Name: Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Aprenda a usar microscopia de força atômica com mapeamento PF-QNM para visualizar dímeros intactos de fotorreceptores em superfície de mica. Este método permite obter imagens de alta resolução de proteínas em ambiente biologicamente relevante.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O programa NSF-MRI (CHE: 1229103) é reconhecido para o financiamento da compra de novos produtos eletrônicos de controle, software, células líquidos e outros equipamentos necessários para montar uma dupla AFM / STM. Reconhecemos as instalações compartilhadas no The University of Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obter assistência com a AFM instrumentação, treinamento e criação de imagens e de tempo de instrumentos disponibilizados pela Pesquisa de Materiais de Equipamentos (DMR-0820054). Agradecemos especialmente Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, e Prof Ka Yee Lee para acolher os nossos alunos antes do financiamento da proposta NSF-MRI, que trouxe a instrumentação necessária para o nosso campus. Reconhecemos o financiamento de uma bolsa Título III STEM (ID: P031C110157) atribuído à Northeastern Illinois University, que ofereceu remuneração de pesquisa de verão para alunos e professores, bem como suporte para produtos de consumo. Finalmente, reconhecemos Bruker-Nano, Inc. para suporte instrumental continuou e permissão para reproduce um gráfico que mostra o mecanismo de PeakForce QNM e para utilizar a palavra ScanAsyst para descrever o software automatizado.

