Name: Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a quantificar a densidade capilar em camundongos usando análise de tons de cinza em imager de gel. Este método reprodutível e não enviesado facilita a avaliação de novas terapias para alopecia em pesquisas científicas.

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Gostaríamos de agradecer ao Hospital Infantil de Montefiore, Departamento de Pediatria, por fornecer apoio a esses estudos. Gostaríamos de agradecer à National Alopecia Areata Foundation por fornecer apoio financeiro para a realização de estudos com camundongos enxertados com C3H/HeJ.

Declaração de Ética: Todos os estudos que envolvam animais devem ser aprovados pelo IACUC da instituição (para os dados que se segue, os protocolos foram aprovados pela Montefiore IACUC, protocolo nº 11-6-240 e # 13-7-100). Animais são fornecidos anestesia luz, como indicado para o único propósito de mantê-los ainda durante a fotografia, não há procedimentos dolorosos necessários para este protocolo. 1. Aquisição de fotografias <ol><li> Definir o foco e campo de visão para imager gel usando papel com texto impresso. Verifique uniformidade da fonte de luz em toda a região fotografada. Para ajudar a garantir a uniformidade, usar um gerador de imagens gel com um construído em fonte de luz para a fotografia reflexiva. Não utilize uma fonte de luz transillumination, pois isso criaria uma silhueta do animal que não é adequado para uma análise mais aprofundada em tons de cinza. NOTA: Isto irá colocar o mouse ligeiramente fora de foco, que fornece a média óptica em toda a região de interesse (ROI) e vontadeajudar a reduzir erros quantais para regiões muito pequenas (isto é, &lt;10 pixels) de interesse. Regiões maiores de interesse não será afetado por este menor focando ajuste, nem serão afetados por diferenças no tamanho do animal. </li><li> Anestesiar os animais utilizando cetamina (100 mg / mL) / xilazina (20 mg / mL) (2: 1), pois isso proporciona um efeito de anestesia e uma recuperação rápida rápida e é ideal para fotografar vários animais. NOTA: A anestesia é confirmada quando o animal ainda é suficiente para permitir a fotografia. Como os animais tipicamente recuperar desta anestesia luz dentro de 10-15 min, o veterinário não recomenda o uso de pomadas para os olhos. </li><li> Coloque animais anestesiados em imager gel em alinhamento vertical (o mais próximo possível paralelo quanto possível). <ol><li> Para fotografias dorsais, colocar os animais em decúbito ventral, com os membros estendidos. </li><li> Para fotografias ventral, colocar os animais em decúbito dorsal, tomando cuidado para que os animais não são rodado lateralmente. </li&gt; </ol></li><li> Coloque padrão em tons de cinza na região fotografada. </li><li> Feche a porta de acesso. Importante: A luz ambiente pode apresentar variações na exposição. </li><li> Defina F-stop para uma exposição que coloca a região de interesse dentro da faixa linear de aquisição (leitura F-stop). NOTA: A maioria dos sistemas irá mostrar onde a imagem está saturada. </li><li> Tirar a fotografia. </li><li> Alterar F-stop para outra configuração de exposição que coloca a região de interesse dentro do intervalo linear, aumentando ou diminuindo o F-stop por 1, tal que tanto o padrão e a região de interesse permanece num intervalo linear de aquisição (referência F- pare). </li><li> Tirar a fotografia. </li><li> Uma vez que a fotografia é concluída, colocar os animais em uma tabela de aquecimento e monitorar até que possam manter decúbito esternal. Retorno animais para suas gaiolas. Retorne o grupo de animais ao biotério uma vez que todos os animais são totalmente recuperado. </li></ol> 2. Quantificação da absorção de luz &lt;/ P&gt; <ol><li> Marcar regiões de interesse nas imagens dos animais utilizando software fornecido para imager gel. <ol><li> Para ver o animal inteiro dorsal, utilizar uma imagem rectangular ou oval que se estende a partir das extremidades superiores dos membros inferiores, que se prolonga lateralmente, tanto quanto possível, de tal modo que nenhuma parte da caixa se estende para além da parte de trás do animal, tal como mostrado na Figura 1A. NOTA: Pode-se também marcar a área de interesse, utilizando uma ferramenta de desenho à mão livre. </li><li> Para animal inteiro ventral vista, use 2 retângulos: uma que cobre a região pélvica e um cobrindo a área do peito, como mostrado na Figura 1B. </li><li> Para uma região menor de interesse, ou seja, o local da administração da droga, marca, conforme apropriado. </li></ol></li><li> Região (s) Mark de juros sobre o padrão de absorção em tons de cinza. </li><li> Absorção da ficha de cada uma das regiões marcadas de interesse. </li></ol> 3. Análise Níveis de absorção obtained para as regiões de interesse podem necessitar de ser normalizadas para o padrão de fundo para comparação entre as fotografias. A relação de absorção é a exposição log-log (isto é, a relação é linear entre o log (exposição) e log (absorção)). Usando esta relação, a absorção da região de interesse pode ser normalizada a um padrão de valor de fundo, o que permitirá que as absorções de ser directamente comparados entre diferentes, incluindo as fotografias tomadas em diferentes pontos de tempo (isto é, medidas em série dentro de um protocolo de estudo). O procedimento para a execução dessas correções é detalhada em etapas opcionais 3.1 e 3.2. <ol><li> (Opcional) curva Lote de log (exposição) vs. log (absorção), utilizando os valores obtidos a partir de padrão de absorção em tons de cinza. </li><li> (Opcional) Ajuste para variações no padrão de cada fotografia da seguinte forma: <ol><li> Selecione F-stop para a leitura (como determinado na etapa 1.6) e F-stop para a referência (conforme determinado no step 1,8). </li><li> Calcule a absorção média do padrão em todas as fotografias na leitura de F-stop. Esta média é o Valor de Referência Padrão (RSV). </li><li> Calcular diferença de absorção entre a leitura e de referência configurações F-stop em cada fotografia para o padrão (delta-S) e para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X) </li><li> Calcule a absorção corrigido para cada ROI da seguinte forma: de absorção corrigido (ROI-X) = Absorção (ROI-X) com a leitura F-stop + (RSV - absorção de padrão na leitura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S) </li></ol></li><li> Compilar os dados experimentais e executar análise de dados usando técnicas estatísticas padrão para variáveis ​​contínuas (ie, ANOVA, T-teste). </li></ol>

