Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

O objetivo geral deste procedimento é coletar imagens de alta resolução de proteínas fotorreceptoras usando microscopia de força atômica. Isso é feito primeiro obtendo uma amostra do fotorreceptor e diluindo-a. O segundo passo é aplicar a amostra de proteína em uma superfície de mica recém-clivada e limpa por cerca de 30 segundos.

Em seguida, o MICA é enxaguado com tampão para remover moléculas não ligadas e frouxamente ligadas. Em seguida, a amostra é conectada a uma célula líquida equipada com uma sonda apropriada. Este conjunto é carregado no scanner.

Depois de encher a célula líquida com solução tampão, encaixe a ponta com a amostra e comece a digitalizar. Em última análise, microscopia de força atômica incorporando força de pico. O mapeamento quantitativo de propriedades nanomecânicas é usado para coletar imagens de uma única proteína fotorreceptora na superfície da amostra.

A microscopia de força atômica que incorpora a força de pico q e m pode responder a questões-chave no campo da biologia molecular, como quais são as importantes características estruturais e químicas que determinam a função das macromoléculas biologicamente ativas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos atuais, como RMN e cristalografia de raios-X, é que imagens de alta resolução de proteínas intactas e outras macromoléculas biológicas podem ser obtidas em um ambiente biologicamente relevante. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método lutam porque o ajuste da sonda e da solução requer várias etapas, algumas das quais são bastante complexas.

Com o pico de força q e m e o software automatizado, várias dessas etapas são simplificadas, tornando o processo muito mais fácil para novos usuários e alunos de graduação. Demonstrando este procedimento estarão três alunos de graduação do meu laboratório de pesquisa, Marie Kroger, Blair Sorenson e Jessica Thomas. Esses alunos farão pós-graduação nas áreas de microbiologia, engenharia química e química no próximo ano.

Esses itens devem ser ativados em uma ordem específica. Primeiro, o computador, depois o controlador e, por último, a luz de fibra óptica. O microscópio precisa estar lendo um FM e LF fm.

A câmera deve ser centralizada sobre uma cabeça óptica FM no software. O seguinte deve ser selecionado. A categoria do experimento são as propriedades mecânicas.

O grupo de experimentos é o mapeamento nanomecânico quantitativo e o experimento é a força de pico q e m no fluido. Com as configurações selecionadas corretamente, o experimento pode ser carregado e configurado. O foco da câmera deve ser definido usando a objetiva Z primeiro, seguido pelo uso dos controles do curso para posicionar o palco, o objetivo é colocar a abertura da cabeça A FM um milímetro antes da superfície do palco para manipular os discos de amostra com mica recém-clivada com pinças de pinça de disco circular.

Comece montando a célula de fluido a partir de peças limpas impecavelmente. Primeiro, conecte o adaptador de mangueira à porta nas células de fluido limpas. Em seguida, usando uma pinça de cabeça chata com muito cuidado, pressione o O-ring em seu recuo na célula de fluido.

Em seguida, no clipe de retenção da sonda, pressione a mola levemente e vire-a para longe da ranhura. Usando a mesma pinça, segure a sonda e deslize-a na ranhura, de modo que a ponta fique voltada para o centro da célula. Em seguida, prenda a sonda usando o clipe.

O próximo passo é verificar se o grampo no A FM.It deve estar totalmente retraído. Coloque o conjunto voltado para baixo em cima da amostra. Encaixe o conjunto nos pinos do A FM para estabilização.

Abaixe o clamp. Para inspecionar o O-ring, pressione o botão para baixo no microscópio até que o O-ring seja visto. Deve ser firmemente comprimido entre o disco de suporte e a célula fluida.

A célula de fluido pode ser colocada em foco usando o botão de ajuste grosseiro. Em seguida, usando o ajuste XY, concentre-se na ponta da sonda. Parece um triângulo dourado metálico.

Agora, usando a alavanca pizo para baixo, mova a ponta para perto da superfície da amostra, ajuste o foco nas pontas, reflexão e monitore a posição dos cantilevers em relação a essa reflexão. Atualmente, eles devem estar estreitamente alinhados, mas não completamente sobrepostos. Agora, prepare a seringa.

Encha-o com um mililitro de solução tampão e conecte o adaptador. Em seguida, conecte a seringa à mangueira de ejeção e estenda totalmente o êmbolo. Em seguida, conecte a mangueira à célula de fluido usando um adaptador para encher a câmara, pressione suavemente o êmbolo até que o centro da câmara esteja cheio.

Não deve haver bolhas de ar ou derramamento da célula de fluido para o microscópio. Em seguida, coloque a seringa em uma posição bem apoiada acima da câmara. Em seguida, use o feed da câmera e os botões de translação XY.

Para localizar o laser na tela, ele deve aparecer como um ponto vermelho difuso. Uma vez localizado, use os controles do laser para movê-lo para a sonda. Agora, finalmente, ajuste os controles do laser e do espelho até que o sinal de soma no microscópio seja maximizado entre quatro e seis, ajuste o diodo do quadrante.

