Name: Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a modelar candidíase mucosa em peixes-zebra juvenis por injeção na bexiga natatória. Este método permite imagem em tempo real das interações patógeno-imunidade usando microscopia confocal.

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Os autores agradecem ao Dr. Le Trinh e Dr. Tobin para generosamente fornecer a α-catenina: linha citrino peixes e Bill Jackman por nos permitir fazer a filmagem em seu laboratório. Os autores reconhecem as fontes de financiamento Institutos Nacionais de Saúde (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Projeto nº ME0-H-1-00517-13). Este manuscrito é publicado como principal Agricultura e Florestas Experiment Station número de publicação 3371.

NOTA: Todos os protocolos de cuidados de peixe-zebra e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH sob Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) A2012-11-03 protocolo. 1. Zebrafish Elevando a 4 dias após a fertilização <ol><li> Recolhe AB peixe-zebra, ou quaisquer outras linhas transgénicas, dentro da primeira hora após a fertilização 3, como mostrado em outro vídeo 34. </li><li> Incubar 120 ovos em um 15 centímetros placas de Petri contendo 150 ml de mídia E3 (mM NaCl 5; KCl 0,17; 0,33 mM CaCl 2; 0,33 mM MgCl2; HEPES 2 mM; pH 6,8) com azul de metileno (0,3 ug / ml definitiva concentração) em um 33 ° C incubadora com 12/12 luz / fotoperíodo escuro. </li><li> Substituir o material após 6 h com E3 + PTU (1-fenil-2-tioureia, 10 ug / ml de concentração final) e remover os ovos mortos. </li><li> Incubar durante 4 dias a 33 ° C, trocando a mídia com nova E3 + PTU após 2 dias. </li></ol> 2. Eminjeção Micro-agulha Preparação <ol><li> Puxe capilar borosilicato (OD 1,2 milímetros; ID 0,69 milímetros) em um micro-agulha usando um extrator agulha com as seguintes configurações (550 Calor; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time). NOTA: As configurações irão variar de filamento para filamento para se obter micro-agulhas em forma semelhante (ver Figura 1) e necessitam de ser reajustados sempre que um novo filamento está instalado. </li><li> Encha uma micro-agulha com 3 ul de 0,4 um filtrou-tampão salino de fosfato (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM de Na 2 HPO 4; 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma pipeta de 20 uL microloader ponta. </li><li> Defina-se a micro-agulha num suporte de micropipeta em um micromanipulador ligado a um sistema de injecção de pressão. Ajuste a pressão de injeção para 30 PSI e a duração do pulso de 30 ms. </li><li> Usando uma placa de Petri com água destilada, inferior a micro-agulha até 1/5 da agulha está na água. Clipe da wi micro-agulhath uma pinça fina logo abaixo do nível da água. Traga a micro-agulha para fora da água e empurrar o pedal várias vezes até um bolus aparece. </li><li> Medir o diâmetro do bolo baixando a micro-agulha em um hemocitómetro em camadas com uma gota de óleo de tipo A imersão. Ajustar a duração do impulso para obter o volume desejado (ver Tabela 1). </li><li> Ajuste da contrapressão para o bólus se mantenha estável em óleo (diminuir a pressão, se aumenta o volume do bolo e aumentar a pressão de retorno se o volume de bolus diminui). Grave a duração do pulso para cada micro-agulha. </li><li> Retire a PBS da micro-agulha, aspirando-lo usando uma ponteira microloader e expulsar a esquerda-over PBS, colocando-o de volta no injector e apertar o interruptor de pulso contínua. Reserve cada micro-agulha. </li></ol> 3. Preparação Candida <ol><li> Streak Candida albicans transformada com otimizado-códon dTomato, GFP, BFP, EOS ou FarVermelho de um lote congelado (-80 ° C estoque em glicerol a 25%) usando um passador de madeira estéril para uma levedura dextrose peptine (YPD) placa de agar (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 20 g / L de dextrose , 20 g / L de agar; autoclavado e verteu-se 25 ml em placas de Petri) e incubar durante a noite a 30 ° C. </li><li> Escolha uma colónia utilizando um pino de madeira e estéril para inocular 