<ol><li>McAndrews, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Hair+Loss+Association%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">American Hair Loss Association.</a> , 
 <a target="_blank" href="http://www.americanhairloss.org/men_hair_loss/introduction.asp">http://www.americanhairloss.org/men_hair_loss/introduction.asp</a> (2011).</li>
<li>Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+alopecia+areata+in+Olmsted+County%2C+Minnesota%2C+1975+through+1989%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989.</a> Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).</li>
<li>Hussein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+alopecia%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22South+Med+J%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced alopecia: new developments.</a> South Med J. 86 (5), 489-496 (1993).</li>
<li>Trueb, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+hair+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Therapy+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced hair loss.</a> Skin Therapy Lett. 15 (7), 5-7 (2010).</li>
<li>Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+adenovirus-mediated+expression+of+Sonic+hedgehog+gene+on+hair+regrowth+in+mice+with+chemotherapy-induced+alopecia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).</li>
<li>McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+sequelae+and+alopecia+among+women+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Pract%22%5BJournal%5D)">Psychological sequelae and alopecia among women with cancer.</a> Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).</li>
<li>Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alopecia%3A+effect+on+cancer+patients%27+body+image%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Nurs%22%5BJournal%5D)">Alopecia: effect on cancer patients' body image.</a> Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).</li>
<li>Stough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+effect%2C+pathophysiology%2C+and+management+of+androgenetic+alopecia+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men.</a> Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).</li>
<li>Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alopecia%3A+the+case+for+medical+necessity%5BTitle%5D)+AND+%22Skinmed%22%5BJournal%5D)">Alopecia: the case for medical necessity.</a> Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).</li>
<li>Olsen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+clinical+trial+of+5%25+topical+minoxidil+versus+2%25+topical+minoxidil+and+placebo+in+the+treatment+of+androgenetic+alopecia+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men.</a> J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).</li>
<li>Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1+mg+daily+administration+on+male+androgenetic+alopecia+in+different+age+groups%3A+10-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Ther%22%5BJournal%5D)">1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up.</a> Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).</li>
<li>Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+quantification+of+scalp+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Clin%22%5BJournal%5D)">Computer-aided quantification of scalp hair.</a> Dermatol Clin. 4 (4), 627-640 (1986).</li>
<li>Fleming, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+a+structural+analysis+of+dermatoscopic+imagery%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Med+Imaging+Graph%22%5BJournal%5D)">Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery.</a> Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).</li>
<li>Chamberlain, A. J., Dawber, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+evaluating+hair+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Australas+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods of evaluating hair growth.</a> Australas J Dermatol. 44 (1), 10-18 (2003).</li>
<li>The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.imatest.com/docs/q13/">http://www.imatest.com/docs/q13/</a> Forthcoming.</li>
<li>Freyschmidt-Paul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+alopecia+areata+in+C3H%2FHeJ+mice+with+the+topical+immunosuppressant+FK506+%28Tacrolimus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus).</a> Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).</li>
<li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prevention+of+chemotherapy-induced+alopecia+with+PTH-CBD%2C+a+collagen-targeted+parathyroid+hormone+analog%2C+in+a+non-depilated+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model.</a> Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).</li>
<li>Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+modulating+chemotherapy-induced+alopecia%2C+using+PTH%2FPTHrP+receptor+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist.</a> J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).</li>
<li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+hormone+linked+to+a+collagen+binding+domain+promotes+hair+growth+in+a+mouse+model+of+chemotherapy+induced+alopecia+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-cancer+drugs%22%5BJournal%5D)">Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner.</a> Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste relatório, uma descrição detalhada é fornecida de uma nova técnica para quantificar a perda de cabelo em roedores. Esta técnica utiliza um gerador de imagens de gel para aquisição e análise de imagem, o equipamento que está prontamente disponível, na maioria dos laboratórios. As medições foram mostrados para ser robusto para pequenas variações na técnica (Figuras 4-5), e está bem correlacionada com o grau de perda de cabelo visual em modelos de tratamento (Figura 6). Estas técnica...