1 computador e microscópio Configurar <ol><li> Abrir a válvula de cilindro de N 2 e ajustar os botões para assegurar a tabela de ar é flutuante e nível. </li><li> Ligue o computador, controlador e luz de fibra óptica por esta ordem. </li><li> Configure o scanner para o modo / LFM AFM e centralizar a câmera sobre a cabeça AFM. </li><li> Software aberto. Selecionar categoria experimento &quot;Propriedades nanomecânicos&quot;, &quot;Quantitative nanomecânicos Mapping&quot; no grupo experimento, e &quot;PeakForce QNM em Fluid&quot; sob experimento. Clique em Carregar Experiment e depois Setup. </li><li> Foque a câmara usando o objetivo Z para ver a superfície do palco. Usando o grosseiro para cima / para baixo piezos mover a fase aproximadamente, 1 mm abaixo da superfície da abertura de cabeça AFM. </li></ol> 2: Preparação de Superfície Mica <ol><li> Pressione uma etiqueta adesiva para o rosto de um disco limpo suporte da amostra (15 mm de diâmetro, 0,8 mm de espessura). Empurre a mica V-4disco de grau (25 x 25 x 26 mm) sobre o adesivo até firmemente fixada. </li><li> Esfregue um pedaço de fita adesiva transparente sobre a mica assegurar que esteja totalmente aderida, sem bolhas de ar. Puxe a fita do mica de um lado para unir-lo uniformemente. Repita se necessário para garantir a mica é plana. </li><li> Segure o disco de suporte, com o lado mica limpeza, com um par de pinças circulares (Garras de disco), e coloque no scanner. A mica deve estar abaixo do nível da abertura da cabeça de AFM. </li></ol> Assembleia celular 3 Fluid and Imaging da Mica Superfície <ol><li> Lavar a célula de fluido, o O-ring, o adaptador de seringa, o adaptador de mangueira, e o tubo de ejecção, em etanol a 100%. Lavar a célula de fluido em água DI. Vamos todos peças de ar secar completamente. </li><li> Empurre o adaptador de mangueira na porta da célula de fluido limpo. Pressione suavemente o anel de vedação no orifício central da célula de fluido usando uma pinça plana cabeças. </li><li> Pressione a mola de leve sobre o grampo de retenção da sonda e transformá-lo longe do groove pela dica. </li><li> Segure a sonda na extremidade longa distância da ponta com uma pinça chefiadas planas. Colocar a sonda na ranhura com a ponta virada para o centro da célula. Empurre a mola para dentro e ajustar o clipe de retenção sobre a sonda para prendê-lo (Figura 1B). </li><li> Verifique se o grampo no AFM para garantir que está totalmente retraída (Figura 1C). </li><li> Colocar a célula de fluido, o O-ring e sondar virada para baixo, no topo da amostra de mica. Permitir que a célula de fluido para descansar sobre os pernos da AFM. Diminuir a braçadeira para estabilizar a célula na fase fluida. Pressione o interruptor para baixo sobre o microscópio até a inspecção visual mostra o anel de vedação firmemente comprimida entre o disco de suporte e a célula de fluido. </li><li> Enquanto observa o monitor, o foco do botão de ajuste macrométrico para visualizar a parte superior da célula de fluido na tela. </li><li> Mova o microscópio até que haja uma clara imagem da ponta usando os X / Y e botões de ajuste do objetivo Z. A dica vai appouvido como, um triângulo dourado metálico. Mover a ponta mais perto da superfície da amostra, utilizando a alavanca de piezo-se no microscópio. Concentre-se na reflexão da ponta. Acompanhe o cantilever real em relação à sua reflexão. Nesta fase, devem ser estreitamente alinhados, mas não completamente sobrepostos. </li><li> Conecte o adaptador de seringa a uma estéril seringa de 1 ml. Anexar uma extremidade do tubo de ejecção para o adaptador de seringa e colocar a outra extremidade do tubo no recipiente de solução tampão. Estenda completamente o êmbolo da seringa. </li><li> Prenda a mangueira no adaptador de mangueira na célula de fluido. Pressione suavemente o êmbolo até que o fluido preenche plenamente a câmara central. Verifique o celular para garantir que não haja bolhas de ar. Verifique para ver que não há fluido derramando-se a partir da célula de fluido para o microscópio. Colocar a seringa sobre um suporte sólido levantada. </li><li> Utilize a alimentação da câmera e os X / Y botões de tradução para localizar o laser na tela (um ponto vermelho difuso). Utilizando o laser de movbotões de controle ent, mova o laser na ponta. </li><li> Ajustar finamente os controlos de laser e de espelho, até o sinal soma mostrado na microscópio é maximizada (valor = 4-6). </li><li> Ajustar o ângulo do díodo quadrante usando os botões do lado esquerdo traseiro e o lado superior esquerdo da cabeça de leitura para reduzir os desvios verticais e horizontais mostradas no microscópio tão próximo de zero quanto possível (± 0,1). </li><li> No software, selecione opções de aquisição. No mínimo, selecione altura (traço e retraço), erro força máxima e deformação. As outras opções são dependentes do usuário e pode ser adaptado com base na informação