Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

O objetivo geral deste procedimento é modelar a candidíase mucosa usando o peixe-zebra juvenil. Isso é feito carregando primeiro uma solução contendo os albicans vivos em uma microagulha. Na segunda etapa, um volume definido das células de levedura é injetado na bexiga natatória de um peixe-zebra juvenil.

Em seguida, os peixes são rastreados para um inóculo homogêneo e incubados pelo tempo desejado. Na etapa final, a microscopia confocal é usada para acompanhar a interação dinâmica do patógeno com o sistema imunológico do peixe-zebra. Além disso, a bexiga natatória pode ser micro

O método que estamos apresentando aqui responde a questões-chave da imunologia fúngica, bem como da microbiologia, como qual é a sequência precisa de eventos que levam a uma resposta imune fracassada ao patógeno fúngico e sinalizadores de cândida nas superfícies mucosas. Antes de iniciar o procedimento, aqueça uma placa de injeção contendo 2%aros em uma incubadora a 33 graus Celsius. Após 30 minutos, use uma pipeta de 25 mililitros para remover 100 mililitros do meio E três mais PTU de uma placa do quarto dia, peixe-zebra pós-fertilização, tomando cuidado para não aspirar nenhum dos peixes, e adicione dois mililitros de quatro miligramas por mililitro.

Estoque de sulfonato de metano Trica para a mídia para anestesiar os animais. Após 15 minutos, use um microscópio de dissecação para identificar os peixes com bexigas natatórias infladas e use uma pipeta de transferência de plástico para transferir 30 peixes-zebra para o prato de injeção pré-aquecido. Remova o excesso de mídia, segure o prato em um ângulo e use uma linha de pesca de 0,012 polegada de diâmetro super colada em um capilar de silicato de boro para fazer três linhas de 10 peixes alinhados verticalmente cada um em seguida vórtice completamente um tubo de albicans marinhos recém-preparados a uma concentração de 1,5 vezes 10 elevado ao sétimo UFC por mililitro.

Em seguida, carregue três microlitros da solução de levedura na microagulha cortada EC. Defina a duração do pulso para a configuração apropriada. Em seguida, gire o prato de injeção para atingir um ângulo de 20 graus entre a microagulha e a cabeça do peixe apontando para a parte de trás da bexiga natatória.

Agora empurre a microagulha para dentro da bexiga natatória, certificando-se de que o orifício da agulha esteja no lúmen e pressione a poça. Uma vez que verificar quais peixes foram injetados é relativamente fácil, pois o bolo desloca a bolha de ar e a parte de trás da bexiga natatória é posteriormente preenchida com meio, a injeção de co vermelho de fenol com o bolo pode facilitar ainda mais a visualização de uma injeção bem-sucedida. Depois de injetar todos os 30 peixes, inunde o prato com E três meios e esvazie o peixe no prato de recuperação.

Transfira 10 animais para um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro contendo um mililitro de E três meios e eutanasiar o peixe com 200 microlitros de trica. Em seguida, para cada animal, arrume quatro gotas de graxa a vácuo em um quadrado, com um centímetro de distância em uma microlâmina, e adicione duas gotas de recém-preparado, 2% de baixo ponto de fusão no meio do quadrado. Em seguida, coloque um peixe em uma lâmina de vidro separada sob um microscópio de dissecação e verifique se o coração do animal parou de bater e remova o excesso de água.

Agora use um par de pinças finas para segurar a cabeça em uma posição fixa e outro para puxar para baixo o intestino anterior. Pegue a bexiga natatória pelo duto pneumático, separando-a do trato digestivo, e coloque-a no centro de uma das microlâminas preparadas antes que o agro solidifique. Por fim, coloque uma lamínula sobre o tecido, empurrando suavemente para baixo até que ele toque a graxa a vácuo e a agarose, e faça uma imagem da bexiga natatória dentro de 10 minutos após a colheita.

Injetando quatro nanolitros de albicans do mar em um a 1,5 vezes 10 do sétimo. A UFC por mililitro fornece os dados mais consistentes, resultando em uma faixa de 10 a 50 células de levedura por peixe. Estreitar o inóculo para 15 a 25 células de levedura dá um fenótipo e uma resposta ainda mais apertados.

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na resistência à candidíase em camundongos e humanos, e a infecção da bexiga natatória do peixe-zebra com albicans vivos leva a um recrutamento rápido e sustentado de neutrófilos. Isso não ocorre quando as células de levedura matam o calor e são injetadas. Os filamentos se desenvolvem rapidamente após a injeção das células de levedura com o crescimento filamentoso continuando nas primeiras 24 horas após a injeção, após o que esse número começa a diminuir a capacidade de seguir peixes individuais de forma não invasiva, permite esses estudos longitudinais e destaca as diferenças individuais na progressão da doença e nas respostas do hospedeiro.

Um protocolo experimental que permanece impraticável na imagem de camundongos, as interações de células imunes ou epiteliais com c albicans são relativamente fáceis no modelo aqui apresentado. No entanto, dissecar a bexiga natatória, como acabamos de demonstrar, melhora significativamente a qualidade da imagem. Isso é particularmente útil ao visualizar linhas de peixes transgênicos onde a fluorescência é expressa de forma ubíqua e há fluorescência estranha no tecido circundante, conforme observado nestas imagens de uma bexiga natatória dissecada da linha de peixes citrinos alfa Catine.

Seguindo este procedimento. Outros métodos ditos, como a tecnologia de metamorfose ou o tratamento de inibição química, podem ser usados para responder a perguntas como: qual é o papel de uma célula imune específica ou via de sinalização na candidíase da mucosa.