Alopecia (queda de cabelo) pode ser um evento psicologicamente e emocionalmente estressante com múltiplas causas. Calvície de padrão masculino é a causa mais comum de alopecia, que afecta cerca de dois terços do sexo masculino de 35 anos 1. Um padrão semelhante de perda de cabelo pode ser observado em mulheres com síndrome do ovário policístico. Em ambos estes distúrbios, a perda de cabelo é mediada androgénio. Alopecia também pode ocorrer como uma doença auto-imune, alopecia areata, que afecta 1,7% da população 2. Alopecia pode ocorrer como um efeito colateral de alguns tratamentos médicos, tais como a quimioterapia e 3. Uma elevada percentagem (65-85%) dos pacientes de quimioterapia experimentam algum grau de alopecia 4,5. As consequências psicológicas da perda de cabelo foram bem estudados no cenário quimioterapia. Alopecia induzida pela quimioterapia pode resultar em ansiedade, depressão, uma imagem corporal negativa, baixa auto-estima e um senso reduzido de bem-estar 6,7. Uma alta eprcentage (47-58%) de pacientes com câncer feminino considerar a perda de cabelo para ser o aspecto mais traumático da quimioterapia, e até 8% declínio tratamento por medo de perda de cabelo 4,6. Há também evidências de alopecia androgênica para apoiar a terapia para reduzir as conseqüências psicológicas e até mesmo médicos de perda de cabelo 8,9. Da mesma forma, a alopecia areata foi reportado ter consequências psicológicas graves 2, e a natureza irregular da perda de cabelo pode levar a um resultado estético mais desagradável do que a maioria das outras causas de perda de cabelo. Enquanto as drogas com efeitos anti-androgênicos leves (ie, espironolactona) tinham sido utilizados com sucesso limitado como terapia para alopecia, o primeiro medicamento eficaz para alopecia foi minoxidil 10. Este anti-hipertensora tem um efeito secundário observado de provocar o crescimento do cabelo, e é agora utilizada como terapia tópica para muitas formas de alopecia. No entanto, as respostas são muitas vezes incompleta, com alguns assuntos mostrando apenas lentoção de perda de cabelo em vez de rebrota real 10. Finasteride é um antagonista competitivo de tipo II 5α-redutase, que bloqueia a conversão de testosterona em di-hidrotestosterona, resultando em melhorias na alopecia androgénica, em detrimento de androgénio bloqueio parcial sistémica. As taxas de resposta com a longo prazo (10 anos), a terapia são em torno de 50% 11. No geral, apesar de considerável pesquisa nesta área, ainda não há uma terapia adequada para a perda de cabelo. Durante décadas, cientistas e médicos examinaram métodos de medir o crescimento do cabelo do couro cabeludo em ensaios clínicos. Com o desenvolvimento de drogas que tratam alopecia, tem havido uma necessidade maior de meios fiáveis, económicos e minimamente invasivas de medição do crescimento do cabelo e, especificamente, a resposta à terapia. Tecnologia de análise de imagem para uma quantificação precisa de densidade do cabelo em pacientes com distúrbios de perda de cabelo produziu resultados consistentes e válidos no passado usando uma variedade de techniques, incluindo a análise de imagens digitalizadas 12, análise de imagem de cabelos individuais e lesões cutâneas 13, e digitalização microscópica para quantificar a massa de cabelo em uma região do couro cabeludo definido 14. Infelizmente, enquanto as metodologias acima têm proporcionado uma melhor avaliação da eficácia para o cabelo crescimento promovendo intervenções em ensaios clínicos, estes métodos não tenham sido aplicadas a estudos com roedores em investigações pré-clínicas. Nosso objetivo é desenvolver um método consistente e confiável para quantificar a perda de cabelo em ratos, o que permitirá que os investigadores a avaliar com mais precisão e comparar novas abordagens terapêuticas para várias formas de alopecia. Nós desenvolvemos uma metodologia utilizando equipamento prontamente disponível na maioria dos laboratórios que permitam a quantificação rápida e confiável de densidade de cabelo em ratos com cabelo marrom ou preto. Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de waxing. Um protocolo detalhado é apresentado para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Como esta técnica baseia-se na detecção de absorção de luz a partir de pigmentos na haste do cabelo, que não pode ser usado para detectar o crescimento de cabelo em ratinhos ou ratos albinos brancos.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Imagem KODAK Gel Logic 100</td><td>Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA</td><td></td><td>Equipamento de imagem gel para obtenção e análise de fotografias, deve possuir fonte de luz embutida para fotografia reflexiva.</td></tr><tr><td>Escalímetro Kodak/Tiffen Q-13</td><td><a href="http://www.imatest.com/docs/q13/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Imatest</a></td><td></td><td>Padrão de escala de cinza</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Camundongos para estudo representativo</td></tr><tr><td>Camundongo enxertado C3H/HeJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Camundongos para estudo representativo</td></tr></tbody></table>