específica desejada pelo experimentalista. </li><li> Selecione &quot;linha&quot; para RT Plane Fit em cada janela de aquisição. Selecione &quot;none&quot; para o OT Plane Fit nas janelas de altura. Defina o X e Y offset e ângulo de leitura para zero, se não tiver feito. </li><li> Definir a taxa de varredura de 1 Hz, a amostra por linha 256, o controle automático ScanAsystpara indivíduo, eo limite de auto Z ScanAsyst para fora. Alterar o limite de Z a 500 nm. Defina o tamanho da digitalização para 1 mícron. </li><li> Clique envolver. Neste ponto, a ponta se aproxima da superfície. Enquanto a ponta se aproxima, observar Z variação de tensão piezo no canto inferior esquerdo da tela. Se a dica vai para fora da faixa, retirar a ponta e re-aproximação. Se isso não for bem sucedida, a ponta pode precisar ser alterado, a fim de ter uma abordagem bem-sucedida. Uma vez que a ponta está envolvida, as linhas vão começar a aparecer em cada uma das janelas de aquisição que irão compor uma imagem. </li><li> Tire fotos de mica em 1 x 1 mícron e zoom lentamente para garantir que a superfície de mica é limpo e liso. Clique captura contínua para salvar as imagens em que aparecem. Zoom e movimentar-se na superfície como desejado. </li></ol> 4. deposição de proteína e Preparação de Amostra for Imaging <ol><li> Obter amostra de proteína purificada 38 e manter em gelo. Se armazenado em um freezer, descongelar amostra emgelo durante 5 min. </li><li> Dilui-se a proteína a 0,0010 mg / ml de solução tampão de imagiologia utilizando refrigerado. O tampão de imagiologia usado aqui é 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), NaCl 150 mM, e MgCl2 15 mM. </li><li> Encha uma câmara 4 (100 x 15 mm) Placa de Petri com solução tampão de imagem refrigerado. Encher cada câmara, com pelo menos 5 ml de solução. Misturar suavemente a solução de proteína diluída com a ponta ligada a micropipeta. </li><li> Aplicar 200 l da solução de proteína diluída até a superfície de mica já preparado. Depois de 30 segundos, pegar superfície da proteína / mica com a pinça circulares (Garras de disco). Manter a amostra paralela à bancada do laboratório. </li><li> Enquanto mantém a amostra, mergulhar imediatamente a amostra na solução tampão continha no primeiro quadrante da placa de Petri (passo 4.2), assegurando que a amostra é paralela à bacia da placa de Petri. Depois de 1 seg, retire a amostra. </li><li> Continuando a manter a amostra paralela à baciada placa de Petri, repita o passo 4.5 para os outros três quadrantes. </li><li> Coloque o disco em um pano de pó seco para absorver o excesso de umidade e transferir o disco para o palco do microscópio. Não toque na superfície real com o pano. Não permitir que a secagem da amostra. </li><li> Repita os passos de 3,6-3,16. </li></ol> 5. de imagem Proteínas sobre mica <ol><li> Clique na caixa de seleção de parâmetros no lado esquerdo da tela. Tamanho da Primavera e raio da ponta deve ser definido com base na ponta que está sendo usado. </li><li> Clique envolver. Da mesma forma que o processo de imagem mica (passo 3.17), observe a janela z-piezo como as abordagens de ponta. </li><li> Permite que o scanner a imagem da mesma área há pelo menos dois passes consecutivos. Clique captura contínua para salvar cada imagem coletada. </li><li> Mova o scanner para uma nova região e / ou alterar o tamanho da imagem conforme desejado. </li><li> Depois que o software automatizado terminar de ajustar oparâmetros de digitalização para um determinado tamanho, rode o software fora. </li><li> Ajustar manualmente velocidade de varrimento, z limite, o número de linhas, e tensão, a fim de afinar a focagem da imagem. Se a imagem fica muito fora de foco, gire software de volta para retornar a posição inicial. Para aumentar a resolução de uma imagem enquanto o zoom em uma proteína, diminua a velocidade de varredura e aumentar o número de linhas proporcionalmente. </li><li> Após a experiência, limpar a célula-líquido com etanol a 100% e lavar com H 2 O. DI Permitir que o líquido celular para secar completamente. </li><li> Abra o software de dados para processar imagens de dados brutos. Primeiro, achatar a imagem, clicando no ícone achatar. Selecione Zero ª ordem e clique em executar. Dependendo da imagem, de um plano de ajuste pode ser necessário para obter uma imagem de plano. Neste caso, selecione o ícone em forma de avião e desenhar um plano de uma área plana da imagem, usando o cursor. Clique executar. Repita conforme necessário </li><li> Select o separador de secção transversal para medir as dimensões da proteína. Desenhar uma linha com o cursor mover-se-o ao longo da molécula ou à área a ser analisada. Repita o procedimento para várias áreas eo software irá gerar uma sobreposição. Exportar a imagem ou os dados utilizados para gerar imagem em um formato compatível com outros programas de software e de desenho. </li></ol>

