Name: Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a produzir e usar lentivírus para transduzir seletivamente células precursoras de oligodendrócitos primárias em ensaios de mielinização in vitro. Este método permite estudar funções proteicas no sistema nervoso central.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional Australiano de Saúde e Pesquisa Médica (bolsa NHMRC # 454330 para JX, concessão de projeto # 628761 para SM e APP1058647 para JX), Pesquisa de Esclerose Múltipla da Austrália (MSRA # 12070 para JX), Esquema de Apoio à Pesquisa da Universidade de Melbourne e Bolsa de Pesquisa CI de Melbourne para JX, bem como Bolsas de Pós-Graduação da Austrália para HP e AF. Gostaríamos de reconhecer o Esquema de Infraestrutura Operacional do Departamento de Inovação, Indústria e Desenvolvimento Regional, Victoria, Austrália.

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</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses em relação a esta pesquisa.

Mielinização de axónios é um processo crucial para a função óptima de ambos os sistemas nervosos central e periférico de vertebrados. A geração e manutenção de axónios mielinizados é um processo complexo e coordenada envolvendo interacções moleculares entre neuronal, glial (a partir de células de Schwann ou oligodendrócitos) e as proteínas de matriz extracelulares. A importância e aplicabilidade deste protocolo é que ele permite a manipulação de proteínas em um tipo específico de célula dentro das configurações de co-cu...

Mielinização de axónios é crucial para a transmissão rápida e eficiente do potencial de acção em ambos os sistemas nervosos central e periférico. As células especializadas, as células de Schwann no sistema nervoso periférico e oligodendrócitos no sistema nervoso central, enrole e embainham axônios em mielina, efetivamente isolamento do nervo e que facilitam a condução saltatory 1. O processo de mielinização pode ser estudada in vitro usando neurónios ganglionares da retina 2, 3, nanofibras modificadas ou neurónios do gânglio da raiz dorsal de co-cultivados quer com células de Schwann 4 ou oligodendrócitos 5-7. O ensaio de mielinização in vitro é um modelo estabelecido para o estudo da mielinização do sistema nervoso e que replica muitos dos processos fundamentais que ocorrem durante a mielinização in vivo 5-8. O teste envolve a co-cultura das populações puras de gânglio de raiz dorsal (DRG) neurônios, com OPCs (para CNS mielinização) ou células de Schwann (por PNS) mielinização. Sob condições específicas destas células mielinizantes embainham axónios DRG na ordenada, ultra-estruturalmente verificado, folha multi-lamelar de isolamento membrana plasmática que expressam o mesmo complemento de proteínas específicas de mielina presentes in vivo. O modelo de célula mais vulgarmente utilizado de estudar a mielinização do SNC in vitro é a co-culturas de neurónios DRG e OPCs, que têm sido utilizados com êxito para estudar o efeito de que os factores exógenos, tais como as neurotrofinas exercer sobre a mielinização do SNC in vitro 5,6. Factores exógenos, tais como factores de crescimento ou inibidores farmacológicos de moléculas pequenas têm sido amplamente utilizado para estudar o papel das vias de sinalização na mielinização DRG utilizando o modelo de co-cultura OPC-7,9. No entanto, nas configurações mistos de co-cultura que contêm ambos os neurónios e os oligodendrócitos, manteve-se formalmente possível que ambos os factores de crescimento ou a farmacovigilâninibidores macological poderiam ter exercido efeitos sobre ambos os neurônios e oligodendrócitos (OL) DRG. Esta não oferecem a capacidade de dissecar especificamente os papéis que as proteínas expressas apenas por DRGs ou oligodendroglia exerce sobre mielinização usando este sistema de célula dual. Para confirmar inequivocamente que a via de sinalização em oligodendroglial regula directamente a mielinização, transdução lentiviral de OPCs, antes da semeadura sobre neurónios DRG para o ensaio de mielinização in vitro, provou ser uma maneira elegante para sobre-expressar tanto o tipo selvagem e as proteínas mutantes, assim como knockdown expressão de proteínas expressas constitutivamente por oligodendrócitos. Assim, esta abordagem oferece uma avenida para interrogar especificamente e manipular as vias de sinalização dentro oligodendrócitos para estudar myelination 9,10. Neste artigo, apresentamos métodos que desenvolvemos para superexpressão de uma proteína de interesse seletivamente em oligodendrócitos através de um lentivírusabordagem para estudar a mielinização in vitro. A técnica começa com a geração de vectores de expressão contendo o gene de interesse, quer seja numa tipo selvagem, forma constitutivamente activa ou negativo dominante, que são então subsequentemente clonado no vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Este vector (contendo o gene de interesse), o promotor de CMV dador (pENTR L4-R1-pENTR pDNOR-CMV) e lentivector 2K7 são combinados numa reacção de enzima para produzir um vector de 2K7 contendo promotor de CMV, o gene de interesse, uma local interno de entrada ribossomal e GFP (Figura 1). Este constructo gateway 2K7 clonado combinado com o envelope do vírus, e o pacote PMD2.G vírus pBR8.91 podem ser co-transfectados em células HEK293T para gerar lentivírus que pode subsequentemente ser utilizado para transduzir OPCs. Uma vez infectadas com lentivírus os OPCs expressam um alto nível da proteína de interesse. Estes OPCs podem então ser semeadas em culturas de neurônios DRG eo efeito que a expressãode níveis elevados da proteína desejada exerce sobre a mielinização pode ser interrogada. As co-culturas são avaliadas para a expressão da proteína de mielina por análise Western blot e visualizados para a formação de segmentos axonais mielinizadas por imunocitoquímica.