uma nova técnica de análise quantitativa de perda de cabelo em ratos usando análise tons de cinza

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia é uma forma comum de perda de cabelo, que pode ocorrer em diversas condições, incluindo a perda de padrão masculino de cabelo, síndrome do ovário policístico, e alopecia areata. Alopecia também pode ocorrer como um efeito secundário da quimioterapia em pacientes com cancro. Neste estudo, o nosso objectivo foi desenvolver um método consistente e fiável para quantificar a perda de cabelo em ratinhos, o que vai permitir aos investigadores comparar e avaliar com precisão a novas abordagens terapêuticas para estas várias formas de alopécia. O método utiliza um gerador de imagens de gel padrão de obtenção e processamento de imagens de ratos, medindo a absorção de luz, o que ocorre em proporção com a quantidade aproximada de cabelo preto (ou cinzento) no rato. Os dados que foram quantificados desta forma podem ser analisados ​​utilizando técnicas estatísticas padrão (ou seja, ANOVA, teste t). Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de depilação. Neste relatório, o protocolo detalhado é prestura orientada para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Esta nova técnica oferece uma série de vantagens, incluindo a relativa simplicidade de aplicação, a confiança no equipamento que está prontamente disponível na maioria dos laboratórios de pesquisa, e aplicar uma avaliação objectiva, quantitativa que é mais robusto do que avaliações subjetivas. Melhorias na quantificação do crescimento do cabelo em camundongos vai melhorar estudo de modelos de alopecia e facilitar a avaliação de novas terapias promissoras em estudos pré-clínicos.