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930">http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930</a> 930-933 (1986).</li>
<li>Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-Resolution+Microscopy+in+Water+Science%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Atomic-Resolution Microscopy in Water Science.</a> 232, 211-213 (1986).</li>
<li>Nikiforov, M. P., Darling, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Quantitative+Conductivity+and+Mechanical+Properties+Measurements+of+Organic+Photovoltaic+Materials+using+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM.</a> J. Vis. Exp. 71, (2013).</li>
<li>Bahatyrova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Native+Architechure+of+a+Photosynthetic+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane.</a> Nature. 430, 1058-1061 (2004).</li>
<li>Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Studies+of+Native+Photosynthetic+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes.</a> Biochem. 48, 3679-3698 (2009).</li>
<li>Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+visualization+and+characterization+of+Myxococcus+xanthus+cells+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).</li>
<li>Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Protein-Protein+Interactions+in+Real-Time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time.</a> Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).</li>
<li>Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Biological+Surface+Science%2C+Challenges+and+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances.</a> ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).</li>
<li>Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Mechanical+Properties+of+Living+Cells+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (76), (2013).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Recombinant+DNA+and+Protein+Complexes+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li>
<li>Poggi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe Microscopy.</a> Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).</li>
<li>Rico, F., Su, C., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Mapping+of+Single+Membrane+Proteins+at+Submolecular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution.</a> Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).</li>
<li>Foster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+State+of+Microscopy+for+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Lab%22%5BJournal%5D)">The State of Microscopy for 2012.</a> Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).</li>
<li>Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+Forces+in+High-Resolution+Imaging+of+Soft+Matter+in+Liquid%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid.</a> ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).</li>
<li>Kaemmer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Bruker%E2%80%99s+ScanAsyst+and+PeakForce+Tapping+AFM+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology.</a> , (2011).</li>
<li>Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+imaging+of+biological+systems+by+force-distance+curve-based+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM.</a> Nature Methods. 10, 847-854 (2013).</li>
<li>Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+high-resolution+imaging+of+native+proteins+by+force-distance+curve%E2%80%93based+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM.</a> Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).</li>
<li>Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+Chemical+Groups+while+Imaging+Single+Native+Proteins+by+High-Resolution+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy.</a> Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).</li>
<li>Berquanda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells.</a> Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).</li>
<li>Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyphosate-induced+Stiffening+of+HaCaT+Keratinocytes%2C+a+Peak+Force+Tapping+Study+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells.</a> J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).</li>
<li>Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Mechanical+Heterogeneity+of+the+Erythrocyte+Membrane+Reveals+Hallmarks+of+Membrane+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability.</a> ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).</li>
<li>Tobias, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe+Microscopy+of+Bacterial+Red-Light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+1465%2C+doi%3A10.1557%2Fopl.2012.1006%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light.</a> Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).</li>
<li>Sorenson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+Structure+of+a+Unique+Bacterial+Red+Light+Photoreceptor+as+Revealed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy.</a> Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).</li>
<li>Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+phytochrome%3A+a+picture+is+worth+a+thousand+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra.</a> Plant Cell. 18, 4-14 (2006).</li>
<li>Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+red%2Ffar-red+photochemistry+within+the+phytochrome+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).</li>
<li>Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformational+changes+of+Agrobacterium+phytochrome+Agp1+during+chromophore+assembly+and+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion.</a> Biochem. 46, 4164-4176 (2007).</li>
<li>Noack, S., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+modulation+of+histidine-kinase+activity+in+bacterial+phytochromes+monitored+by+size+exclusion+chromatography%2C+crosslinking%2C+and+limited+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis.</a> Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).</li>
<li>Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+structure+and+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytochrome structure and signaling mechanisms.</a> Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).</li>
<li>Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophytochromes+Are+Photochromic+Histidine+Kinases+Using+a+Biliverdin+Chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore.</a> Nature. 414, 776-779 (2001).</li>
<li>Takala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+amplification+and+transduction+in+phytochrome+photosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors.</a> Nature. 509, 245-248 (2014).</li>
<li>Filonov, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Near-Infared+Fluorescent+Protein+for+in+vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging.</a> Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Origin+of+Fluorescence+in+Bacteriophytochrome+Infrared+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins.</a> J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).</li>
<li>Lehtivuori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Properties+of+the+Chromophore-Binding+Domain+of+Bacteriophytochrome+from+Deinococcus+radiodurans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans.</a> J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).</li>
<li>Toh, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Reactions+of+Bacteriophytochrome+Observed+with+Ultrafast+Mid-Infrared+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+A%22%5BJournal%5D)">Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).</li>
<li>Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li>
<li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToh%2C+KC+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22">Proc. Natl. Acad. Sci. U S A</a>. 107, 9170-9175 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , Schrodinger, LLC. Forthcoming.</li>
<li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome%2C+RpBphP3%2C+reveals+residues+that+modulate+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li>
<li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome%3A+photoconversion+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li>
<li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928(2011).</li>
<li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li>
<li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li>
</ol>

