Um método de extração de DNA híbrido para a Avaliação de comunidades bacterianas Qualitativa e Quantitativa de amostras de produção de aves de capoeira

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver uma nova técnica de extração de DNA que combine homogeneização mecânica de DNA com remoção de inibidores de PCR e o método de extração somática e padrão-ouro para amostras ambientais ao longo do continuum de produção avícola. Isso é feito dividindo primeiro uma amostra ambiental em tubos de microcentrífuga contendo uma mistura de grânulos para homogeneizar efetivamente as amostras ambientais complexas. O segundo passo é colocar os tubos em um homogeneizador de alta potência para liberar com eficiência os ácidos nucléicos das células bacterianas e da matriz ambiental.

Em seguida, o homogenato é usado como material de partida para o método de extração de DNA enzimático padrão-ouro através da fase de ligação de inibição de PCR. A etapa final é colocar as amostras em uma estação de trabalho robótica de extração de DNA para fornecer ao usuário amostras de DNA extraídas passíveis de uma série de aplicações downstream, em última análise, PCR quantitativo e análise de microbioma usando a plataforma MiSeq de alumínio, foram usados para mostrar que este novo método híbrido fornece a melhor combinação de avaliações qualitativas e quantitativas de comunidades bacterianas totais em comparação com o processamento de amostras com o método de extração mecânica ou enzimática só. Este método fornece informações sobre a análise de comunidades microbianas ao longo do continuum de produção avícola, mas também pode ser aplicado a outros sistemas agrícolas, como gado suíno ou produção agrícola que contém amostras ambientais igualmente complexas.

Demonstrando esse procedimento hoje estará Kaitlyn Griffin, uma estudante do meu laboratório. Para iniciar o experimento, defina um banho-maria para 95 graus Celsius. Em seguida, pese três réplicas de 0,33 gramas para analisar um total de um grama de temperatura ambiente, solo ou material fecal em uma matriz de lise de dois mililitros Luvas de troca de tubo ET entre as amostras.

Adicione 825 microlitros de tampão fosfato de sódio e 275 microlitros de solução de pré-lise ou PLS a um tubo de amostra. Em seguida, vórtice as amostras por 15 segundos após a mistura, centrifugue os tubos a 14.000 Gs por cinco minutos. Transvase o sobrenadante e adicione 700 microlitros de tampão A SL. Em seguida, vórtice o tubo por cinco segundos.

Abra um tubo de cada vez para evitar contaminação. Em seguida, certifique-se de que haja um espaço livre de 10% do volume total no tubo cônico antes de colocar as amostras no instrumento de preparação rápida 24. Homogeneizar as amostras a uma velocidade de seis metros por segundo durante 40 segundos.

Observe a diferença entre a preparação rápida 24 e o vórtice após a homogeneização. Centrifugar a amostra a 14 000 Gs durante cinco minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros para a amostra restante no tubo ET da matriz de lise a mais 700 microlitros de um tampão SL, homogeneizar e centrifugar.

Usando as configurações anteriores, coloque clipes de travamento de plástico nos tubos de amostra para garantir que eles não se abram e incubem os sobrenadantes em banho-maria a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, abra cada tubo de microcentrífuga para liberar a pressão, recapitule os tubos e vórtice-os por 15 segundos. Centrifugar as amostras a 14 000 GS durante um minuto.

Após a centrifugação, transfira 1,2 mililitros do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros. Em seguida, coloque o blister contendo a aba diretamente sobre o tubo de microcentrífuga aberto e empurre suavemente a aba para fora do blister para dentro do tubo. Para evitar o contato entre a aba X de inibição e o tubo, adicione uma aba X de inibição a cada amostra.

Em seguida, vórtice os tubos até que as amostras se transformem em um líquido uniformemente esbranquiçado. Incubar as amostras durante um minuto à temperatura ambiente e centrifugá-las a 14 000 queijos durante cinco minutos, evitando quaisquer partículas remanescentes no fundo dos tubos. Transfira todo o líquido para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro.

Em seguida, centrifugue os tubos em velocidade máxima por cinco minutos. Antes de iniciar a purificação automatizada de DNA, certifique-se de que a estação de trabalho contenha a quantidade apropriada de pontas de filtro e tampões. Em seguida, adicione tubos ellucian e tubos de filtro aos adaptadores do rotor e adicione 400 microlitros de cada amostra ao slot do meio do adaptador do rotor.

Coloque os adaptadores do rotor na centrífuga da estação de trabalho e certifique-se de que todas as tampas do tubo da microcentrífuga estejam devidamente presas dentro do adaptador do rotor. Adicione a solução de proteinase K a um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e coloque-o no slot A da estação de trabalho. Adicione dois tubos de microcentrífuga com trava segura de mililitros à seção do agitador da estação de trabalho e certifique-se de que as tampas dos tubos de amostra estejam bem colocadas.

Usando a tela sensível ao toque na estação de trabalho, selecione o protocolo de detecção de patógenos de fezes humanas de DNA e leia as telas subsequentes para garantir que a estação de trabalho foi carregada corretamente. Depois que todas as telas de verificação forem aprovadas, selecione iniciar para executar o protocolo. Em seguida, remova as amostras dos adaptadores do rotor.

Combine as três purificações replicadas para uma amostra individual usando um sistema baseado em evaporação por centrifugação. Reeluir a amostra até um volume final de 100 microlitros com tampão tris EDTA. Por fim, tampe as amostras e coloque-as a menos 20 graus Celsius até que sejam necessárias para a análise a jusante.

Este gráfico demonstra que o método mecânico forneceu consistentemente as maiores estimativas gerais de abundância gênica normalizada bacteriana total para amostras fecais e de serapilheira. O método enzimático teve as menores estimativas em todos os casos. O novo método de extração híbrida produziu a melhor combinação de estimativas qualitativas e quantitativas da comunidade bacteriana total.

Dos três métodos de extração testados. Agora você deve ter uma melhor compreensão de como realizar esse novo método de extração de DNA híbrido semiautomatizado e ver sua utilidade na avaliação qualitativa e quantitativa de comunidades microbianas de amostras ambientais complexas.