Name: Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a fabricar substratos de cultura com múltiplas escovas de PEG funcionalizadas ortogonalmente usando impressão robótica de microcontato e substituição nucleofílica sequencial. Este método automatizado permite imobilização espacialmente precisa de ligantes biológicos.

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O financiamento para este trabalho, GTK, TK e JDM foi fornecido pelo Wisconsin Institute for Discovery e pela Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Geração elastoméricos selos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para gerar mestres de silício do selo PDMS, padrões de design característica da fotomáscara usando software de desenho assistido por computador. <ol><li> Design o primeiro padrão como uma matriz de 20 x 20 dos anéis com 300 mm de diâmetro interno (ID) e 600 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro. </li><li> Projetar o segundo padrão como 20 x 20 matriz de anéis com 600 mm ID e 900 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro. </li><li> Além disso, coloque 1 x 1 milímetro duas marcas de referência quadrados em todos os quatro cantos de cada projeto leque espaçados 1.200 mm de centro a centro do padrão de canto em um ângulo de 45 °. </li><li> Fabricar os mestres de silício para utilização neste experimento com 1: 1 proporções, correlacionando a uma profundidade de 300 mm característica usando técnicas de litografia padrão detalhados em outros lugares 15 ou em colaboração com uma fundição de microfluídica. NOTA: Característica profundidades menores do que 100 mm pode levar à deformação anormal de carimbos anteriores ao contacto com superfícies de substrato. NOTA: Este protocolo começa com ter mestres de silício já obtidos com os padrões descritos de fotorresiste, o que exige equipamento especializado e quartos limpos para criar. É melhor consultar com uma facilidade fabricante ou núcleo para criar esses mestres estampados. </li></ol></li><li> Mestres de silício silanizar O / N de incubação com (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapor trichlorosilane. NOTA: Silano vapor é altamente tóxico e só deve ser manipulado em uma coifa química. </li><li> Criar réplicas inversa dos mestres de silício por cura de uma proporção de 10: 1 de PDMS pré-polímero e agente de PDMS em cima dos mestres de silício silanizadas de cura numa placa de Petri S / N a 60 ° C. </li><li> Remover os selos de PDMS com os mestres de silício, e unir os selos para acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) backings ou qualquer outro material rígidos usando cola. NOTA: O material de escolha não necessita de ser transparente ou biocompatível. No entanto, ele deve fornecer uma superfície plana para a interface com o ferramental robótico e maior rigidez do que o PDMS. </li></ol> 2. Preparar Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coverslides microscópio de enxaguamento (24 milímetros x 50 mm # 1) em tolueno, metanol e sonicado em acetona durante 1 minuto antes da lavagem com etanol e secagem sob uma corrente de azoto suave. NOTA: Manusear tolueno e acetona apenas em uma coifa química. </li><li> Coverslides revestimento com ~ 3,5 nm de titânio (Ti), seguido de 18,0 nm de ouro (Au), utilizando um evaporador de feixe de electrões focado. NOTA: Este procedimento é compatível com uma variedade de substratos revestidos a ouro, incluindo silicone e poliestireno. Embora seja possível gerar estes no local, substratos revestidos a ouro, também estão disponíveis através de fornecedores comerciais. NOTA: As camadas de Ti deve ser de pelo menos 3 nm de espessura, enquanto Au camadas em substratos deve ser umt menos 5 nm de espessura e pode variar todo o caminho até um milímetro de espessura, dependendo das propriedades ópticas ideais do substrato final 16,17. Substratos não são obrigadas a ser opticamente transparente para a fabricação; no entanto, isso facilita a análise microscópica de substratos fabricados. </li><li> Lavar coverslides revestido de ouro com etanol e seco sob atmosfera de azoto suave imediatamente antes da utilização. </li></ol> 3. R-μCP do anel externo <ol style="margin-left: 40px;"><li> Antes R-μCP com o sistema compatível seletivamente braço robótico articulado (SCARA), calibrar os efetores de ferramentas robóticas e sistemas de dupla câmara de acompanhamento, utilizando o software do sistema. NOTA: Estes instrumentos são retratados na Figura 1. </li></ol><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> Figura 1. R- μCP Sistema e Robotic Arm Tooling. (A) vista em grande escala do sistema de R-μCP com todas as ferramentas e utensílios, (a) chuck vácuo, (b) banho de reagente, (c) para baixo da câmera, (d) fixação de nidificação selo, (e) robótica ferramenta. (B) Braço robótico ferramental retratando (f) ferramenta de gravura com ponta de diamante e (g) ferramenta de sucção pneumática segurando um (h) PDMS selo lastreados em ABS. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Colocar manualmente um carimbo de PDMS com 600 mm ID e 900 mm OD saliente anéis face para baixo no suporte de nidificação de selo. Colocar manualmente um coverslide revestido a ouro limpo de fresco no topo do mandril de vácuo, apresentado na Figura 1A, e imobilizá-lo utilizando o vácuo do laboratório ligado. </li><li> Usando os controles do robô, alinhe a câmera voltada para baixo sobre o ponto central da coverslide revestido de ouro, como na Figura 2A. NOTA: Este ponto pode, inicialmente, ser definida por inspecção visual e não requer grande precisão, como o selo PDMS é muito larger do que a lâmina revestida de ouro. </li><li> Instrua o braço robótico para gravar quatro referência "X" marcas nos vértices de um quadrado com dimensões 3,8 milímetros por 3,8 milímetros centradas no coverslide revestido de ouro usando a ferramenta de ataque com ponta de diamante preso ao braço robótico. (Ilustrado na figura 2B; processo automatizado) NOTA: Este garante que todas as quatro marcas de referência estão dentro de um quadro visual da câmera voltada para baixo. </li><li> Usando as ferramentas de sucção pneumática robôs, pick-up e mantenha os PDMS carimbar 1 mm acima da fixação do assentamento selo como na Figura 2C. (Processo automatizado) </li><li> Usando a câmera voltada para cima e anel de iluminação LED retratado na Figura 2D e E, visualizar marcas de referência quadrado do selo e identificá-los com o software da câmera 10 vezes, a fim de determinar média X do selo, Y, e angular deslocamento do centro da eixo robô ferramental. (Processo automatizado) </li><li> Como em NOTA: Um cálculo interno é realizado pelo software do sistema robótico para alinhar precisamente o X da lamela, locais de centro de Y e deslocamentos angulares em futuras etapas R-μCP do selo e. </li><li> 3.8) Coloque o selo em um banho de alcanotiol iniciador de PRTA, bromoisobutirato ω-mercaptoundecyl (2 mM em etanol) tal como representado na Figura 2F. (Processo automatizado) </li><li> Remova o selo da solução alcanotiol e colocá-lo sobre o córrego nitrogênio pressurizado para 0,48 bar (5 psi) para evaporar o etanol como na Figura 2G. Após 1 min aumentar a pressão da corrente de azoto é 1,03 bar (15 psi), para assegurar a secura uniforme. (Processo automatizado) NOTA: secagem incompleta irá resultar em perda total ou parcial do padrão de fidelidade. </li><li> Após a secagem, mover o selo através da posição de centro calculado da lâmina revestida de ouro e baixá-lo em incrementos de 100 mm, enquanto monitorar a força do motor no eixo Z como ilustrado na Figura 2H. NOTA: Este é comunicada como torque experimentado pelo motor do eixo Z e exibido no software de orientação do robô. (Processo automatizado) </li><li> Pare de baixar o selo uma vez conseguida a pressão predeterminada de 79,2 kPa, e manter contato com a lâmina revestida de ouro por 15 s. (Processo automatizado) NOTA: Os valores de pressão aqui são otimizados para o projeto do selo e recurso de altura atual. Se o desenho de selo é alterada, especificamente em alta carimbos relação de aspecto, de acordo com estes sintonizar por um processo de tentativa e erro. </li><li> Lentamente, retire o selo da lâmina revestida de ouro e colocar o selo de volta no suporte de nidificação de selo. (Processo automatizado) </li></ol> 4. SI-PRTA de PEGMEMA em micropatterned Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Solte a pressão do vácuo segurando o coverslide micropadronadas, e transferi-lo para um frasco de 50 ml Schlenk. Seal e degas o frasco Schlenk utilizando uma bomba de vácuo. </li><li> Adicionar 5,5 ml de mistura de reacção contendo o macromonómero PRTA PEGMEMA (208,75 mmol), água (34,4 ml), metanol (43,8 ml), cobre (II), brometo de (1 mmol), e 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) de o balão de Schlenk. </li><li> Adicionar 0,5 ml de ascorbato de sódio-L (454,3 mM) em água para iniciar a reacção, e permitir