<table><tbody><tr><td>Lentivetor 2K7&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Gentil presente do Dr. Suter9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG anti-rato de cabra</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG anti-coelho de cabra (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG anti-rato de cabra (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - Suplemento Neuronal NeuroCul SM1</td><td>Stem Cell Technologies&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Humano)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotina (d-Biotina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO mídia de montagem de fluorescência</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, cálcio, magnésio</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Vetores de entrada para promotor e gene de interesse</td><td></td><td></td><td>Gerar de acordo com os protocolos 1-2</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glicose (D-glicose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Veja soluções em estoque</td></tr><tr><td>IgG Anti-Rato para Cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>IgM Anti-Rato para Cabras&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>IgG Anti-Rato para Cabras</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Ver soluções em estoque</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Ver soluções em estoque</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium Life Technologies da Leibovitz</td><td></td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina- 200 mM (100x) líquido</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus enzima</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, sem glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Mouse &alpha; &beta; III Tubulina&nbsp;</td><td>Mouse Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MBP (monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na piruvato&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (mouse)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo O1 - Camundongo anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternativa se as células do hibridoma O1 não estiverem disponíveis</td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td>do hibridoma O1</td><td>Meio condicionado contendo anticorpo anti-O1 a ser usado para imunopanning</td></tr> do <tr><td>anticorpo O4 - Camundongo anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternativa se as células do hibridoma O4 não estiverem disponíveis</td></tr><tr><td>Células</td><td></td> <td>do hibridoma O4</td><td>Meio condicionado contendo anticorpo anti-O4 a ser usado para imunopanning</td></tr><tr><td>Células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Suspensão de papaína</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Gentil presente do Dr. Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Humano)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenonimina (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido inibidor de protease (Mini completo)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td></td><td>Fornecido com enzima clonase</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Coelho &alfa; neurofilamento</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Coelho &alfa; MBP (policlonal)</td> <td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2 células de hibridoma</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>Meio condicionado contendo anticorpo anti-Ran2 a ser usado para imunopanning</td></tr><tr><td>Anticorpo anti CD140A/PDGFRa de rato</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC meio</td><td></td><td></td><td>Fornecido com bactérias competentes</td></tr><tr><td>Selenito de sódio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH8</td><td></td><td></td><td>Veja soluções em estoque</td></tr><tr><td>TNE lysis buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace Elements B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin (apo-Transferrin humano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>de Clara de Ovo de Galinha</td><td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenol (0,05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Não Conjugada Lectina BSL-1</td><td>Vector laboratories&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

produção e uso de lentivírus a seletivamente transduzem primária oligodendrocyte células precursoras para in vitro os ensaios mielinização