5 ml de meio YPD líquido (10 g de extracto / L de levedura, 20 g / L de peptona, 20 g / L de dextrose, autoclavado e assepticamente em alíquotas de 5 ml em 16 x 150 milímetros de cultura de vidro tubos). </li><li> Incubar durante a noite a 30 ° C num tambor de rolos a 60 rpm. </li><li> Colete 1 ml de C. albicans cultura e transferência para um tubo de centrífuga de 1,7 ml estéril. </li><li> Centrifugar a 5000 xg por um par de segundos. Esvazie o sobrenadante e adicionar 1 ml de PBS estéril, vortex completamente. Repita isso duas vezes. </li><li> Contar as colónias utilizando um hemocitómetro por diluição do stock 1 mL de 1: 1000 em PBS estéril. </li></ol> 4. Injetar Zebrafish ema bexiga natatória <ol><li> Aquecer um prato de injecção (2% de agarose) durante 30 min em uma incubadora de 33 ° C. </li><li> No momento desejado, remover 100 dos 150 ml de E3 + UTP a partir do prato de 15 centímetros de Petri contendo o peixe para injectar, utilizando uma pipeta de 25 ml sem aspirar qualquer peixe-zebra. </li><li> Anestesiar 4 dpf peixe-zebra por adição de 2 ml de uma mistura 4 mg / ml tamponado tricaina metano sulfonato estoque (TR) para os restantes 50 ml de meio (concentração final de 200 ug / ml) e aguardar durante 15 minutos. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, selecione peixe com uma bexiga natatória inflado. Os peixes também podem ser rastreados na época para fenótipo mais homogêneo, como a distribuição de neutrófilos em mpo: linha GFP utilizando um microscópio de epifluorescência dissecando. </li><li> Dilui-se a C. albicans de estoque a sua concentração original (passo 3.8) e 1,5 x 10 7 unidades formadoras de colónias por ml (cfu / ml) em PBS. </li><li> Transferir 30 peixes-zebra para o prato de injecção usando um tubo de transferência de plásticotte e remover o excesso de mídia. </li><li> Usando uma ferramenta de fio de pesca (0,012 polegadas de diâmetro linha de pesca super-colado em um capilar de borosilicato), fazer 3 linhas de 10 peixes, segurando o prato injeção vertical e orientar o peixe verticalmente. </li><li> Retire o excesso de mídia. </li><li> Absolutamente vortex do tubo com 1,5 x 10 7 ufc / mL C. albicans. </li><li> Encha um micro-agulha com 3 l de C. albicans utilizando uma nova ponta microloader pipeta e definir a duração do pulso para a definição apropriada (veja o passo 2.9). </li><li> Rode o prato de injeção para fazer um ângulo de 20 ° entre o micro-agulha ea cabeça do peixe, que aponta para a parte de trás da bexiga natatória (Figura 3A). </li><li> Empurrar o micro-agulha para dentro da bexiga natatória, certificando-se o furo da agulha está no lúmen, e uma vez que pressiona o pedal. </li><li> Repita o procedimento para cada peixe e transfira para um prato de recuperação (25 ml E3 + PTU) inundando o prato com um E3d esvaziando-a no prato de recuperação. </li><li> Transferir mais 30 peixes para o prato de injecção. </li><li> Repita injeção com um novo micro-agulha cheia com cuidadosamente agitadas C. albicans. </li><li> Concluir através da injecção do controlo de PBS, se necessário, utilizando um prato de injecção diferente, para evitar a contaminação e transferir para uma cápsula de recuperação separada (passo 4.10). </li></ol> 5. Triagem do Peixe para o inóculo desejado <ol><li> Preparar 40 ml de 0,4% de baixo ponto de fusão solução de agarose (LMA) através da adição de 160 mg de agarose de baixo ponto de fusão a 40 ml de E3, fervendo por microondas até à dissolução, e de se arrefecer para 37 ° C. Adicionar 400 ul de TR (concentração final de 200 ug / ml) uma vez arrefecida. </li><li> Depois de 30 minutos de recuperação, anestesiar os peixes como descrito (passo 4.3 utilizando apenas 1 ml de TR em 25 mL E3 + PTU, concentração final de 200 ug / ml). </li><li> 30 Transferência de peixe (com um mínimo de meios quanto possível) a 2 ml de LMA em peso de um barco. </li><li> Aspirar peixes individuais com uma pipeta de transferência e a placa de peixe com um LMA em gotas de uma placa de imagiologia de 96 poços, utilizando-se apenas os 10 x 6 poços centrais. </li><li> Repita