Em seguida, use os botões no cabeçote de varredura para ajustar as deflexões verticais e horizontais até que os valores no microscópio retornem ao mais próximo possível de zero. Certifique-se de selecionar as opções de aquisição apropriadas antes de prosseguir. Defina a taxa de varredura para cerca de um hertz na janela de amostras por linha.

Digite 256. Para o controle automático do auxiliar de varredura. Selecione individual para a seleção automática de limite Z do assistente de varredura desligada.

O limite Z deve ser de 500 nanômetros e o tamanho da varredura deve ser de um mícron. Com as configurações definidas corretamente, meça a sonda. Observe o vol Z pazotage mudança à medida que a ponta da sonda se aproxima da superfície.

Se a ponta sair do alcance, retirar-se e aproximar-se novamente, a ponta da sonda pode ter que ser substituída. Se isso não funcionar, quando a ponta estiver engatada, as linhas devem aparecer em cada uma das janelas de aquisição e essas linhas construirão uma imagem. Comece a captura contínua de imagens da mica.

Aumente o zoom lentamente para garantir que a superfície MICA esteja plana e limpa. Prepare uma placa de Petri de quatro câmaras com solução tampão de imagem refrigerada. Cada câmara precisa de pelo menos cinco mililitros.

Antes de tomar uma alíquota de proteína diluída, mexa suavemente com a micropipeta. Em seguida, pegue uma alíquota de 200 microlitros e aplique a proteína diluída na superfície do MICA. Aguarde cerca de 30 segundos para que a solução resida na superfície.

Em seguida, usando as pinças de disco, levante o disco sem incliná-lo e mergulhe-o imediatamente na primeira poça de solução tampão. Por um segundo, certifique-se de que o disco fique paralelo à bancada. É muito importante manter a amostra paralela à placa de Petri durante a etapa de enxágue.

Essas moléculas macias e flexíveis podem ser distorcidas na superfície por fortes correntes de solução aquosa. Em seguida, mergulhe brevemente o disco em cada uma das outras três piscinas por um segundo por piscina. Em seguida, transfira o disco para um pano seco e sem poeira.

Deixe o excesso de umidade ser transferido para o pano, mas não deixe o disco secar completamente. Não permita que o pano toque na amostra Remova cuidadosamente a amostra do pano com as pinças de disco e coloque a amostra no scanner A FM. Coloque a célula de fluido em cima da amostra e prossiga com a configuração e a imagem.

Depois de todos os parâmetros da sonda, o tamanho da mola e o raio da ponta são definidos corretamente. Meça a sonda como ao fazer imagens. Micah, observe o ZP azo à medida que a ponta se aproxima da superfície.

Ao tirar imagens, permita que o scanner crie imagens da mesma área por pelo menos duas passagens consecutivas. Use a captura contínua para salvar cada imagem. Ajuste o tamanho e a localização da imagem conforme desejado.

Assim que o software automatizado terminar de ajustar os parâmetros de digitalização para um determinado tamanho de imagem. Desligue o software para ficar bem. Ajuste o foco da imagem, ajuste manualmente a taxa de varredura, o limite Z, o número de linhas e o ponto de ajuste.

Se a imagem ficar demasiado desfocada, volte a ligar o software para voltar à posição inicial original. Ao aumentar o zoom em uma proteína, diminua a taxa de varredura e aumente o número de linhas proporcionalmente para aumentar a resolução da imagem. Posterior. Ao analisar as imagens, primeiro nivele a imagem clicando no ícone de achatamento.

Selecione a ordem zero e execute a operação. Às vezes, é necessário usar um ajuste simples para obter imagens adequadamente planas. Selecione o ícone de ajuste simples e use o cursor para desenhar um plano sobre uma área plana na imagem.

Execute o ajuste simples e repita a operação conforme necessário. Em seguida, selecione a guia da seção transversal para medir as dimensões da proteína. Desenhe uma linha com o cursor sobre a molécula ou área a ser analisada.

Repita esse processo em várias áreas. Se uma sobreposição for desejada, qualquer número de moléculas biológicas pode ser estudado usando um FM para uma proteína fotorreceptora em seu estado adaptado à luz, um substrato de micas recém-clivado é uma superfície plana adequada para absorção de proteínas. Dímeros de proteína fotorreceptores únicos foram observáveis usando o modo QNM de força de pico.

As setas apontam dímeros individuais e o asterisco denota um agregado de proteína usando software de análise de imagem. As seções transversais das proteínas podem ser medidas após a imagem ser achatada. Os dados XY se correlacionam com as medições de altura.

Eles podem ser usados para uma variedade de cálculos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de configurar um experimento A FM para coletar imagens de alta resolução de proteínas em uma superfície em um ambiente biologicamente relevante. Usando a força de pico q e m Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em aproximadamente três a quatro horas.

Portanto, a força de pico q e m é uma forma apropriada de microscopia de força atômica para apresentar aos alunos de graduação matriculados em cursos de laboratório, como análise instrumental, bioquímica e física moderna. Após seu desenvolvimento, esse método abriu caminho para pesquisadores no campo da microscopia de varredura por sonda explorarem moléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucléicos e até células vivas em meios biologicamente relevantes.