que ele continue durante 16 horas à temperatura ambiente sob um gás inerte. NOTA: Após a adição de L-ascorbato de sódio, a cor da reacção irá mudar de verde-claro a castanho escuro, como mostrado na Figura 3A-B. NOTA: A reacção pode continuar para além de 16 horas, mas não vai aumentar de forma significativa o comprimento das escovas de PEG. </li></ol><imgalt src='"/' files ftp_upload></imgalt> Figura 3. Iniciação de SI-PRTA. (A) A iniciação da reacção e (B) subsequente mudança de cor após a adição de L-ascorbato de sódio. Imagem (C) Microscópio de superfície coverslide micropadronadas seguinte procedimento SI-ATRP. Barra de escala de 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Remover o coverslide micropadronadas a partir do balão de Schenk e enxagua-se com etanol, água e etanol e seco sob uma corrente suave de azoto. NOTA: Seguindo SI-PRTA, modificações de superfície deve ser visível a olho nu e podem ser visualizados e analisados ​​ao microscópio como na Figura 3C. NOTA: Este é o método mais simples para testar a precisão do ensaio, uma vez que elimina a necessidade de imunocoloração os substratos. </li></ol> 5. A funcionalização Azide das Cadeias micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque a coverslide micropadronadas num frasco de 20 ml de reacção de vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) contendo 100 mM de azida de sódio para o frasco de reacção. Manter esta reacção a 37 ° C durante 24 h. NOTA: Manusear DMF apenas em uma coifa química. Tenha cuidado ao pesando azida de sódio. </li><li> Após a conclusão, remover o coverslide micropadronadas a partir do frasco de reacção e enxagua-se com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto. </li></ol> 6. Passivation das Cadeias Bromo funcionalizados PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropatterned em 20 ml tubos de ensaio de vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) contendo 100 mM etanolamina 300 mM de trietilamina e para o frasco de reacção. Manter esta reacção a 40 ° C durante 24 h. NOTA: Manusear DMSO, etanolamina e trietilamina, apenas em uma coifa química. </li><li> Após a conclusão remover o coversl micropadronadaside a partir do frasco de reacção, lavar com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto. </li></ol> 7. R-μCP de Inner Annulus e SI-ATRP de PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Levar a cabo passos de R-μCP como anteriormente descrito nos Passos 3.2 e 3,6-3,12, substituindo um selo PDMS com 300 um e 600 um ID OD anéis salientes, de tal modo que as coroas circulares com características menores são colocados no interior dos anéis anteriormente micropadronadas. NOTA: O limite de pressão para este selo é 132,0 kPa. Como mencionado anteriormente, esses ajustes de pressão são otimizados para as características de selo a ser utilizado neste experimento. </li><li> Realizar passos SI-ATRP como anteriormente descrito nos passos 4,1-4,4. </li></ol> 8. O acetileno funcionalização das Cadeias micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropadronadas em um frasco de 20 ml reação vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de DMSO contendo 100 mMpropargilamina para o frasco de reacção. Manter esta reacção à temperatura ambiente durante 24 horas. NOTA: Manusear DMSO e propargilamina apenas em uma coifa química. </li><li> Após a conclusão remover o coverslide micropadronadas a partir do frasco de reacção e enxagua-se com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto. </li></ol> 9. catalisada por cobre "Clique em" Biotinilaï¿½o de acetileno Encerrado Chains PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropadronadas em um frasco de 20 ml reação vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de sulfato de cobre (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA, 30 mM) (1: / v de água 1 v / DMF) contendo 562 uM de azida de PEG-4 biotina conjugado ao frasco de reacção. Adicionar 1,2 ml de ácido L-ascórbico (0,15 mM) em água à mistura para iniciar a reacção. </li><li> Bolha de azoto através da solução de reacção durante 10 seg, selar o frasco com Parafilm e reagir durante 24 horas à temperatura ambiente. </li><li> Após completion remover coverslide micropadronadas do frasco de reação, lave com água e coloque-o em um de 12 poços de poliestireno prato. </li></ol> 10. Detecção de imunofluorescência de Biotinylated acetileno Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloquear coverslide micropadronadas em DPBS (3% Donkey Soro) durante 1 h à TA. Mancha para grupos de acetileno biotinilados com estreptavidina-546 conjugado (2 ug / ml) em DBPS (3% Donkey Soro em PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar coverslide micropadronadas 5 vezes com DPBS durante 10 min com agitação suave. NOTA: A Figura 4B representa uma imagem da corrediça depois desta etapa é concluída. </li></ol> 11. Cobre-livre "Clique em" Biotinilaï¿½o de Azide Encerrado Chains PEGMEMA NOTA: Se se desejar, esta modificação passo substrato pode ser realizada in situ durante a cultura de células. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deixe coverslide micropadronadas em 12 poços pprato olystyrene seguinte DBPS lavagens. </li><li> Adicionar 2 ml de DBPS (ou meios de cultura de células) contendo 20 uM DBCO PEG-4 biotina, e permitir que esta reacção continue durante 24 horas à temperatura ambiente (ou a 37 ° C em uma incubadora). </li><li> Após a conclusão, lavar coverslide micropadronadas 5 vezes com DPBS (ou simplesmente realizar uma mudança de mídia). </li></ol> 12. Detecção de imunofluorescência de Biotinylated azídicos Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mancha para grupos azida biotinilados com estreptavidina-488 conjugado (2 ug / ml) em 2 ml de DPBS (3% Donkey Soro) durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar coverslide micropadronadas 5 vezes em DPBS durante 10 minutos com agitação suave. </li><li> Imagem micropatterned coverslide utilizando microscópio de fluorescência confocal. 4A-C mostra imagens do slide após essa etapa for concluída. NOTA: Quando utilizar substratos para ensaios de cultura de tecidos, pule seções 10 e 12 do presente protocolo. Após o desejado degree de funcionalização, esterilizar o coverslide manipulado por lavagem ambos os lados com etanol a 100% e a secagem sob uma corrente de azoto. Transferir as lâminas para uma estéril cabine de segurança biológica e lavar a lâmina com PBS cinco vezes antes de prosseguir com a semeadura e cultura de células. </li></ol>

<ol><li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology%3A+Current+Applications+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li>
<li>Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li>
<li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Pursuit+of+Zero%3A+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li>
<li>Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click%E2%80%9D+Chemistry+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Click” Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li>
<li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li>
<li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li>
<li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD%E2%80%94Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li>
<li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li>
<li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Self-Assembled+Monolayers%3A+Efficient%2C+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li>
<li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li>
<li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Fouling%E2%80%9D+Oligo%28ethylene+glycol%29-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li>
<li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li>
<li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).</li>
<li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+robotic+microcontact+printing+%28R-%CE%BCCP%29+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li>
<li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo%28ethylene+glycol%29+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li>
<li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li>
<li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283%2B2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li>
<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

Substratos ideal para a engenharia de tecidos seriam bioinspirado e, assim, recapitular a distribuição espacial dos ligandos bioactivos críticos encontrados dentro dos tecidos nativos. Eles também possuem propriedades dinâmicas que permitem ajustes temporais dos ligandos e os padrões espaciais, em que são apresentados para permitir a morfogénese do tecido e dirigida espacialmente restritos a indução de destino celular. Fabricação de tais substratos requer a imobilização de várias pistas bioquímicas nas orientações compl...