até que todos os peixes para a tela são carregados para a placa de imagem. </li><li> Deixar os meios solidificar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Coloque o peixe do seu lado, certificando-se que eles estão em contato com o fundo de vidro. </li><li> Usando o objetivo 20X em um epifluorescência / microscópio confocal invertido e o filtro apropriado, registrar o número de C. células de levedura albicans na bexiga natatória de cada peixe. </li><li> Selecione o peixe com 15-25 células de levedura na bexiga natatória (ou inóculo desejado), eutanásia peixe não selecionados (800 ug / ml de TR na E3) e retornar peixe selecionado para um prato fundo Petri com 50 ml de E3 + PTU por adicionar 3 gotas de E3 para a chapa de imagem poços selecionados e aspirar o peixe com uma pipeta de plástico. </li><li> Incubar a 33 ° C durante o tempo desejado. </li></ol> 6. Imaging o Peixe Pós-screening <ol><li> No momento desejado, remover 25 dos 50 ml de meio E3 + PTU do prato fundo Petri contendo o peixe para a imagem. </li><li> Anestesiar os peixes como descrito (passo 4.3 utilizando apenas 1 ml de TR em 25 ml E3 + PTU remanescente, concentração final de 200 ug / ml). </li><li> Placa o peixe para uma placa de imagiologia de 96 poços e posição apropriadamente (passos 5,3-5,7). </li><li> Imagem por microscopia confocal utilizando os lasers adequados e filtros de emissão. Primeiro foco nos peixes usando o objetivo 4X sob contraste de interferência diferencial (DIC) e adquirir imagens da região de interesse, utilizando o objetivo 20X com os lasers confocal em modo de digitalização com 2 velocidade ms / pixel e 1024 x 600 pixel proporção. Adquirir Z-stacks com 1 mm tamanho do passo, aplicando-se o modo de filtro de Kalman de 3 frames. </li><li> Retornar para um prato fundo de Petri com 50 ml E3 + PTU ou em individual (poços de 24 poços do prato de cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubar a 33 ° C. </li></ol> 7. Dissecando a bexiga natatória <ol><li> Encher uma seringa de 10 ml com graxa alto vácuo. </li><li> Prepara-se uma LMA 2% (passo 5.3 com 160 mg de agarose a baixo ponto de fusão em 8 ml de E3). </li><li> No momento desejado, anestesiar o peixe (passo 5.2). </li><li> Transferir 10 de peixe para um tubo de centrífuga de 1,7 mL com 1 ml de E3 e eutanásia por adição de 200 ul de 4 mg / ml tricaina (concentração final de 800 ug / ml) para o tubo de centrifugação e incubação durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare uma lâmina de vidro de imagem, colocando 4 gotas de graxa de vácuo em uma praça, com 1 cm de diferença em um microlâmina (75 x 25 mm, Figura 2). </li><li> Coloque 2 gotas de 2% LMA no meio da praça. </li><li> Coloque um peixe em uma lâmina de vidro separada sob um microscópio de dissecação e verificar que o coração parou de bater, retire o excesso de água. </li><li&gt; Usando uma pinça fina dissecar a bexiga natatória, mantendo a cabeça em uma posição fixa com a pinça esquerda e puxando para baixo o intestino anterior com a pinça direita (Figura 4A). </li><li> Pegue o swimbladder pelo duto pneumático com a pinça esquerda, separando-o do aparelho digestivo, e colocá-lo no centro da LMA 2% antes de ela se solidifica. </li><li> Colocar uma tampa de deslizamento (18 x 18 mm) na parte superior da lâmina de vidro de imagem e empurrá-lo até que ela toque a graxa vácuo, bem como o LMA (Figura 2). </li><li> Imagem dentro de 10 min de esvaziamento, tal como descrito na etapa 6.4. Repita o passo 7,7-7,11 com os outros peixes. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os avanços e as limitações do modelo de doença microinjeção swimbladder O modelo apresentado aqui é uma extensão do modelo de imersão mucosa candidíase descrito no Gratacap et al (2013).; acrescenta as vantagens de um tempo de infecção controlada, uma dose de infecção altamente reprodutível, e, por conseguinte, uma maior eficiência. Nós demonstramos aqui novos métodos que permitem a documentação temporais não-invasivo de dinâmica de infecção em grande detalhe, bem como maior resolução ...