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Mielinização é um processo complexo que envolve ambos os neurónios e as células formadoras de mielina da glia, oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Usamos um ensaio in vitro mielinização, um modelo estabelecido para o estudo da mielinização do SNC in vitro. Para fazer isso, as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) são adicionados aos gânglio da raiz primária roedor dorsal (DRG) neurónios purificados para formar myelinating co-culturas. A fim de interrogar especificamente os papéis que determinadas proteínas expressas pelos oligodendrócitos exercer sobre mielinização nós desenvolvemos protocolos que transduzem seletivamente OPCs usando o lentivírus overexpressing tipo selvagem, proteínas negativas constitutivamente ativos ou dominantes antes de serem semeadas em neurônios do GRD. Isso nos permite interrogar especificamente as funções destas proteínas na regulação oligodendrogliais mielinização. Os protocolos podem também ser aplicado no estudo de otos tipos de células, proporcionando assim uma abordagem que permite a manipulação selectiva de proteínas expressas por um tipo de célula desejado, tais como oligodendrócitos orientada para o estudo de mecanismos de sinalização e de compensação. Em conclusão, a combinação de ensaio in vitro com a mielinização lentivirais infectados OPCs fornece uma ferramenta estratégica para a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na mielinização.

O marcado com bandeira extracelular quinase 1 (Flag-Erk1) relacionado com o sinal de constructo utilizado para a produção de lentivírus é verificada por digestão com enzimas de restrição das construções usadas, incluindo tanto as construções 2K7 e as construções de empacotamento e acessórias necessárias para produção de vírus (Figura 3) . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> Figura 3: verific...

