Name: Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a medir a resposta alimentar induzida por glutationa em Hydra usando análise de vídeo e medição da distância tentáculo-boca. Este método reprodutível auxilia pesquisas em neurociência e biologia do comportamento.

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Os autores agradecem a K. P. Madhu, Nita Beliappa e equipe do Centro de Mídia do Instituto Indiano de Educação e Pesquisa Científica, Pune, por sua ajuda na produção do vídeo. O trabalho foi apoiado por financiamento do programa Centro de Excelência do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para SG e bolsa de pós-doutorado do Departamento de Ciência e Tecnologia, Governo da Índia para RK.

1. Hydra Cultura e medição da resposta Alimentação <ol><li> Manter pólipos hidra em cultura, alimentando-os com diária de artemia e mantendo-os num meio (tampão de 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl a 1 mM, CaCl2 1 mM, KCl 0,1 mM, e 0,1 mM de MgSO4) contida em um tigela de vidro a 18 ° C sob ciclos escuros hr de luz 12 12 h, como descrito anteriormente 12. </li><li> Para a medição da resposta de alimentação, transferir um pólipo amadurecer hidra tendo 5 a 6 tentáculos para um único poço de uma placa de 24 poços. Retirar o meio residual do bem, inclinando-lo, e em seguida, adicione imediatamente 500 mL de meio fresco. </li><li> Preparar a solução de glutationa 9 uM em meio de hidra. Uma vez que a solução de glutationa é propenso a oxidação, usar sempre a glutationa solução preparada de fresco para cada experiência. </li><li> Transferir a placa para a plataforma de imagem de um microscópio tendo disposições para a gravação da imagem. Usar um fundo escuro de tal modo que o comportamentof pólipo hidra pode ser claramente fotografada contra o fundo contrastante. </li><li> A sala utilizada para a observação e imagem do comportamento de hidra livre de luzes de intensidade flutuante, correntes de ar e de ruído. Tais perturbações podem também fazer com que o pólipo hidra para mostrar a contracção dos tentáculos - mesmo na ausência de glutationa. </li><li> Permitir que o pólipo para relaxar por 5 min. </li><li> Certifique-se de que o pólipo está localizado ao longo da região central da cavidade de tal modo que o comportamento pode ser trabalhada de forma clara. Se o pólipo está na borda do poço, trazê-la para o centro, através de lavagem do meio utilizando uma pipeta e novamente permitir que ele relaxe. </li><li> Capturar uma imagem da hidra no estado relaxado. Este será o ponto de observação de tempo zero. </li><li> Rapidamente adicionar 9 uM solução glutationa para alcançar uma concentração final de 3 uM no poço. Dependendo da finalidade da experiência e a resposta mostrada por hidra, testar uma gama de diferentes concentrações de glutationa e Chooif a concentração adequada e necessária. </li><li> Inicie o cronômetro imediatamente após a adição de solução de glutationa e capturar imagens após cada 15-30 seg para 4-5 min. Não altere as configurações de ampliação durante a imagiologia de lapso de tempo. </li><li> Adicionar a solução de glutationa suavemente e com um fluxo uniforme de tal modo que a posição do animal no poço seria minimamente perturbado no campo de visão do microscópio. No entanto, se o pólipo se move extensivamente após a adição de solução de glutationa, mover a placa muito suavemente para trazer o pólipo no campo de visão para a captura de imagem. </li><li> No experimento de controle, use meio sem glutationa, mantendo todos os outros parâmetros idênticos. </li><li> Certifique-se de executar todas as etapas experimentais acima durante a primeira metade do dia - antes de 13:00 para evitar o possível efeito do ritmo circadiano sobre a extensão da resposta de alimentação. </li><li> Abra cada uma das imagens capturadas usando o GNU Image Manipulation Program (GIMP). Use a ferramenta "Medida", disponível a partir de Menu&gt; Ferramentas&gt; Medida para determinar a distância entre a extremidade apical de cada um dos tentáculos e hypostome. Se a abertura boca é observado em qualquer uma das imagens, determinar a distância entre o centro da boca aberta e a extremidade apical do tentáculo. Consulte a esta distância como a propagação tentáculo. </li><li> Calcule o spread médio tentáculo para cada pólipo antes e depois da exposição a glutationa. Calcular a proporção de spread médio tentáculo no ponto de tempo zero para que em cada um dos pontos de tempo subsequentes. Esta relação será chamado propagação tentáculo relativa. </li><li> Repita as medições por pelo menos 20 pólipos. </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="Equação 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. método de validação usando oA fome Modelo <ol><li> Para a fome, transferir alguns pólipos Hydra para uma tigela de vidro separada e não alimentá-los durante 5 dias. Alimente o grupo de alguns pólipos controle diário com artemia em uma tigela de tamanho similar. Mudar o meio de tanto experimental taças diariamente para evitar crescimento de fungos no meio. </li><li> No dia do experimento, alimentar o grupo de controle hidra com artemia por 1 hr e usá-los hidra para os experimentos posteriores após a remoção de todos artemia não consumidos e mortos a partir do meio. </li><li> Meça a resposta de alimentação da hidra fome em comparação com a hidra do grupo de controle pelo método descrito anteriormente na etapa 1. Para evitar qualquer viés devido ao tempo de observação, alternar as medidas de cada da fome e controlar pólipos hidra. </li></ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
<li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nematocyst%3A+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li>
<li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li>
<li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+%28Cnidaria%2C+Hydrozoa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiology%22%5BJournal%5D)">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+NMDA+receptors+in+Hydra%3A+a+biochemical+and+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li>
<li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allatotropin%3A+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li>
<li>Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Glutathione+in+the+Nervous+System%22">Glutathione in the Nervous System</a>. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).</li>
<li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li>
<li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li>
<li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan%2C+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li>
<li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li>
<li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li>
<li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li>
<li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li>
<li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li>
<li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li>
<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Comportamento alimentar em hidra representa um dos sistemas de quimio mais ancestrais dos metazoários. Embora a presença de GSH no fluido crustáceo libertado após assistida-nematocyst captura de presa foi detectada há muito tempo 1, nem a proteína GSHR nem o gene que codifica putativo / s têm sido caracterizadas a partir da hidra até à data. Poucas tentativas têm sido feitas para caracterizar as proteínas de ligação a GSH na hidra 8, 14, 15. No entanto, a identidade destas proteínas receptoras puta...