As infecções da mucosa podem levar a infecções da corrente sanguínea com risco de vida devido ao dano da barreira epitelial, que permite o acesso dos patógenos ao ambiente sistêmico1,2. Além disso, as infecções da mucosa também podem causar imunopatologia significativa, mesmo quando contidas externamente3-5. O fungo unicelular comensal Candida albicans está presente na maioria da população na cavidade oral e em outros locais da mucosa6-9. Embora normalmente contidos por respostas imunes inatas e adaptativas, defeitos imunes inatos e intervenções médicas podem levar a candidíase mucosa grave. O ataque à barreira epitelial resulta em um risco aumentado de doença disseminada com risco de vida, bem como imunopatologia, como no caso da candidíase vulvovaginal, além disso, a colonização por C. albicans tem sido associada à homeostase imunológica pulmonar10,11. A candidíase disseminada é agora a quarta infecção mais comum da corrente sanguínea em unidades de terapia intensiva12 e a mortalidade de até 40% a torna uma grande preocupação. Devido ao aumento dos tratamentos imunomoduladores para pacientes com doenças autoimunes, câncer ou transplantes de órgãos, é imperativo entender a interação entre esse patógeno e o compartimento imunológico da mucosa.
A maioria dos avanços biológicos celulares em relação às interações C. albicans-células no nível da mucosa vem de modelos in vitro13-15 e murinos16-18. Ambas as abordagens têm vantagens distintas, mas a capacidade de obter imagens de células vivas em alta resolução em um hospedeiro intacto limitou a caracterização temporal e espacial da infecção. Para esses estudos, há a necessidade de um modelo in vivo onde a interação de patógenos, imunes inatos e células epiteliais possa ser visualizada em um hospedeiro vertebrado intacto.
O peixe-zebra surgiu como uma ferramenta inestimável para a compreensão das doenças humanas, principalmente devido à sua transparência e facilidade de manipulação genética. O desenvolvimento de células e órgãos foi fotografado em detalhes requintados, o que levou à descrição de novos comportamentos de células imunes, como o comportamento das células T no timo em desenvolvimento19 ou a batalha entre micobactérias intracelulares e fagócitos20-22. Trabalhos recentes descreveram as interações micróbio-hospedeiro intestinal em peixe-zebra e mostraram que a colonização microbiana do trato intestinal afeta a fisiologia intestinal do hospedeiro e a resistência a outras infecções23,24. Além disso, a infecção através do epitélio intestinal foi descrita para vários patógenos.
Em contraste com o trato intestinal, a bexiga natatória representa um modelo de mucosa mais isolado e complementar. Este órgão é uma extensão do tubo intestinal em desenvolvimento e se forma anteriormente ao fígado e pâncreas25,26. Produz surfactante, muco e peptídeos antimicrobianos27,28 e anatomicamente, assim como ontogeneticamente, esse órgão é considerado homólogo do pulmão de mamíferos29,30. Como o duto pneumático permanece conectado ao intestino do peixe-zebra, isso permite que a infecção por imersão ocorra naturalmente. Notavelmente, as únicas infecções naturais conhecidas de peixes com espécies de Candida são infecções por C. albicans na bexiga natatória31. Recentemente, descrevemos um modelo experimental de infecção por imersão em que C. albicans infecta a bexiga natatória e descobrimos que essa infecção recapitula algumas das características da interação C. albicans-epitelial in vitro32,33. 
No método apresentado aqui, o modelo original de infecção por imersão é aprimorado injetando diretamente C. albicans na bexiga natatória de 4 dias após a fertilização (dpf) peixe-zebra. Isso permite um controle temporal preciso da infecção, bem como um inóculo altamente reprodutível. Ele permite imagens intravitais detalhadas, juntamente com a versatilidade do modelo de peixe-zebra. Como exemplo do que pode ser feito com este método, apresentamos a dinâmica espaço-temporal do crescimento de C. albicans juntamente com o recrutamento de neutrófilos para o local da infecção. Como o tecido da bexiga natatória do peixe-zebra é difícil de obter imagens intravitais, também apresentamos uma técnica rápida de dissecção da bexiga natatória que melhora o sinal de fluorescência e a resolução microscópica. Esses métodos expandem a caixa de ferramentas para pesquisas fúngicas, imunológicas e de aquicultura, além de descrever uma nova rota de infecção que pode ser traduzida para modelar outras infecções fúngicas, bacterianas ou virais de superfícies mucosas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri profundas</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Pinças finas (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Buchas de madeira</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Baixa agave de fusão</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta marrom flamejante</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de injeção capilar de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de contrapressão</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Kit de suporte de micropipeta</td><td>Instrumentação Científica Aplicada Interruptor</td> de pé <td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Scientific Instrumentação</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Base Magnética</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>Base</td><td></td>Magnética</tr><tr><td>Tricaine metano sulfonato</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>IX-81 com sistema confocal de varredura a laser FV-1000</td> 20X objetiva de microscópio Olympus UPlanSApo 20x/0,75 Tambor de rolo New Brunswick Scientific TC-7 Microloader pontas de pipeta <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de vidro (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Argila infantil (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro ( Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão tipo A</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Fio de pesca</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 placa de imagem de poço (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Microslide (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas (18 x 18 mm), N.º 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 15 cm (plásticos Olympus)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (produtos químicos EMD)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 24 poços (plásticos Olympus)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Peso dos barcos (8,9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem da mucosa candidíase em larval zebrafish por swimbladder injection

