Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a identificação e excisão do depor adiposo para a análise de diferentes efeitos fatoriais sobre e por adiposo. Isso é feito expondo primeiro os órgãos internos e depósitos adiposos de um camundongo adulto. Na segunda etapa, os órgãos e tecidos supérfluos são removidos para melhor expor os depósitos, permitindo a identificação dos depósitos em seus locais correspondentes.

Na etapa final, o tecido adiposo é então extraído com cuidado especial para evitar contaminação. Em última análise, o isolamento e a excisão desses depósitos fornecem tecido para análise histológica, expressão proteica, atividade enzimática e análise de expressão gênica, bem como para estudos in vitro. A principal vantagem deste protocolo específico sobre as metodologias existentes é que ele permite o isolamento de múltiplos depósitos com dissecção mínima, bem como contaminação mínima.

Portanto, esse procedimento pode ajudar a responder a perguntas sobre o campo da obesidade. Por exemplo, os efeitos prejudiciais ou mesmo benéficos do tecido adiposo nas doenças humanas. Para isolar o tecido adiposo marrom, comece colocando um camundongo adulto com etanol, limpo e sacrificado na posição supina com as costas contra a mesa.

Em seguida, use uma pinça para levantar a pele logo abaixo do diafragma e faça uma incisão na pele com uma tesoura. Corte transversalmente ao redor da circunferência do mouse para expor o peritônio. Em seguida, segurando os apêndices inferiores e o abdômen em uma mão, puxe a pele em direção à cabeça com a outra mão para desenluvar a metade superior do camundongo, revelando o depósito adiposo marrom em forma de borboleta ou morcego.

Em seguida, localize o escapo e o depósito de morcegos correspondente. Em seguida, use um microscópio de dissecção para remover cuidadosamente qualquer tecido adiposo branco superficial sobre a borboleta e dissecar a gordura marrom interescapular, tomando cuidado para evitar qualquer músculo associado. Para isolar o tecido adiposo subcutâneo ou subq, segure os apêndices superiores e o tórax com uma mão e puxe a pele para baixo em direção aos pés com a outra mão para desenluvar a metade inferior do camundongo e revelar os depósitos triangulares inguinais subq.

Em seguida, coloque o mouse de volta na posição supina e disseque cuidadosamente os triângulos de gordura subq para isolar a gordura gonadal da cavidade abdominal. Use uma tesoura para cortar o peritônio transversalmente diretamente abaixo do diafragma. Em seguida, corte o peritônio do diafragma ao reto, no meio do coronal, para expor os órgãos abdominais e dissecar cuidadosamente os dois depósitos de gordura epidérmica dos testículos epi e vasa deia.

Para isolar o tecido adiposo perivascular, mantenha o animal em decúbito dorsal e estenda os apêndices superior e inferior para fora. Em seguida, levante o processo xifóide com uma pinça para criar tensão na parte superior do corpo e corte horizontalmente o diafragma, expondo a parte inferior da cavidade torácica. Corte a caixa torácica superiormente em direção à cabeça, ao lado do esterno e, em seguida, pegue a caixa torácica logo abaixo da clavícula.

Corte ao longo do comprimento inferior da clavícula em direção à axila em ambas as direções. A cavidade torácica e seu conteúdo agora devem estar claramente visíveis. Assim que a área estiver limpa de fluido, corte os brônquios e os vasos de fixação para remover os pulmões e expor o coração.

Depois de identificar o estômago e o esôfago, corte o esôfago na junção gastroesofágica para liberar o estômago. Em seguida, identifique os intestinos e o mesentério circundante. Corte superficialmente o mesentério e, em seguida, corte o cólon o mais próximo possível do reto para liberar o estômago, intestino, cólon, pâncreas e baço.

Quando os órgãos forem removidos, corte as veias hepáticas e o mesentério de conexão e remova todos os lobos do fígado. Corte a camada visceral e a gordura ao redor dos rins, deixando os rins ligados à aorta in vivo para servir como marcadores geográficos para os diferentes segmentos da aorta. Então, quando a área ao redor dos rins estiver limpa, use microtesouras e microfórceps para separar a aorta de sua fixação dorsal à coluna vertebral e sua fixação ventral ao esôfago.

No tórax, siga e desprenda a aorta desde sua origem no coração até a bifurcação na região ilíaca. Para isolar o tecido adiposo aórtico, neste ponto, os vasos subclávios podem ser identificados. Isole esses vasos do pescoço até a raiz da aorta para expor melhor a junção aórtica e a raiz no coração.

Em seguida, remova o timo e corte as artérias braquiocefálica, carótida comum esquerda e subclávia esquerda para permitir o movimento do coração. Finalmente, use um microscópio de dissecação para visualizar o tecido adiposo perivascular ou a camada P VVA T ao redor da aorta. Em seguida, use micro fórceps para puxar suavemente o tecido para longe da aorta e micro tesoura para cortar suavemente a fixação do PVAT à aorta começando na região torácica, logo acima de onde o diafragma está localizado.

Em seguida, use micro fórceps para puxar suavemente o tecido para longe da aorta e micro tesouras para cortar suavemente a fixação do PVAT à aorta, começando na região torácica logo acima de onde o diafragma está localizado. Repita esse processo em toda a extensão da aorta, terminando na região aórtica infrarrenal, localizada logo acima da bifurcação ilíaca do vaso aórtico e inferior aos ramos renais do morcego. E as amostras de wat podem ser diferenciadas por análise histológica com coloração h e e linhagens celulares primárias de adipócitos subcutâneos e perivasculares.

Os adipócitos podem então ser cultivados e diferenciados de pré-adipócitos para adipócitos para análise de microarray. Nessas imagens representativas, por exemplo, a conversão de pré-adipócitos cultivados em adipócitos foi confirmada com adipócitos de coloração com vermelho de óleo, isolados, cultivados e diferenciados por este método podem ser usados para análises in vitro posteriores. Neste experimento representativo, observou-se que a atividade enzimática do MM P dois diminuiu em adipócitos perivasculares isolados em resposta a um tratamento experimental em comparação com controles não tratados.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trocar as luvas e limpar os instrumentos com frequência para minimizar a contaminação. Portanto, depois que esses tecidos são coletados, uma variedade de procedimentos pode ser realizada neles. Por exemplo, cultura de células, análise histológica, medição de proteínas e até expressão gênica.

E então esses resultados podem ser usados para ajudar a entender a relação e as semelhanças e diferenças entre os diferentes depósitos.