2'-azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] sal -diammonium) substrato com um tempo de incubação de 15 min e observado a 405 nm num leitor de microplacas. FLSL / HLA foi detectado em três amostras de doentes. Na Figura 8B, RL.064 plasma do paciente foi diluída a 1:20 em PBS e, em seguida, adicionared à placa e monitorizada no detector livre de marcador durante 60 min. A detecção específica de complexo FLSL / HLA no soro de um paciente foi realizada. Teste t de Student foi realizado utilizando gráficos e estatísticas de software (p &lt;0,05). Na Figura 8C, as secções de tecido foram coradas a 1 ug / ml com rato como controlos negativos anti-HLA-A2 (BB7.2) como um controlo positivo, RL21A, IgG2b e IgG2a, respectivamente. A coloração foi detectada utilizando um kit de detecção anti-ratinho, DAB (diaminobenzadina), e hematoxilina QS para a coloração nuclear tal como indicado pelo fabricante. Coloração de tecido tumoral por RL21A confirma a apresentação de complexos de FLSL / HLA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg"> Figura 1:. Tumor apresentação de antígenos pelo antígeno leucocitário humano classe I transformação cancerosa é um distúrbio intracelular. HLA amostra intracellulproteínas AR e revelam mudanças relacionadas ao câncer na superfície da célula. TCRm CTL e são capazes de reconhecer as células cancerosas através de complexos HLA-peptídeo distintas para estas células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg"> Figura 2:. Tela de aquisição de dados no software do scanner bioensaio Exemplo de aquisição de dados que mostra o varrimento de linha de base inicial, seguido pela adição de anticorpo RL21A para uma placa revestida com 10 ug / ml de complexo FLSL / HLA. As concentrações de anticorpos são como indicado. Cada linha representa um indivíduo bem monitorizados ao longo do tempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg"> Figura 3:. Formato de Ensaio de ilustração de anticorpos imobilizados sobre a superfície de grade de difracção da placa de ensaio rel capturanente péptido / complexos de HLA em solução. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg"> Figura 4: Especificidade de RL21A para FLSL / HLA complexo Demonstração da especificidade do biotinilado RL21A TCRm relevante para a sua monómero (FLSL) em relação ao monómero de HLA HLA irrelevante (YLEV, SLLV, e KVL).. Biotinilado RL21A TCRm [10 ug / ml] foi imobilizado na superfície da placa de ensaio revestida de avidina e a detecção foi realizada utilizando monómero não marcado HLA relevante ou irrelevante [10 ug / mL] em PBS. RL21A era específico para Complexo FLSL / HLA. Two-way ANOVA foi realizada por meio de gráficos e estatísticas software (p &lt;0,001). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg"> Figura 5:. A ligação de sensibilidade RL21A ao seu cognato péptido / complexo HLA Ilustração do DETECTIno limite de sensibilidade e de RL21A se ligar ao complexo FLSL / HLA. HLA biotinilado Monómero FLSL [10 ug / ml] foi imobilizado na superfície da placa de ensaio e RL21A não marcada foi adicionada à placa em diluições em série em PBS tal como indicado. Detecção para este sistema foi na faixa de baixo nanomolar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg"> Figura 6: Detecção de complexos de HLA em Soro Humano cravado demonstração da detecção de HLA no soro humano.. Biotinilado RL21A TCRm [10 ug / ml] foi imobilizado na superfície da placa de ensaio revestida de avidina. Soro humano normal reunido com cravado relevante (FLSL) ou irrelevante (SLLV) monómero HLA foi diluído a 1:20 em PBS e, em seguida, adicionado à placa e monitorizada no detector livre de marcador durante 60 min. A detecção específica de complexo FLSL / HLA no soro humano foi realizada. Em geral, o sinal de fundo (monómero SLLV irrelevante) é elevadaer para amostras de soro diluídas em comparação com analitos purificados em PBS (ver Figura 4). Two-way ANOVA foi realizada por meio de gráficos e estatísticas software (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg"> Figura 7:. Complexos HLA solúveis foram detectados em câncer de mama sobrenadantes de cultura de células A capacidade de detectar HLA em sobrenadantes de células de câncer de mama é demonstrada. Biotinilado RL21A TCRm, RL9A TCRm (controlo negativo), e um controlo de isotipo foram imobilizados na superfície da placa de ensaio. Cravada [5 ug / ml] e os sobrenadantes de cultura de células não enriquecido MDA-231 foram adicionados e a ligação foi monitorizada durante 60 min no detector livre de marcador. FLSL e monômero SLLV HLA cravado amostras representam controles positivos para RL9A e RL21A vinculativo. One-way ANOVA foi realizada por meio de gráficos e estatísticas software (p &lt;0,0001). Figura 8:. A detecção específica de complexos FLSL / HLA em amostras de doentes (A) Uma enzima tradicional Linked Immunosorbent Assay (ELISA) foi utilizado para detectar FLSL / HLA complexos específicos no plasma do doente. (B) biotinilado RL21A TCRm ou IgG2a [10 ug / ml] foi imobilizado na placa de ensaio avidina. (C) o tecido do tumor de mama de RL.064 paciente estava manchado como descrito anteriormente 3 para verificar apresentação tumor dos complexos FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células cancerosas, o que representa um potencial biomarcador câncer relevante. Utilizando tecnologia de sensor livre de marcador e do receptor de células T imitando anticorpos monoclonais, a detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada, permitindo o desenvolvimento de um romance câncer plataforma de diagnóstico.