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

O objetivo geral deste procedimento é manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs para expressar proteínas de interesse. Para o estudo in vitro da nação de mielinização do SNC, isso é realizado primeiro clonando um vetor lentiviral. Os próximos passos são produzir o lentivírus e determinar a concentração viral ideal para o experimento.Em seguida, OPCs dissecados e cultivados são transduzidos com o lentivírus. A etapa final é semear os OPCs transduzidos em neurônios cultivados dissecados do DRG. Em última análise, as coculturas mielinizantes são avaliadas quanto à expressão da proteína mielina por análise de western blot e visualizadas para a formação de segmentos axonais mielinizados por imunocoloração.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como ferramentas farmacológicas, é que a abordagem lentiviral nos permite superexpressar seletivamente o tipo selvagem ou as proteínas mutantes em nosso tipo de célula desejado, como neste caso, oligodendrócitos Em preparação clone os 2K necessários sete vetores emprestados, conforme descrito no protocolo de texto na manhã do dia da transfecção, preparar 32 milhões de células T HEK 2 93 num balão T 1 75 contendo 25 mililitros de meio. Criticamente, essas células devem ser presas antes da transfecção, portanto, coloque-as em placas mais cedo, se necessário. Em um tubo Falcon de 50 mililitros, prepare uma mistura principal para a transfecção do frasco T 1 75 conforme detalhado na tabela um, adicione DNA ao vórtice DMEM quente e, em seguida, adicione PEI estéril por último para evitar precipitação prematura.Misture bem invertendo o tubo três ou quatro vezes e, em seguida, incube a mistura por cerca de 15 minutos na bancada. Troque o meio nas células e adicione a mistura de transfecção. O DROPWISE mistura suavemente o meio sobre as células e, em seguida, incuba as células durante a noite.No dia seguinte. A expressão de GFP pode ser verificada por microscopia de fluorescência. 48 horas após a transfecção, colete o primeiro lote de sobrenadante viral e adicione 25 mililitros de meio fresco às células.Centrifugue o sobrenadante viral a 1.140 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante viral sem o pellet de detritos celulares para um novo tubo e armazene-o a quatro graus Celsius. No dia seguinte, 72 horas após a transfecção, colete o último lote de centrífuga sobrenadante viral para remover os detritos celulares e agrupar com o primeiro lote de sobrenadante viral eliminado.Em seguida, concentrar o vírus centrifugando o sobrenadante viral a 170 000 Gs durante 90 minutos. A quatro graus Celsius. Descarregue a ultracentrífuga e despeje o sobrenadante, deixando um palato de PEI precipitado e o vírus, que não é visível no fundo do tubo de 30 mililitros.Repita este processo. Centrifugação de todos os supernat virais em lotes nos mesmos tubos de 30 mililitros para concentrar o vírus e ressuspender o vírus em cada tubo de ultracentrífuga. Adicione 500 microlitros de mídia Sato e cubra o tubo com filme.Em seguida, agite o tubo por 30 segundos e desaloje mecanicamente o pellet com uma ponta de pipeta. Repita este ciclo de desalojamento de vórtice cerca de seis vezes para garantir que o pellet esteja totalmente suspenso no meio Sato. Agora junte todo o vírus ressuspenso em Sato em um novo microtubo.Gire brevemente o sobrenadante acumulado na velocidade máxima por um minuto. Para granular, o PEI coleta o sobrenadante que contém o vírus e filtra passando a solução por um filtro de 0,45 mícron usando uma seringa para embrulhar. Aliquotar o vírus purificado em Sedia em volumes de 2050 e 100 microlitros e armazená-los todos a 80 graus Celsius negativos.Para este protocolo, ter células precursoras primárias de oligodendrócitos. OPCs cultivados em placas de 10 centímetros com 10 mililitros de sédios contendo os seguintes fatores de crescimento, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT três, e para as células devem ter sido cultivadas por 24 horas sob 8%Dióxido de carbono. Comece aspirando a mídia e remova-a completamente.Em seguida, substitua-o por 10 mililitros do mesmo meio com os fatores de crescimento. Infecte seus OPCs com lentivírus, expressando a proteína de interesse, adicionando o volume necessário de vírus gota a gota na mídia. Também em uma placa OPC separada, misture o lentivírus de controle que expressa apenas GFP na cultura de mídia, as células por mais 48 horas.Em seguida, colete os OPCs das placas para semear nos neurônios GRG cultivados. Primeiro enxágue cada placa com oito mililitros de EBSS duas vezes. Prepare um mililitro de tripsina EDTA 0,05% com nove mililitros de EBSS quente.Adicione cinco mililitros da tripsina diluída a cada placa. Incube a 37 graus Celsius por até dois minutos. Neutralize a tripsina adicionando cinco mililitros de 30% de FBS em EBSS.Em seguida, usando uma pipeta de 10 mililitros. Lave os OPCs da superfície da placa. Gire a placa um quarto de volta de cada vez para coletar todas as células.Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue as células à temperatura ambiente durante 15 minutos a 180 Gs.Aspirar agora o sobrenadante e resus. Suspenda o pellet celular em um mililitro de meio saddo quente sem fatores de crescimento e conte as células.Em seguida, prepare os neurônios DRG que são cultivados nas lamínulas de 22 milímetros, aspirando completamente o meio de sua placa. Em seguida, semeie suavemente 200.000 OPCs gota a gota em cada lamínula. O volume de semeadura deve ser inferior a 200 microlitros por lamínula.Deixe as células assentarem sem mover a placa Após 10 minutos, cubra cada poço com um mililitro de água quente. Agora reproduza os OPCs irmãos restantes. Com fatores de crescimento contendo som, eles podem ser usados posteriormente para verificar a expressão da proteína de interesse.Uma bandeira marcou quinase relacionada ao sinal extracelular. Uma construção foi usada para restrição de produção de lentivírus Enzimas foram usadas para verificar a construção da embalagem e a construção acessória para determinar a diluição ideal do vírus a ser usada nos OPCs. O lentivírus IR um foi titulado em células T HEK 2 93 em uma faixa de diluição viral para células T HEK 2 93.Os níveis de expressão do gene de interesse aumentaram com o tempo. Em seguida, OPCs purificados foram infectados e cultivados por pelo menos dois dias para garantir a expressão do transgene. Os níveis de FLAG e GFP foram confirmados em OPCs irmãos.Os OPCs foram então assentados nos neurônios DRG. As OPCs então se diferenciaram em oligodendrócitos e, conforme avaliado por westerns, começaram a expressar proteínas de mielina. Alguns oligodendrócitos maduros mielinizados, que foram visualizados por axônios de coloração MBP, foram corados por neurofilamento ou beta três tubulina para garantir que as densidades dos axônios fossem levadas em consideração.Ao analisar os níveis de mielinização Depois de semear os OPCs, é importante cultivar. Os APCs irmãos. Dessa forma, a proteína de interesse ou a marca na proteína de interesse, essa expressão pode ser verificada nas APCs irmãs se não puder ser verificada na co-cultura.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de...

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

O vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) em oligodendrócitos e induzir mielinização em uma co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG). As OPCs são transduzidas com vetores lentivirais que codificam uma proteína sinalizadora que regula a mielinização. Os OPCs transduzidos são co-cultivados com neurônios DRG para avaliar a diferenciação em oligodendrócitos e a mielinização induzida por proteína de sinalização.

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Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

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Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização (Vídeo) | JoVE Journal

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