Hydra é o organismo mais primitivo que possui um sistema nervoso e quimiossensação para detectar glutationa reduzida (GSH) para capturar a presa1. Alimenta-se de uma variedade de animais, como nematóides, crustáceos, larvas de insetos, girinos e peixes recém-nascidos1. O movimento desses organismos de presa causa descarga mecanossensorial das cápsulas urticantes chamadas nematocistos da hidra, que são inseridas na presa2. O GSH presente no fluido liberado da presa ferida subsequentemente ativa a resposta alimentar na hidra, que inclui o enrolamento dos tentáculos para trazer a presa em direção à boca, abertura da boca e consequente engolfamento da presa. Várias moléculas, como dopamina3, glutamato4, GABA, glicina5, receptores NMDA6 e alatotropina7, demonstraram estar envolvidas na resposta alimentar na hidra. Também foi demonstrado que a resposta quimiossensorial induzida pelo GSH é modulada pelo estado alimentar do animal, de modo que a hidra faminta exibiu uma resposta alimentar aprimorada1. Esse aumento na sensibilidade do GSH é biologicamente relevante, uma vez que, sob a fome, a hidra precisa encontrar sua presa com maior sensibilidade. 
Embora a resposta alimentar induzida pelo GSH possa ser claramente observada ao microscópio, os métodos normalmente usados para medir as observações da resposta alimentar não são quantitativos. Na maioria dos casos, o tempo durante o qual a boca da hidra permanece aberta foi tomado como medida da resposta alimentar8,9; enquanto em outro caso, a quantificação foi baseada no número de hidras de uma população mostrando a resposta alimentar10. No entanto, observar o tempo de abertura da boca dos pólipos da hidra é complicado e sujeito a variações induzidas por parâmetros incontroláveis, como a direção da orientação da boca durante as observações. Da mesma forma, como a resposta alimentar é um parâmetro quantitativo, as abordagens de base populacional estão sujeitas a variações/erros causados pela opinião ou viés observacional do observador individual. Para contornar esses problemas, desenvolvemos um método para a quantificação relativa da resposta alimentar em hidra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) com base na distância da extremidade apical do tentáculo da boca do pólipo da hidra.

<table><tbody><tr><td>Incubadora Refrigerada</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>Microscópio MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmera para microscópio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa reduzida</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Armazenado a 4 °C. Leve o frasco à temperatura ambiente antes de abrir para evitar oxidação</td></tr><tr><td>Programa de edição de imagem</td><td>GIMP</td><td>Versão 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo alimentação resposta induzida por glutationa em hydra

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra está entre os organismos mais primitivos que possuem um sistema nervoso e quimiossensação para detectar glutationa reduzida (GSH) para capturar a presa. O movimento dos organismos presas causa descarga mecanossensorial das células urticantes chamadas nematocistos da hidra, que são inseridas na presa. A resposta alimentar na hidra, que inclui o enrolamento dos tentáculos para trazer a presa em direção à boca, abertura da boca e consequente engolfamento da presa, é desencadeada pelo GSH presente no fluido liberado da presa ferida. Para poder identificar o mecanismo molecular da resposta alimentar em hidra que é desconhecido até o momento, é necessário estabelecer um ensaio para medir a resposta alimentar. Aqui, descrevemos um método simples para a quantificação da resposta alimentar no qual a distância entre a extremidade apical do tentáculo e a boca da hidra é medida e a razão dessa distância antes e depois da adição de GSH é determinada. Descobriu-se que a proporção, chamada de propagação relativa dos tentáculos, fornece uma medida da resposta alimentar. Este ensaio foi validado usando um modelo de fome no qual a hidra faminta mostra uma resposta alimentar aprimorada em comparação com a hidra alimentada diariamente.