A capacidade de superfícies PEG-enxertadas para exibir ligantes bioquímicos ligados covalentemente, mantendo simultaneamente propriedades inerentes não sujar torná-los uma escolha ideal para ambientes personalizados microescala engenharia em substratos de cultura 1,2,3. As interacções bioespecíficas mediadas por ligando conjugado PEG escovas permite a análise minimizam os efeitos de sinais bioquímicos encontrados dentro do complexo em tecidos microambiente in vivo com fenótipos de células individuais. Além disso, a bio-ortogonal &quot;click&quot; químicas pode ser usada para facilitar a imobilização de ligandos direccional de modo a que eles estão apresentados na conformações nativas 4-6. Assim, a modelagem espacial em microescala de PEG escovas é uma ferramenta versátil para criar projetista em nichos in vitro para investigar a sinalização celular induzida por sinais bioquímicos imobilizados 6,7. Um método comum para a geração de padrões espaciais de cu bioquímicaes implica impressão microcontact (μCP) substratos revestidos a ouro com padrões de PEG alcanotióis conjugados. Em seguida, as monocamadas auto-montadas micropatterned (MCS) de PEG-alcanotiois ylated restringe a adsorção física de moléculas bioquímicas, por exemplo, proteínas, apenas para as regiões não modelado do substrato 8,9. No entanto, as SAM gerados por esta técnica são sensíveis à oxidação a longo prazo em meio de cultura celular. Assim, μCP&#39;d alcanotiol SAMs são muitas vezes mais enxertado com escovas de polímero PEG utilizando a transferência de átomo iniciou-superfície polimerização radical (SI-ATRP) para aumentar a estabilidade não-incrustantes da região 10. Especificamente, μCP do iniciador de polimerização alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superfícies revestidas com ouro seguido pela SI-PRTA de poli (etileno-glicol), éter metil metacrilato (PEGMEMA) monómeros gera superfícies com micropadronadas longo prazo, estável e não- incrustação PEG escovas. Além disso, estes<html> são capazes de ser ainda modificado para apresentar diversas porções químicas 11. Aproveitando essa propriedade, Sha et. ai. desenvolveu um método para projetar substratos de cultura com escovas PEGMEMA multicomponentes apresentando ortogonais &quot;clique&quot; químicas. Neste método, que utilizam uma série de passos μCP / SI-ATRP intercaladas com azida de sódio sequencial, etanolamina, e propargilamina substituições nucleófilas para criar substratos de cultura apresentam padrões de microescala de múltiplos ligandos imobilizados 6. Embora o potencial de utilização de tais produtos químicos, em conjugação com μCP manual para engendrar novos substratos de cultura é imensa, que é limitada pela precisão e exactidão com que múltiplos passos μCP podem ser alinhadas num único substrato. Um elevado nível de precisão e exactidão seria necessário para fabricar reprodutivelmente complexo em nichos in vitro que utilizam estas técnicas versáteis. e_content &quot;&gt; Para resolver esta limitação, vários sistemas μCP automatizados e semi-automatizados foram gerados. Chakra et. al. desenvolveu um sistema em que μCP selos personalizados são colocados em um sistema de transporte ferroviário e colocada em contato conformada com lâminas revestidas de ouro, utilizando um atuador pneumático, controlado por computador. No entanto, este método requer a fabricação precisa de selo projetos personalizados e relata uma precisão de 10 mm sem relatório da precisão obtida ao executar múltiplos μCP etapas 12. Mais recentemente, um método que utiliza um sistema de acoplamento cinemático integrado precisão relatado abaixo de 1 mm usando um único padrão, mas foram incapazes de alinhar com precisão múltiplos padrões, devido a uma falta de controlo preciso de características selo de molde para moldar a 13. Além disso, ambos os métodos anteriores requerem o substrato para permanecer fixo entre os passos de modelação , assim, limitando significativamente a diversidade de produtos químicos de modificação de superfície que pode serutilizado. Aqui, nós descrevemos um sistema R-μCP automatizado capaz de alinhamento exato e preciso de várias etapas μCP, permitindo flexibilidade máxima em design e fabricação de selo. Além disso, os substratos modelado pode ser repetidamente removida do sistema entre estampadas, permitindo assim a utilização de diversos produtos químicos de modificação do substrato, incluindo substituições nucleófilas sequenciais. Substratos manipuladas usando tais produtos químicos têm sido usados ​​anteriormente para a cultura de células por ambos os nós e os outros 7 6,14. Assim, fundiram-se R-μCP e reacções de substituição nucleofílica sequenciais de desenvolver um método para a fabricação de substratos de cultura escalonável com sinais bioquímicos complexos e micropatterned.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Modelos de ponta com maior precisão estão disponíveis, se desejado.&nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>CUIDADO, Deve ser manuseado apenas em uma capela de exaustão química. Ao silanizar wafers, ninguém deve entrar no capô até que todo o silano tenha evaporado.</td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Desgaseifica soluções através da exposição ao vácuo antes do uso. Kits alternativos, como o Kit 182, são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Corrediças de Vidro de Cobertura #1 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>Estas podem ser adquiridas de vários fornecedores com dimensões variadas para atender às necessidades.