Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

A alopecia é uma forma comum de queda de cabelo que pode ocorrer em muitas condições diferentes, inclusive como efeito colateral da quimioterapia. Desenvolvemos um método para quantificar a perda de cabelo em camundongos, utilizando um gerador de imagens de gel padrão para realizar uma análise em escala de cinza, para facilitar o estudo de novas terapias promissoras para alopecia.

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma quantificação da densidade do cabelo usando absorção de luz. Isso é feito fotografando primeiro os animais em um gerador de imagens de gel. Os próximos passos são definir uma região de interesse na fotografia e determinar a absorção de luz dentro da região de interesse.

Em seguida, a absorção de luz é comparada a um padrão fotográfico. Em última análise, a absorção de luz pode ser calculada em média entre animais tratados de forma semelhante para mostrar os efeitos de uma intervenção no crescimento do cabelo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é imparcial, quantificável e reproduzível.

Isso é extremamente importante porque permite que você use padrões, técnicas estatísticas como o Inova para determinar a significância estatística dos resultados. Para este protocolo, use um gerador de imagens de gel com uma fonte de luz embutida para fotografia reflexiva. Isso garante uma boa uniformidade de luz, enquanto a iluminação trans cria uma silhueta inadequada para análise.

Comece preparando o gerador de imagens de gel, defina o foco e o campo de visão. Usando algum texto impresso, o mouse pode ficar um pouco fora de foco, pois isso realmente funciona. Para reduzir erros quantais em pequenas regiões de interesse, verifique a uniformidade da fonte de luz em toda a região fotografada com o objetivo de obter uma excelente média óptica na região de interesse.

Em seguida, prepare o animal. Selecione um anestésico com início rápido e curta duração de ação e forneça apenas o suficiente para manter os animais imóveis para a fotografia. Agora coloque os animais no gerador de imagens verticalmente e o mais próximo possível do paralelo.

Para fotografias dorsais, coloque os animais em decúbito ventral com os membros estendidos. Para fotografias ventrais, coloque os animais em decúbito dorsal. Certifique-se de que eles não sejam girados lateralmente.

Os valores de absorção podem ser puxados entre as imagens, mas não é para isso que a máquina foi projetada. Portanto, adicionar um padrão de escala de cinza nos permite normalizar os valores de absorção ao compilar os dados. Agora coloque o padrão de escala de cinza na região fotografada.

Em seguida, feche a câmara e reduza a iluminação ambiente que pode entrar na câmara na câmera. Defina o F stop para uma exposição que torne a área de interesse não supersaturada ou subexposta. Em seguida, tire uma fotografia.

Se o F stop for escolhido de forma que a imagem fique saturada, o valor da escala de cinza será fixado no valor e B sem qualquer utilidade. Em seguida, altere o F.Stop em um, mantendo a área de interesse e o padrão em uma faixa de exposição linear, e tire uma segunda fotografia com a fotografia concluída. Coloque os animais em uma mesa de aquecimento e monitore-os até que se recuperem.

Esternal reclinado. Em seguida, devolva os animais às gaiolas e, finalmente, ao viveiro para recuperação total. Para quantificar a absorção de luz usando o software de imagem em gel, marque as regiões de interesse nas imagens dos animais para uma visão dorsal de todo o animal.

Use uma imagem retangular, uma imagem oval ou uma ferramenta de mão livre para delinear um espaço dos membros superiores aos membros inferiores, estendendo-se lateralmente o máximo possível. Mantenha-se dentro das margens do dorso do animal para uma visão ventral de todo o animal. Use dois retângulos.

Um para cobrir a região pélvica, que é cuidada, e outro para cobrir a área do peito, que não é cuidada. Regiões menores de interesse, como onde um medicamento foi administrado, também podem ser marcadas como necessárias. Em segundo lugar, marque a região de interesse no padrão de absorção da escala de cinza.

Em seguida, registre a absorção de cada região de interesse marcada para comparação entre as fotografias. Normalizar os níveis de absorção para o padrão de fundo utilizando uma relação logarítmica da exposição à absorção. Para fazer isso, trace uma curva do log de exposição em relação ao log de absorção.

Usando valores obtidos do padrão de absorção de escala de cinza, ajuste as variações no padrão de cada fotografia da seguinte forma. Primeiro, selecione o F-stop para ler o ROI e o F-stop para a referência e calcule a absorção média do padrão em todas as fotografias na leitura do F-stop. Esta média é o valor padrão de referência ou o VSR.

Em seguida, calculamos a diferença de absorção entre as configurações de F-Stop de leitura e referência em cada fotografia e fazemos os mesmos cálculos para o padrão e para cada ROI definido. Agora, usando dados de um F-stop, calcule a absorção corrigida para cada ROI usando a fórmula mostrada. Em seguida, aplicamos métodos estatísticos padrão para analisar os dados de camundongos enxertados com C3 HHEJ, cujo modelo de alopecia ADA foi analisado usando o método descrito em diferentes exposições.

As variações no ROI não sobreposto foram fortemente correlacionadas conforme o esperado. Comparações semelhantes produziram a mesma correlação estreita durante um período de três semanas. Os ratos foram fotografados para quantificar a perda de cabelo esperada.

80% dos camundongos fotografados mostraram perda de cabelo nesse período. Em comparação, os camundongos C 57 pretos normais não apresentaram perda de cabelo no mesmo período de tempo. Em um segundo estudo, a alopecia induzida por quimioterapia foi quantificada usando a técnica descrita.

Os camundongos foram tratados com ciclofosfamida por três semanas e, após dois meses, apresentaram perda significativa de cabelo em comparação com os controles. Uma vez dominada, cada imagem pode ser analisada em menos de cinco minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a quantidade de crescimento de cabelo em roedores usando um sistema de imagem de gel padrão.