Não há interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse.

AFM é um método de microscopia de sonda de varrimento totalmente capazes de fornecer imagens de proteínas e outras macromoléculas biológicas em condições fisiologicamente relevantes. Em comparação com a cristalografia de raios-X e RMN, uma limitação da AFM é a sua incapacidade para alcançar a mesma resolução, particularmente resolução lateral. Quando utilizando AFM para analisar uma molécula em qualquer superfície, o impacto da superfície e da sonda na imagem da molécula também tem de ser considerado quando são analisad...

Microscopia de força atómica (AFM), tornou-se uma ferramenta importante para investigar as propriedades estruturais e mecânicas, de superfícies de filmes finos, e as moléculas individuais desde sua invenção em 1986 (Figura 1). 1-3 Usando uma célula de líquido, o método possui tornam-se particularmente útil em estudos de macromoléculas biológicas e células, mesmo vivendo em um ambiente fisiologicamente relevante. 4-10 Tocar de modo AFM tem sido tradicionalmente usada para imprimir materiais macios ou moléculas frouxamente ligados à superfície, pois o contato de modo AFM é tipicamente inadequada devido para os danos causados ​​pelas forças laterais exercidas sobre a amostra pelo cantilever 11. de modo Tapping AFM reduz substancialmente estas forças por ter a ponta intermitentemente toque na superfície, em vez de estar em contacto constante. Neste modo, o braço de suporte é oscilado na ou perto da sua frequência de ressonância normal à superfície. Da mesma forma para entrar em contato de modo AFM, a topografia é analyzed locando o movimento do piezo-z, como uma função de xy (distância). A dinâmica cantilever pode ser bastante instável em ou próximo da ressonância; portanto, eles são muito difíceis de automatizar fora de uma situação de &quot;estado estacionário&quot;. Especificamente, estas dinâmicas dependem as propriedades da amostra e ambiente de digitalização. Para uma molécula macio adsorvido a um (er) superfície dura, um ciclo de feedback bem afinado para a molécula pode levar a oscilação feedback para a superfície. Operação no líquido complica ainda mais a sintonia do cantilever. Alterações nos níveis de temperatura ou de fluidos exigem reajuste constante de ponto de ajuste, ganhos, e outros parâmetros de imagem. Esses ajustes tendem a ser muito demorado e desafiador para os usuários. Pico de força quantitativa nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM), como tocar modo AFM, evita interações laterais por forma intermitente contactar a amostra (Figura 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; No entanto, PF-QNM opera em modo não-ressonante e freqüências muito mais baixas do que pressionar de modo AFM. Isto elimina os desafios de ajuste de modo tapping-AFM, particularmente aqueles exacerbado pela presença de fluido. Com PF-QNM, as imagens são coletadas, tendo uma curva de resposta de força em todos os pontos de contato. Com a adição do software ScanAsyst, 15 de ajuste dos parâmetros de digitalização pode ser automatizado e uma imagem de alta resolução obtidas em questão de minutos, mesmo por usuários inexperientes. Uma vez que o utilizador se torna mais familiarizados com a AFM, qualquer ou todos os parâmetros automatizadas podem ser desactivado em qualquer altura que permita o experimentalista para aperfeiçoar a qualidade de imagem manualmente. Desde a sua criação, PF-QNM foi aplicada para mapear bacteriorhodopsin, uma proteína de membrana e outras proteínas nativas no nível submolecular 16-18 Para bacteriorhodopsin., Há uma correlação direta entre a flexibilidade da proteína e de raios-X estruturas cristalográficas. 12 PF -qnM tem sido utilizada para investigar as células vivas com alta resolução. 19,20 importantes ligações Além disso, os dados de FP-QNM elucidou entre estrutura e mecânica dentro da membrana dos eritrócitos que são essenciais para a integridade e a função da célula 21. Nós empregamos microscopia de varredura por sonda (SPM) métodos, incluindo 22 AFM, 23 para estudar a estrutura de fotorreceptores de luz vermelha chamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Eles consistem de um módulo de detecção de luz covalentemente ligados a um módulo de sinalização efetuador tais como histidina quinase (HK) 26. O módulo de luz de detecção normalmente contém um cromóforo bilin que passa por uma transformação estrutural mediante a absorção de um fóton, com uma série de mudanças estruturais que atingem o módulo de sinalização efetuador e levando a uma transformação global de toda a proteína . 24,27-29 Com base nesta transformação, existem duas cadeias leves distintas de absorção sstados de BphPs, uma luz absorvendo estado vermelho e vermelho-extremo, denominado Pr e Pfr. Pr é termicamente estável, o estado de adaptação ao escuro para a maioria dos BphPs. 28 A base molecular da Pr / Pfr fotoconversão não é totalmente compreendido, devido ao conhecimento limitado estrutural dessas proteínas. Com a exceção de uma estrutura de D. radiodurans, 30 todas as estruturas cristalográficas de raio-X publicados destas proteínas são no estado de adaptação ao escuro e carecem de domínio efector. Os BphPs intactos são demasiado grandes para serem eficazmente estudada por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), e são difíceis de cristalizar na sua forma intacta (em particular no estado de luz adaptado) para a cristalografia de raios-X. BphPs foram recentemente projetado como marcadores de proteínas fluorescentes infravermelho (IFP). 31 Caracterização estrutural dessas proteínas pode ajudar ainda mais no design IFP eficaz. 32-36 O foco deste artigo é apresentar um procedimento paraimagiologia de BphPs utilizando AFM-célula através do líquido PF-QNM. O método é demonstrado pelos estudos de estado de luz adaptado do RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir da bactéria fotossintética R. palustris. O procedimento aqui apresentado é AFM abordagem conveniente e simples para a imagiologia de proteínas, bem como de outras macromoléculas biológicas. Com este método, os detalhes estruturais de moléculas individuais podem ser recolhidas num curto período de tempo, semelhante a um curso de ciência sessão de laboratório de nível superior. Através de medição secções transversais e completando mais análises dimensionais, os dados experimentais pode ser comparado a modelos computacionais úteis 37-42.

<table><tbody><tr><td></td><td>Orgânico</td> científico <td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Acros dos orgânicos</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr> de <tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 Multimodo 8</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipado com o controlador do nanoscópio V e</td></tr><tr><td>a ponta de</td> prova <td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10 do varredor de J, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Modo de rosqueamento Célula de fluido</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grau</td><td>SPI fornece</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Disco de suporte de amostra</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>micropipetadores</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Preparado de acordo com as referências citadas</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nanoscope Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disc Gripper</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>Seringa de 12 mm</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td> tubos <td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>O Sistema Gráfico Molecular Pymol v.1.5.0.1</td><td>Schrodinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de força atômica da red-light fotorreceptores usando mapeamento peakforce quantitative nanomecânicos propriedade