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

O objetivo geral deste procedimento é medir o antígeno leucocitário humano ou antígenos tumorais associados ao HLA em fluidos de pacientes para estratificação de pacientes para imunoterapia relevante. Isso é feito pela primeira imobilização de anticorpos que imitam o receptor de células T, conhecidos como TCRM, na superfície da MICROPLACA. O segundo passo é adicionar a amostra do paciente junto com a diluição seriada dos monômeros HLA do peptídeo alvo para gerar uma curva padrão, que permite a quantificação do antígeno alvo em amostras de pacientes.Em seguida, a ligação do antígeno alvo ao anticorpo no sistema de bioensaio de rótulo livre é monitorada até que o equilíbrio seja alcançado. A etapa final é analisar os dados resultantes usando a curva padrão para quantificar a quantidade de antígeno-alvo em amostras de pacientes. Em última análise, a tecnologia de biossensor sem rótulo é usada para detectar biomarcadores de câncer em amostras de pacientes.A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas existentes, como lc MSS, é a rápida detecção de alto rendimento de antígenos associados ao HLA. Isso permite a rápida estratificação de pacientes com câncer para modalidades de tratamento, pois serve como uma plataforma de detecção de biomarcadores. Embora esse método esteja relacionado à triagem de biomarcadores de câncer, o sistema na verdade é aplicável a muitas aplicações, incluindo ensaios baseados em células, triagem híbrida de imunofenotipagem ou triagem de bibliotecas de pequenas moléculas.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos desenvolvendo um anticorpo terapêutico que imita o receptor de células T. Nós nos perguntamos, como identificaríamos os pacientes que mais se beneficiariam com esse tipo de terapia? Demonstrando este procedimento estará Kristen Dahl, uma estudante de pós-graduação em biotecnologia que trabalha em meu laboratório.Comece pré-incubando a solução salina tamponada com fosfato ou PBS a 28 graus Celsius para minimizar as mudanças de ressonância relacionadas à temperatura. Adicione 50 microlitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS pH 7,2 aos poços de placas revestidas com derivados de avadon. Em seguida, abra o software do scanner de bioensaio.Siga o assistente de configuração para definir o procedimento experimental, que inclui a seleção de brancos, padrões e amostras no layout da placa, ajuste de temperatura, número de varreduras por minuto e duração do experimento. Em seguida, insira a placa de ensaio preparada no scanner de bioensaio sem etiquetas e inicie a primeira varredura. A linha de base é o conjunto inicial de varreduras coletadas no início do experimento.Se esta for a primeira leitura realizada nesta placa específica, deixe o scanner funcionar por tempo suficiente para equilibrar a temperatura e eliminar o desvio na linha de base. Depois que a linha de base se estabilizar ou após pelo menos cinco varreduras, pause a leitura e ejete a placa. Despeje o PBS e adicione 50 microlitros de RL 21, um anticorpo biotinilado, a todos os poços de controle, exceto aos poços de controle na placa.Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS aos poços de controle. Em seguida, insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura até atingir a saturação. Após aproximadamente 1,5 horas, pause a leitura e ejete a placa.Em seguida, lave a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBS mais 0,05% Tween 20 ou PBST. Siga a lavagem com três enxágues de 200 microlitros por poço de PBS pH 7,2 sem detergente. Bata o excesso de PBS do prato em toalhas de papel antes de passar para a próxima etapa.Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS a todos os poços ativos. Em seguida, insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura para monitorar a ressonância pós-lavagem. Após a leitura, pare a leitura e ejete a placa.Para adicionar o analito. Remova o PBS e adicione 50 microlitros por poço de um tampão de ensaio apropriado para este ensaio. O soro humano normal disponível comercialmente foi diluído de um a 20 em PBS.Em seguida, abra o software do scanner de bioensaio e siga o assistente de configuração. Para definir o procedimento experimental, insira a placa no scanner de bioensaio e inicie uma leitura de linha de base Após a estabilização da linha de base ou após pelo menos cinco varreduras, pause a leitura e ejete a placa. Em seguida, remova o tampão de ensaio dos poços.Em seguida, crave os controles com monômero HLAA oh 2 0 1 contendo peptídeos relevantes ou irrelevantes em concentrações que variam de 0,625 a 10 microgramas por mililitro no tampão do ensaio. Em seguida, adicione 50 microlitros dos padrões aos poços de controle da placa. Em seguida, adicione 50 microlitros do analito em tampão de ensaio aos poços de amostra da placa.Para este ensaio, foi utilizado soro humano enriquecido disponível comercialmente. Insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura até que a saturação seja atingida aproximadamente 30 a 60 minutos após a saturação, pause a leitura e ejete a placa. Prossiga para lavar a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST, seguido de três enxágues com 200 microlitros por poço de PBS como antes, em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de ensaio a todos os poços ativos.Agora insira a placa de volta no scanner de bioensaio e retome a leitura para monitorar a ressonância pós-lavagem antes de parar a leitura e ejetar a placa. Por fim, analise os dados usando o software de scanner de bioensaio ou exporte arquivos de dados brutos para o software de análise estatística preferido. O software do scanner de bioensaio gera automaticamente a curva de ligação com base no layout da placa fornecido durante a configuração experimental.RL 21 A-T-C-R-M ou IgG dois A biotinilados foram imobilizados na placa de ensaio AVID AVIDAN, resultados representativos mostram a detecção do antígeno tumoral alvo F-L-S-L-H-L-A em uma amostra de plasma do paciente em equilíbrio e pós-lavagem. IgG dois A é usado como controle para seções de tecido de ligação inespecíficas foram coradas com um controle positivo e controles negativos. E para RL 21, uma coloração do tecido tumoral por RL 21 A confirma a apresentação de complexos F-L-S-L-H-L-A.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir biomarcadores associados ao HLA em fluidos de pacientes usando anticorpos que imitam o receptor de células T e monitorando a ligação do antígeno alvo ao anticorpo no sistema de bioensaio sem marcador. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incubar todos os tampões de amostra antes de usar para evitar picos de temperatura e usar o tampão de amostra correto para cada etapa.

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Research

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Immunology and Infection

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