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Defesa precoce contra patógenos da mucosa consiste de uma barreira epitelial e células imunitárias inatas. A imunocompetência de ambos, e sua intercomunicação, são de extrema importância para a proteção contra infecções. As interações de células imunitárias inatas epiteliais e com um patógeno são melhor investigada in vivo, onde o comportamento complexo se desenrola ao longo do tempo e do espaço. No entanto, os modelos existentes não permitem fácil imaging espaço-temporal da batalha com patógenos ao nível da mucosa. O modelo desenvolvido aqui cria uma infecção das mucosas por injecção directa do agente patogénico fúngico, Candida albicans, em swimbladder de peixe-zebra juvenil. A infecção resultante permite imagens de alta resolução do comportamento das células epiteliais e imune inata ao longo do desenvolvimento da doença mucosa. A versatilidade deste método permite interrogatório do hospedeiro para sondar a seqüência detalhada de eventos imunológicos que levam a phrecrutamento agocyte e examinar os papéis de determinados tipos de células e vias moleculares na proteção. Além disso, o comportamento do agente patogénico como uma função do ataque do sistema imunológico pode ser iluminados simultaneamente por fluorescência utilizando-expressando proteína C. albicans. O aumento da resolução espacial da interação patógeno-hospedeiro também é possível através da técnica de dissecção da bexiga natatória rápida descrito. O modelo de infecção da mucosa descrito aqui é simples e altamente reprodutível, tornando-se uma ferramenta valiosa para o estudo da mucosa candidíase. Este sistema pode também ser amplamente traduzível a outros agentes patogénicos das mucosas, tais como micróbios micobacterianas, bacterianas ou virais que normalmente infectam através de superfícies epiteliais.