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Microscopia de força atômica (AFM) usa uma ponta piramidal anexado a um cantilever para sondar a resposta força de uma superfície. Os desvios de ponta pode ser medido para ~ 10 pN por um detector de laser e dividida em sectores, que pode ser convertido em imagem topografia. Modulação de amplitude ou AFM &quot;modo de tocar&quot; envolve a sonda fazer contato intermitente com a superfície, enquanto oscilando em sua freqüência de ressonância para produzir uma imagem. Usado em conjunto com uma célula de fluido, tocando-AFM modo permite a imagiologia de macromoléculas biológicas, tais como proteínas em condições fisiologicamente relevantes. Tocar de modo AFM requer sintonia manual da sonda e ajustes frequentes de uma infinidade de parâmetros de verificação que pode ser um desafio para usuários inexperientes. Para obter imagens de alta qualidade, esses ajustes são mais demoradas. PeakForce Quantitative nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM) produz uma imagem medindo a respon vigorcurva se para cada ponto de contato com a amostra. Com o software ScanAsyst, PF-QNM pode ser automatizado. Este software ajusta o set-point, a frequência da unidade, taxa de varredura, os ganhos, e outros parâmetros de digitalização importantes automaticamente para uma determinada amostra. Não só este processo de proteger ambas as sondas frágeis e amostras, que reduz significativamente o tempo necessário para obter imagens de alta resolução. PF-QNM é compatível para imagens AFM de fluido; portanto, ele tem uma vasta aplicação para geração de imagens materiais biologicamente relevantes. O método apresentado neste artigo descreve a aplicação de PF-QNM para obter imagens de uma bacteriana fotorreceptor da luz vermelha, RpBphP3 (P3), a partir da fotossíntese R. palustris no seu estado adaptado luz. Usando este método, os dímeros de proteínas individuais de P3 e agregados de dímeros foram observados sobre uma superfície de mica na presença de um tampão de imagens. Com os ajustes apropriados para a superfície e / ou concentração da solução, este métodopode ser geralmente aplicada a outras macromoléculas biologicamente relevantes e materiais macios.

Imagens AFM representativos de uma proteína de fotorreceptores, P3, no seu estado adaptado-luz são apresentados nas Figuras 3 e 4. Um substrato de mica clivada de fresco, (Figura 3A) é uma superfície adequada, plana para a adsorção de proteínas. Recolha de uma imagem de mica limpo como um controlo negativo é importante por várias razões. Em primeiro lugar, ele garante a célula líquido é limpo e sem materiais residuais de experimentos anteriores irá contaminar a superfíc...

Um método para investigar a estrutura de um fotorreceptor de proteína usando microscopia de força atômica (AFM) é descrito neste artigo. O Mapeamento Quantitativo de Propriedades Nanomecânicas PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos em uma superfície de mica.

Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

O objetivo geral deste procedimento é coletar imagens de alta resolução de proteínas fotorreceptoras usando microscopia de força atômica. Isso é feito primeiro obtendo uma amostra do fotorreceptor e diluindo-a. O segundo passo é aplicar a amostra de proteína em uma superfície de mica recém-clivada e limpa por cerca de 30 segundos.Em seguida, o MICA é enxaguado com tampão para remover moléculas não ligadas e frouxamente ligadas. Em seguida, a amostra é conectada a uma célula líquida equipada com uma sonda apropriada. Este conjunto é carregado no scanner.Depois de encher a célula líquida com solução tampão, encaixe a ponta com a amostra e comece a digitalizar. Em última análise, microscopia de força atômica incorporando força de pico. O mapeamento quantitativo de propriedades nanomecânicas é usado para coletar imagens de uma única proteína fotorreceptora na superfície da amostra.A microscopia de força atômica que incorpora a força de pico q e m pode responder a questões-chave no campo da biologia molecular, como quais são as importantes características estruturais e químicas que determinam a função das macromoléculas biologicamente ativas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos atuais, como RMN e cristalografia de raios-X, é que imagens de alta resolução de proteínas intactas e outras macromoléculas biológicas podem ser obtidas em um ambiente biologicamente relevante. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método lutam porque o ajuste da sonda e da solução requer várias etapas, algumas das quais são bastante complexas.Com o pico de força q e m e o software automatizado, várias dessas etapas são simplificadas, tornando o processo muito mais fácil para novos usuários e alunos de graduação. Demonstrando este procedimento estarão três alunos de graduação do meu laboratório de pesquisa, Marie Kroger, Blair Sorenson e Jessica Thomas. Esses alunos farão pós-graduação nas áreas de microbiologia, engenharia química e química no próximo ano.Esses itens devem ser ativados em uma ordem específica. Primeiro, o computador, depois o controlador e, por último, a luz de fibra óptica. O microscópio precisa estar lendo um FM e LF fm.A câmera deve ser centralizada sobre uma cabeça óptica FM no software. O seguinte deve ser selecionado. A categoria do experimento são as propriedades mecânicas.O grupo de experimentos é o mapeamento nanomecânico quantitativo e o experimento é a força de pico q e m no fluido. Com as configurações selecionadas corretamente, o experimento pode ser carregado e configurado. O foco da câmera deve ser definido usando a objetiva Z primeiro, seguido pelo uso dos controles do curso para posicionar o palco, o objetivo é colocar a abertura da cabeça A FM um milímetro antes da superfície do palco para manipular os discos de amostra com mica recém-clivada com pinças de pinça de disco circular.Comece montando a célula de fluido a partir de peças limpas impecavelmente. Primeiro, conecte o adaptador de mangueira à porta nas células de fluido limpas. Em seguida, usando uma pinça de cabeça chata com muito cuidado, pressione o O-ring em seu recuo na célula de fluido.Em seguida, no clipe de retenção da sonda, pressione a mola levemente e vire-a para longe da ranhura. Usando a mesma pinça, segure a sonda e deslize-a na ranhura, de modo que a ponta fique voltada para o centro da célula. Em seguida, prenda a sonda usando o clipe.O próximo passo é verificar se o grampo no A FM.It deve estar totalmente retraído. Coloque o conjunto voltado para baixo em cima da amostra. Encaixe o conjunto nos pinos do A FM para estabilização.Abaixe o clamp. Para inspecionar o O-ring, pressione o botão para baixo no microscópio até que o O-ring seja visto. Deve ser firmemente comprimido entre o disco de suporte e a célula fluida.A célula de fluido pode ser colocada em foco usando o botão de ajuste grosseiro. Em seguida, usando o ajuste XY, concentre-se na ponta da sonda. Parece um triângulo dourado metálico.Agora, usando a alavanca pizo para baixo, mova a ponta para perto da superfície da amostra, ajuste o foco nas pontas, reflexão e monitore a posição dos cantilevers em relação a essa reflexão. Atualmente, eles devem estar estreitamente alinhados, mas não completamente sobrepostos. Agora, prepare a seringa.Encha-o com um mililitro de solução tampão e conecte o adaptador. Em seguida, conecte a seringa à mangueira de ejeção e estenda totalmente o êmbolo. Em seguida, conecte a mangueira à célula de fluido usando um adaptador para encher a câmara, pressione suavemente o êmbolo até que o centro da câmara esteja cheio.Não deve haver bolhas de ar ou derramamento da célula de fluido para o microscópio. Em seguida, coloque a seringa em uma posição bem apoiada acima da câmara. Em seguida, use o feed da câmera e os botões de translação XY.Para localizar o laser na tela, ele deve aparecer como um ponto vermelho difuso. Uma vez localizado, use os controles do laser para movê-lo para a sonda. Agora, finalmente, ajuste os controles do laser e do espelho até que o sinal de soma no microscópio seja maximizado entre quatro e seis, ajuste o diodo do quadrante.Em seguida, use os botões no cabeçote de varredura para ajustar as deflexões verticais e horizontais até que os valores no microscópio retornem ao mais próximo possível de zero. Certifique-se de selecionar as opções de aquisição apropriadas antes de prosseguir. Defina a taxa de varredura para cerca de um hertz na janela de amostras por linha.Digite 256. Para o controle automático do auxiliar de varredura. Selecione individual para a seleção automática de limite Z do assistente de varredura desligada.O limite Z deve ser de 500 nanômetros e o tamanho da varredura deve ser de um mícron. Com as configurações definidas corretamente, meça a sonda. Observe o vol Z pazotage mudança à medida que a ponta da sonda se aproxima da superfície.Se a ponta sair do alcance, retirar-se e aproximar-se novamente, a ponta da sonda pode ter que ser substituída. Se isso não funcionar, quando a ponta estiver