Esta técnica foi validado utilizando camundongos C3H / HeJ em vós implantada, a modelo de rato com alopecia areata 16. Estes animais desenvolvem a perda de cabelo global que progride de forma gradual ao longo do tempo. No entanto, a perda de cabelo ocorre em manchas, e pode variar de um rato para o outro, a introdução de uma grande variabilidade e dificulta as avaliações qualitativas. Este modelo proporcionou uma oportunidade para testar as correlações entre as medições de densidade óptica em diferentes locai...

A alopecia é uma forma comum de queda de cabelo que pode ocorrer em muitas condições diferentes, inclusive como efeito colateral da quimioterapia. Desenvolvemos um método para quantificar a perda de cabelo em camundongos, utilizando um gerador de imagens de gel padrão para realizar uma análise em escala de cinza, para facilitar o estudo de novas terapias promissoras para alopecia.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma quantificação da densidade do cabelo usando absorção de luz. Isso é feito fotografando primeiro os animais em um gerador de imagens de gel. Os próximos passos são definir uma região de interesse na fotografia e determinar a absorção de luz dentro da região de interesse.Em seguida, a absorção de luz é comparada a um padrão fotográfico. Em última análise, a absorção de luz pode ser calculada em média entre animais tratados de forma semelhante para mostrar os efeitos de uma intervenção no crescimento do cabelo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é imparcial, quantificável e reproduzível.Isso é extremamente importante porque permite que você use padrões, técnicas estatísticas como o Inova para determinar a significância estatística dos resultados. Para este protocolo, use um gerador de imagens de gel com uma fonte de luz embutida para fotografia reflexiva. Isso garante uma boa uniformidade de luz, enquanto a iluminação trans cria uma silhueta inadequada para análise.Comece preparando o gerador de imagens de gel, defina o foco e o campo de visão. Usando algum texto impresso, o mouse pode ficar um pouco fora de foco, pois isso realmente funciona. Para reduzir erros quantais em pequenas regiões de interesse, verifique a uniformidade da fonte de luz em toda a região fotografada com o objetivo de obter uma excelente média óptica na região de interesse.Em seguida, prepare o animal. Selecione um anestésico com início rápido e curta duração de ação e forneça apenas o suficiente para manter os animais imóveis para a fotografia. Agora coloque os animais no gerador de imagens verticalmente e o mais próximo possível do paralelo.Para fotografias dorsais, coloque os animais em decúbito ventral com os membros estendidos. Para fotografias ventrais, coloque os animais em decúbito dorsal. Certifique-se de que eles não sejam girados lateralmente.Os valores de absorção podem ser puxados entre as imagens, mas não é para isso que a máquina foi projetada. Portanto, adicionar um padrão de escala de cinza nos permite normalizar os valores de absorção ao compilar os dados. Agora coloque o padrão de escala de cinza na região fotografada.Em seguida, feche a câmara e reduza a iluminação ambiente que pode entrar na câmara na câmera. Defina o F stop para uma exposição que torne a área de interesse não supersaturada ou subexposta. Em seguida, tire uma fotografia.Se o F stop for escolhido de forma que a imagem fique saturada, o valor da escala de cinza será fixado no valor e B sem qualquer utilidade. Em seguida, altere o F.Stop em um, mantendo a área de interesse e o padrão em uma faixa de exposição linear, e tire uma segunda fotografia com a fotografia concluída. Coloque os animais em uma mesa de aquecimento e monitore-os até que se recuperem.Esternal reclinado. Em seguida, devolva os animais às gaiolas e, finalmente, ao viveiro para recuperação total. Para quantificar a absorção de luz usando o software de imagem em gel, marque as regiões de interesse nas imagens dos animais para uma visão dorsal de todo o animal.Use uma imagem retangular, uma imagem oval ou uma ferramenta de mão livre para delinear um espaço dos membros superiores aos membros inferiores, estendendo-se lateralmente o máximo possível. Mantenha-se dentro das margens do dorso do animal para uma visão ventral de todo o animal. Use dois retângulos.Um para cobrir a região pélvica, que é cuidada, e outro para cobrir a área do peito, que não é cuidada. Regiões menores de interesse, como onde um medicamento foi administrado, também podem ser marcadas como necessárias. Em segundo lugar, marque a região de interesse no padrão de absorção da escala de cinza.Em seguida, registre a absorção de cada região de interesse marcada para comparação entre as fotografias. Normalizar os níveis de absorção para o padrão de fundo utilizando uma relação logarítmica da exposição à absorção. Para fazer isso, trace uma curva do log de exposição em relação ao log de absorção.Usando valores obtidos do padrão de absorção de escala de cinza, ajuste as variações no padrão de cada fotografia da seguinte forma. Primeiro, selecione o F-stop para ler o ROI e o F-stop para a referência e calcule a absorção média do padrão em todas as fotografias na leitura do F-stop. Esta média é o valor padrão de referência ou o VSR.Em seguida, calculamos a diferença de absorção entre as configurações de F-Stop de leitura e referência em cada fotografia e fazemos os mesmos cálculos para o padrão e para cada ROI definido. Agora, usando dados de um F-stop, calcule a absorção corrigida para cada ROI usando a fórmula mostrada. Em seguida, aplicamos métodos estatísticos padrão para analisar os dados de camundongos enxertados com C3 HHEJ, cujo modelo de alopecia ADA foi analisado usando o método descrito em diferentes exposições.As variações no ROI não sobreposto foram fortemente correlacionadas conforme o esperado. Comparações semelhantes produziram a mesma correlação estreita durante um período de três semanas. Os ratos foram fotografados para quantificar a perda de cabelo esperada.80% dos camundongos fotografados mostraram perda de cabelo nesse período. Em comparação, os camundongos C 57 pretos normais não apresentaram perda de cabelo no mesmo período de tempo. Em um segundo estudo, a alopecia induzida por quimioterapia foi quantificada usando a técnica descrita.Os camundongos foram tratados com ciclofosfamida por três semanas e, após dois meses, apresentaram perda significativa de cabelo em comparação com os controles. Uma vez dominada, cada imagem pode ser analisada em menos de cinco minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a quantidade de crescimento de cabelo em roedores usando um sistema de imagem de gel padrão.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tissue-specific análise de um modelo de regeneração do cabelo folicular usando lentivírus para mediar o ganho ou perda de função.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Este vídeo demonstra um método para enxertar pele humana em um camundongo imunodeficiente com uma resposta de neutrófilos suprimida. O método envolve a aplicação de pele humana de espessura dividida no leito do enxerto do camundongo, selando-o e cobrindo-o para recuperação. Eventualmente, a pele humana adere à pele do camundongo, estabelecendo vascularização e circulação, resultando em um xenoenxerto cutâneo bem-sucedido.