Microinjection na bexiga natatória posterior O método experimental aqui apresentado descreve a injecção de uma dose consistente de C. células de levedura albicans na bexiga natatória de 4 dpf peixe-zebra. Trabalhos anteriores com o modelo de imersão sugere que a resposta imune a bexiga natatória C. albicans é semelhante à da mucosa de mamífero candidíase 32. Aqui demonstramos um método de infecção modificado que é mais simples, mais rápida e reprodutível; v...

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

O objetivo geral deste procedimento é modelar a candidíase mucosa usando o peixe-zebra juvenil. Isso é feito carregando primeiro uma solução contendo os albicans vivos em uma microagulha. Na segunda etapa, um volume definido das células de levedura é injetado na bexiga natatória de um peixe-zebra juvenil.Em seguida, os peixes são rastreados para um inóculo homogêneo e incubados pelo tempo desejado. Na etapa final, a microscopia confocal é usada para acompanhar a interação dinâmica do patógeno com o sistema imunológico do peixe-zebra. Além disso, a bexiga natatória pode ser microO método que estamos apresentando aqui responde a questões-chave da imunologia fúngica, bem como da microbiologia, como qual é a sequência precisa de eventos que levam a uma resposta imune fracassada ao patógeno fúngico e sinalizadores de cândida nas superfícies mucosas. Antes de iniciar o procedimento, aqueça uma placa de injeção contendo 2%aros em uma incubadora a 33 graus Celsius. Após 30 minutos, use uma pipeta de 25 mililitros para remover 100 mililitros do meio E três mais PTU de uma placa do quarto dia, peixe-zebra pós-fertilização, tomando cuidado para não aspirar nenhum dos peixes, e adicione dois mililitros de quatro miligramas por mililitro.Estoque de sulfonato de metano Trica para a mídia para anestesiar os animais. Após 15 minutos, use um microscópio de dissecação para identificar os peixes com bexigas natatórias infladas e use uma pipeta de transferência de plástico para transferir 30 peixes-zebra para o prato de injeção pré-aquecido. Remova o excesso de mídia, segure o prato em um ângulo e use uma linha de pesca de 0,012 polegada de diâmetro super colada em um capilar de silicato de boro para fazer três linhas de 10 peixes alinhados verticalmente cada um em seguida vórtice completamente um tubo de albicans marinhos recém-preparados a uma concentração de 1,5 vezes 10 elevado ao sétimo UFC por mililitro.Em seguida, carregue três microlitros da solução de levedura na microagulha cortada EC. Defina a duração do pulso para a configuração apropriada. Em seguida, gire o prato de injeção para atingir um ângulo de 20 graus entre a microagulha e a cabeça do peixe apontando para a parte de trás da bexiga natatória.Agora empurre a microagulha para dentro da bexiga natatória, certificando-se de que o orifício da agulha esteja no lúmen e pressione a poça. Uma vez que verificar quais peixes foram injetados é relativamente fácil, pois o bolo desloca a bolha de ar e a parte de trás da bexiga natatória é posteriormente preenchida com meio, a injeção de co vermelho de fenol com o bolo pode facilitar ainda mais a visualização de uma injeção bem-sucedida. Depois de injetar todos os 30 peixes, inunde o prato com E três meios e esvazie o peixe no prato de recuperação.Transfira 10 animais para um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro contendo um mililitro de E três meios e eutanasiar o peixe com 200 microlitros de trica. Em seguida, para cada animal, arrume quatro gotas de graxa a vácuo em um quadrado, com um centímetro de distância em uma microlâmina, e adicione duas gotas de recém-preparado, 2% de baixo ponto de fusão no meio do quadrado. Em seguida, coloque um peixe em uma lâmina de vidro separada sob um microscópio de dissecação e verifique se o coração do animal parou de bater e remova o excesso de água.Agora use um par de pinças finas para segurar a cabeça em uma posição fixa e outro para puxar para baixo o intestino anterior. Pegue a bexiga natatória pelo duto pneumático, separando-a do trato digestivo, e coloque-a no centro de uma das microlâminas preparadas antes que o agro solidifique. Por fim, coloque uma lamínula sobre o tecido, empurrando suavemente para baixo até que ele toque a graxa a vácuo e a agarose, e faça uma imagem da bexiga natatória dentro de 10 minutos após a colheita.Injetando quatro nanolitros de albicans do mar em um a 1,5 vezes 10 do sétimo. A UFC por mililitro fornece os dados mais consistentes, resultando em uma faixa de 10 a 50 células de levedura por peixe. Estreitar o inóculo para 15 a 25 células de levedura dá um fenótipo e uma resposta ainda mais apertados.Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na resistência à candidíase em camundongos e humanos, e a infecção da bexiga natatória do peixe-zebra com albicans vivos leva a um recrutamento rápido e sustentado de neutrófilos. Isso não ocorre quando as células de levedura matam o calor e são injetadas. Os filamentos se desenvolvem rapidamente após a injeção das células de levedura com o crescimento filamentoso continuando nas primeiras 24 horas após a injeção, após o que esse número começa a diminuir a capacidade de seguir peixes individuais de forma não invasiva, permite esses estudos longitudinais e destaca as diferenças individuais na progressão da doença e nas respostas do hospedeiro.Um protocolo experimental que permanece impraticável na imagem de camundongos, as interações de células imunes ou epiteliais com c albicans são relativamente fáceis no modelo aqui apresentado. No entanto, dissecar a bexiga natatória, como acabamos de demonstrar, melhora significativamente a qualidade da imagem. Isso é particularmente útil ao visualizar linhas de peixes transgênicos onde a fluorescência é expressa de forma ubíqua e há fluorescência estranha no tecido circundante, conforme observado nestas imagens de uma bexiga natatória dissecada da linha de peixes citrinos alfa Catine.Seguindo este procedimento. Outros métodos ditos, como a tecnologia de metamorfose ou o tratamento de inibição química, podem ser usados para responder a perguntas como: qual é o papel de uma célula imune específica ou via de sinalização na candidíase da mucosa.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Fonte: Li, J. et al. Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a entrega baseada em microinjeção de Clostridioides difficile marcado com fluorescência no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra anestesiada. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação larval, injeção bacteriana e confirmação baseada em microscopia de fluorescência da localização bacteriana no intestino.