engatada, as linhas devem aparecer em cada uma das janelas de aquisição e essas linhas construirão uma imagem. Comece a captura contínua de imagens da mica.Aumente o zoom lentamente para garantir que a superfície MICA esteja plana e limpa. Prepare uma placa de Petri de quatro câmaras com solução tampão de imagem refrigerada. Cada câmara precisa de pelo menos cinco mililitros.Antes de tomar uma alíquota de proteína diluída, mexa suavemente com a micropipeta. Em seguida, pegue uma alíquota de 200 microlitros e aplique a proteína diluída na superfície do MICA. Aguarde cerca de 30 segundos para que a solução resida na superfície.Em seguida, usando as pinças de disco, levante o disco sem incliná-lo e mergulhe-o imediatamente na primeira poça de solução tampão. Por um segundo, certifique-se de que o disco fique paralelo à bancada. É muito importante manter a amostra paralela à placa de Petri durante a etapa de enxágue.Essas moléculas macias e flexíveis podem ser distorcidas na superfície por fortes correntes de solução aquosa. Em seguida, mergulhe brevemente o disco em cada uma das outras três piscinas por um segundo por piscina. Em seguida, transfira o disco para um pano seco e sem poeira.Deixe o excesso de umidade ser transferido para o pano, mas não deixe o disco secar completamente. Não permita que o pano toque na amostra Remova cuidadosamente a amostra do pano com as pinças de disco e coloque a amostra no scanner A FM. Coloque a célula de fluido em cima da amostra e prossiga com a configuração e a imagem.Depois de todos os parâmetros da sonda, o tamanho da mola e o raio da ponta são definidos corretamente. Meça a sonda como ao fazer imagens. Micah, observe o ZP azo à medida que a ponta se aproxima da superfície.Ao tirar imagens, permita que o scanner crie imagens da mesma área por pelo menos duas passagens consecutivas. Use a captura contínua para salvar cada imagem. Ajuste o tamanho e a localização da imagem conforme desejado.Assim que o software automatizado terminar de ajustar os parâmetros de digitalização para um determinado tamanho de imagem. Desligue o software para ficar bem. Ajuste o foco da imagem, ajuste manualmente a taxa de varredura, o limite Z, o número de linhas e o ponto de ajuste.Se a imagem ficar demasiado desfocada, volte a ligar o software para voltar à posição inicial original. Ao aumentar o zoom em uma proteína, diminua a taxa de varredura e aumente o número de linhas proporcionalmente para aumentar a resolução da imagem. Posterior. Ao analisar as imagens, primeiro nivele a imagem clicando no ícone de achatamento.Selecione a ordem zero e execute a operação. Às vezes, é necessário usar um ajuste simples para obter imagens adequadamente planas. Selecione o ícone de ajuste simples e use o cursor para desenhar um plano sobre uma área plana na imagem.Execute o ajuste simples e repita a operação conforme necessário. Em seguida, selecione a guia da seção transversal para medir as dimensões da proteína. Desenhe uma linha com o cursor sobre a molécula ou área a ser analisada.Repita esse processo em várias áreas. Se uma sobreposição for desejada, qualquer número de moléculas biológicas pode ser estudado usando um FM para uma proteína fotorreceptora em seu estado adaptado à luz, um substrato de micas recém-clivado é uma superfície plana adequada para absorção de proteínas. Dímeros de proteína fotorreceptores únicos foram observáveis usando o modo QNM de força de pico.As setas apontam dímeros individuais e o asterisco denota um agregado de proteína usando software de análise de imagem. As seções transversais das proteínas podem ser medidas após a imagem ser achatada. Os dados XY se correlacionam com as medições de altura.Eles podem ser usados para uma variedade de cálculos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de configurar um experimento A FM para coletar imagens de alta resolução de proteínas em uma superfície em um ambiente biologicamente relevante. Usando a força de pico q e m Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em aproximadamente três a quatro horas.Portanto, a força de pico q e m é uma forma apropriada de microscopia de força atômica para apresentar aos alunos de graduação matriculados em cursos de laboratório, como análise instrumental, bioquímica e física moderna. Após seu desenvolvimento, esse método abriu caminho para pesquisadores no campo da microscopia de varredura por sonda explorarem moléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucléicos e até células vivas em meios biologicamente relevantes.

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

Fonte: Kulkarni, M. et al. Dinâmica de Ca2+ em terminais axônicos fotorreceptores de cone da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de uma retina de camundongo transgênico. Ele descreve as etapas para preparar fatias de retina, imagens de biossensores de cálcio baseados em FRET e analisar alterações de fluorescência para quantificar os níveis de cálcio sob iluminação de...

Microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de retina de camundongos

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as propriedades mecânicas intracelulares de células isoladas de zebrafish em bidimensionais com medição direta de força por uma armadilha óptica.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Aqui, mostramos o protocolo de imagem para observar interações biomoleculares com derivação fototérmica fora da ressonância (PORT), onde otimizamos os parâmetros de imagem, identificamos os limites do sistema e investigamos possíveis melhorias na montagem do motivo de DNA de estrela de três pontos de imagem.

Imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da Três-Ponto-estrela do ADN usando a torneira fototérmica da fora-ressonância

Aprenda a usar microscopia de força atômica com mapeamento PF-QNM para visualizar dímeros intactos de fotorreceptores em superfície de mica. Este método permite obter imagens de alta resolução de proteínas em ambiente biologicamente relevante.

Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

Explorar mais vídeos