Uma técnica para enxerto de pele humana em um modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a gravação combinada da saída aferente mecanicamente estimulada e da marcação do terminal nervoso nos folículos pilosos de um pavilhão auricular de camundongo. Ele descreve as etapas envolvidas na estimulação mecânica dos terminais nervosos do folículo piloso antes e depois da exposição a um corante de membrana fluorescente, registro eletrofisiológico dos potenciais de ação gerados e visualização da rotulagem do terminal nervoso nos folículos pilosos.

Registro combinado de saída aferente mecanicamente estimulada e marcação de terminais nervosos em folículos pilosos de camundongos

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.

Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica

Aqui, descrevemos em profundidade um método, baseado em microtomografia computadorizada, para segmentar e medir modelos 3D de ossos craniomaxilofaciais em camundongos, para melhor avaliação do desenvolvimento ósseo craniomaxilofacial em camundongos do que é possível com os métodos atuais.

Análise de malformações craniomaxilofaciais em camundongos por meio de tomografia computadorizada tridimensional

A capilaroscopia é uma ferramenta acessível para visualização direta, barata e não invasiva da microvasculatura. O objetivo deste protocolo é permitir que os pesquisadores usem a capilaroscopia para a visualização da morfologia microvascular periférica nos leitos ungueais de camundongos.

Visualização não invasiva da morfologia microvascular do leito ungueal em camundongos usando capilaroscopia

O objetivo do presente protocolo é fornecer instruções e diretrizes para avaliar a fragilidade física em camundongos de laboratório C57Bl / 6x129J. São explicados detalhes específicos sobre cada medida utilizada no índice de fragilidade física. Vários métodos para relatar resultados de fragilidade também são apresentados.

Avaliação da fragilidade em um modelo de camundongo idoso

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

Aprenda a quantificar a densidade capilar em camundongos usando análise de tons de cinza em imager de gel. Este método reprodutível e não enviesado facilita a avaliação de novas terapias para alopecia em pesquisas científicas.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

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