A glutationa faz com que a hidra exibem ondulação dos tentáculos para a boca com a finalidade de engolindo a presa. Essa ondulação de tentáculos traz extremidades apicais dos tentáculos mais perto do hypostome. Isto resulta na redução da propagação tentáculo, ou a distância linear entre a extremidade apical do tentáculo e hipostoma (Figura 1). A propagação tentáculo parente, ou a proporção de tentáculo média espalhar antes e após a adição de glutationa, em média em vários pólipos reduz ao longo do tempo...

Aqui descrevemos um ensaio simples para a quantificação da resposta alimentar em hidra induzida pela forma reduzida de glutationa. Este ensaio baseia-se na medição da distância entre a extremidade apical do tentáculo e a boca da hidra.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Neste vídeo, descrevemos um método para medir o comportamento alimentar em Hydra. Em resposta à forma reduzida de glutationa, Hydra se alimenta de uma variedade de animais, nematóides, crusta e peixes recém-nascidos. Na camada externa deste animal em camadas de duas células, existem células especializadas chamadas nematocistos.Os nematocistos têm gatilhos que, quando ativados pelo movimento da presa no fluido circundante, causam a descarga dos fios de amarração. Os fios pungentes são inseridos na presa. A presa ferida libera glicose em excesso.Ion hydro tem uma sensação de quimioterapia para detectar a glutationa no líquido circundante. Isso desencadeia um comportamento alimentar envolvendo seu sistema nervoso. O comportamento alimentar em Hydra inclui enrolar os tentáculos para trazer a presa em direção a uma abertura hiperscópica da boca e engolfamento da presa.De fato, adicionar íon glut ao ambiente causa a reação de alimentação na hidra, mesmo na ausência de presas. Para entender a interação da sensação de quimioterapia e do sistema nervoso, precisamos quantificar o comportamento e criar medidas precisas e confiáveis. Em alguns relatos anteriores, o tempo durante o qual a boca é hidro permanece aberta é tomado como uma medida da resposta alimentar, mas observar a duração da abertura da boca nos pólipos hidro é tedioso e está sujeito a variações induzidas por parâmetros incontroláveis, como a orientação da boca devido a observações.Outro método de quantificação do comportamento é baseado no número de hidras em uma população que mostra a resposta alimentar. No entanto, como a resposta alimentar é um parâmetro quantitativo individual, as abordagens baseadas na população são variações subjetivas causadas pela opinião do observador individual. As principais vantagens do método alternativo que descrevemos aqui é que ele é muito fácil de executar e altamente reprodutível.Mantenha a hidra a 18 graus Celsius sob 12 horas de luz. Ciclos escuros de 12 horas em um meio contêm em uma tigela de vidro e alimentam-nos diariamente com emia para medir a resposta alimentar. Transfira um hidropólipo maduro para um poço de uma placa de 24 poços, remova o meio residual do poço usando um pivô.Isso é facilitado inclinando a placa, descartando o excesso de meio e, em seguida, adicionando imediatamente 500 microlitros de meio fresco Preparação da solução de glutationa. Uma solução de nove micromolares de glutationa é preparada usando meio hidro. Lembre-se de que a solução de glutationa é propensa à oxidação, portanto, sempre use uma solução de glutationa recém-preparada.Para cada experimento, transfira a placa para a plataforma de imagem de um microscópio. Tendo provisão para gravação de imagens, use um fundo escuro de modo que o comportamento do hidropólipo possa ser claramente visualizado contra o fundo contrastante. Certifique-se de que o pólipo esteja localizado ao longo da parte central do poço capturou uma imagem de hidra no estado relaxado.Esta será uma observação de ponto de tempo zero. Adicione rapidamente nove soluções micromolares de glutationa para atingir uma concentração final de três micromolares no poço. Inicie o temporizador imediatamente após adicionar a solução de glutationa e capture imagens a cada 15 ou 30 segundos por quatro a cinco minutos sem alterar as configurações de ampliação.Para medições, usamos gim versão dois, gim. Um programa de manipulação de imagens GNU é um software que pode ser baixado gratuitamente da Internet. Abra cada uma das imagens capturadas no gim.Este programa possui uma ferramenta de medição disponível nas ferramentas do menu. Meça a distância entre hipers, estoma, extremidade apical de cada um dos tentáculos pode ser medida usando esta ferramenta. Essa distância é chamada de propagação de tentáculos.Calcule a propagação média do tentáculo para cada pólipo antes e depois da glutationa. Calcule a proporção da propagação média dos tentáculos no tempo zero. Aponte para isso em cada um dos pontos de tempo subsequentes.Vamos chamar isso de propagação relativa de tentáculos. Faça essas medições para pelo menos 20 pólipos para fome. Transfira alguns hidropólipos para uma tigela de vidro separada e não os alimente por cinco dias.Alimente os pólipos de controle diariamente com artia no dia do experimento. Alimente o grupo de controle de Hydra com artia para um R e use essas hydra para os experimentos subsequentes. Meça a resposta alimentar da hidra faminta em comparação com a hidra do grupo de controle pelo método descrito anteriormente neste vídeo para evitar qualquer viés devido ao tempo de alternância, as medições de cada um dos pólipos hidrópicos famintos e controlados.A glutationa faz com que a hidra exiba o enrolamento dos tentáculos em direção à boca. Essa curvatura aproxima as extremidades apicais dos tentáculos da tempestade hipoglicêmica. Isso resulta na redução da distância linear entre as extremidades apicais do tentáculo e a hipertempestade ou propagação do tentáculo.O tentáculo relativo se espalhou após a adição do meio. A falta de glutationa reduz apenas transitoriamente. Ele volta para um em cerca de um minuto.Sabe-se que a fome causa melhora do comportamento alimentar induzido pela glutationa. O tentáculo espalhado um minuto após a adição de glutationa foi significativamente menor para o grupo de funcionários em comparação com o grupo saciado. Todos os animais usam a sensação de quimioterapia para detectar alimentos.Hydra usa um sinal químico na forma de glutationa liberada da presa ferida, tem um sistema nervoso simples sem qualquer estrutura semelhante ao cérebro, então o mecanismo molecular da sensação de quimioterapia e sua modulação dependente do status de alimentação também são provavelmente simples. A compreensão desse mecanismo pode lançar luz sobre a evolução de uma regulação da alimentação em animais superiores. No entanto, nem o receptor que pode se ligar à glutationa nem quaisquer outros componentes da cascata de sinalização a jusante são relatados em Haida até esta data.Inibidores farmacológicos de vias comuns de sinalização sensorial de quimioterapias e o uso de técnicas avançadas de biologia molecular para alterar a expressão de tais proteínas de sinalização e receptor de glutationa podem se mostrar ferramentas poderosas para a compreensão do mecanismo molecular da alimentação. Em Hydra, no entanto, uma medida confiável do comportamento alimentar alterado é necessária para entender a extensão de quaisquer modificações causadas por tais investigações experimentais. Aqui apresentamos um método que não é apenas confiável, mas também fácil de executar e altamente reprodutível.