Entrega localizada de bactérias no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra usando microinjeção

Fonte: Flores, E., et al. Utilizando o protozoário Paramecium caudatum como veículo para infecções alimentares em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o método de estabelecer um modelo de infecção intestinal bacteriana transmitida por alimentos em larvas de peixe-zebra, alimentando-as com paramecia infectada com E. coli fluorescente.

Modelagem de Infecção Intestinal em Larvas de Peixe-Zebra usando Bactérias Transmitidas por Alimentos

Fonte: Li, J., et al. Desenvolvimento de um modelo larval de infecção por peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o procedimento de microgavage, no qual uma larva de peixe-zebra anestesiada é imobilizada em agarose e injetada oralmente com uma bactéria patogênica usando uma agulha guiada por traçadores. O parto não invasivo imita infecção natural, permitindo a análise da replicação bacteriana, liberação de toxinas e danos epiteliais intestinais.

Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra usando microgavage

Modelos de infecção sistêmica e localizada de peixe-zebra para o vírus influenza A humano são demonstrados. Usando um modelo de infecção sistêmica, o peixe-zebra pode ser usado para rastrear medicamentos antivirais. Usando um modelo de infecção localizada, o peixe-zebra pode ser usado para caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Neste protocolo, fluorescente etiquetadas T. cruzi foram injetados em larvas de peixe-zebra transparente, e motilidade do parasita foi observada na vivo usando microscopia de fluorescência folha de luz.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Aqui, descrevemos a síntese de liposós carregados de drogas e sua microinjeção em zebrafish larval com o propósito de direcionar o fornecimento de drogas para células de linhagem de macrófagos.

Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas

Apresentado aqui é um método seguro e eficaz para infectar larvas de zebrafish com c. anaeróbico fluorescente rotulado por microinjeção e microgavage não invasivo.

Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Aprenda a modelar candidíase mucosa em peixes-zebra juvenis por injeção na bexiga natatória. Este método permite imagem em tempo real das interações patógeno-imunidade usando microscopia confocal.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

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