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Biologia

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Este artigo descreve um protocolo para determinar diferenças no estado basal redox e respostas redox a perturbações agudas em neurônios hipocampais primários e corticais usando microscopia viva confocal. O protocolo pode ser aplicado a outros tipos de células e microscópios com modificações mínimas.

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A quantificação das formas oxidada e reduzida de glutationa (GSSG e GSH, respectivamente) foi obtida através do uso de orto-ftalaldeído (OPA). O OPA torna-se altamente fluorescente uma vez conjugado ao GSH, mas é incapaz de conjugar o GSSG até que seja reduzido. Aqui, descrevemos um ensaio multiparamétrico para quantificar ambos usando quantificação de proteínas para normalização.

Quantificação rápida de formas oxidadas e reduzidas de glutationa usando orto-ftalaldeído em células de mamíferos cultivadas in vitro

Este protocolo descreve um ensaio para quantificar a taxa de alimentação de Caenorhabditis elegans com base na medição da depuração de bactérias em cultura líquida.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Usando imagens em time-lapse, é possível acompanhar todo o processo de regeneração dos esferoides da Hydra . Este protocolo descreve a geração de esferoides Hydra , discute uma variedade de estratégias de montagem e detalha como realizar imagens ao vivo de longo prazo usando microscopia confocal de disco giratório, bem como microscopia de fluorescência de folha de luz.

Preparação e Imagem ao Vivo de Esferoides de Hidra em Regeneração

Aprenda a medir a resposta alimentar induzida por glutationa em Hydra usando análise de vídeo e medição da distância tentáculo-boca. Este método reprodutível auxilia pesquisas em neurociência e biologia do comportamento.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

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