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Evaporador de Feixe de Elétrons</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>requer treinamento especializado.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST &</td><td></td></tr><tr><td>omega; -mertcaptoundecil bromoisobutirato</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Armazenar a -20 ° C. Outros iniciadores ATRP podem ser usados como este R-&mu; A plataforma CP é aplicável a todas as modalidades de micropadronização.&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco de Tubo Schlenk 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Requer rolhas de borracha com diafragma.</td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) éter metílico metacrilato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Enviado contendo inibidores legíveis livres de MEHQ e BHT.</td></tr><tr><td>Metanol (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>CUIDADO, manuseie apenas na capela de exaustão química.</td></tr><tr><td>Brometo de cobre (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>CUIDADO, limite a exposição com máscara cirúrgica.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipiridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>CUIDADO, limite a exposição com máscara cirúrgica.</td></tr><tr><td>L-ascorbato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Frascos de cintilação de vidro borossilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>CUIDADO, limite a exposição com máscara cirúrgica.</td></tr><tr><td>N,N-dimethyformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>CUIDADO, manuseie apenas em capela de exaustão química.</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>CUIDADO, manuseie apenas em capela de exaustão química.</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>CUIDADO, manuseie apenas na coifa química.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Aldrich</td><td>276855</td><td>CUIDADO, manuseie apenas em exaustores químicos.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>CUIDADO, manuseie apenas na hotte química.</td></tr><tr><td>200 Prova de Etanol</td><td>Serviços de Distribuição de Materiais da Universidade de Wisconsin</td><td>2292</td><td>CUIDADO, manuseie apenas na capela de exaustão química.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotina</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilizado em DMF</td></tr><tr><td>Sulfato de Cobre (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>CUIDADO, limite a exposição com máscara cirúrgica.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato solução salina</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Itens contaminados com soro de burro são considerados materiais de risco biológico e devem ser descartados de acordo. Vários outros compostos (por exemplo BSA) estão disponíveis e servem a esse propósito.</td></tr><tr><td>Placa de Poliestireno de 12 Poços</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>As placas podem ser adquiridas de vários fornecedores com dimensões variadas.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotina</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilizado em DMF</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilizado em PBS</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 546 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilizado em PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Microscópio Confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>Um microscópio epifluorescente é suficiente para obter imagens de substratos micropadronizados funcionalizados.</td></tr></tbody></table>

fabricando substratos de cultura complexos usando robotic microcontact printing (r-μcp) e substituição nucleofílica sequential

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Na engenharia de tecidos, é desejável exibir controle espacial da morfologia do tecido e do destino celular em cultura na escala de mícrons. Substratos de cultura apresentando escovas de poli (etilenoglicol) (PEG) enxertadas podem ser usados para realizar essa tarefa, criando regiões em microescala, não incrustantes e resistentes à adesão celular, bem como regiões onde as células participam de interações bioespecíficas com ligantes covalentemente amarrados. Para projetar tecidos complexos usando tais substratos, será necessário padronizar sequencialmente vários pincéis PEG funcionalizados para conferir bioatividades diferenciais e alinhados em orientações em microescala que imitam nichos in vivo. A impressão por microcontato (μCP) é uma técnica versátil para padronizar essas escovas PEG enxertadas, mas o μCP manual não pode ser realizado com precisão em microescala. Assim, combinamos robótica avançada com técnicas de litografia suave e reações químicas de superfície emergentes para desenvolver um método assistido por impressão robótica por microcontato (R-μCP) para fabricar substratos de cultura com padrões complexos, em microescala e altamente ordenados de pincéis PEG apresentando químicas ortogonais de 'clique'. Aqui, descrevemos em detalhes o fluxo de trabalho para fabricar tais substratos.

A utilização de técnicas de alinhamento μCP manuais para engenheiro substratos de cultura com matrizes de escovas de PEG-enxertados funcionalizados com ortogonal "clique" químicas tem sido demonstrada em trabalhos anteriores 6. No entanto, este oferece um controle mínimo de orientação padrão e muitas vezes resulta em sobreposição de áreas funcionalizados. Aqui, um novo sistema R-μCP é usado para superar esta limitação, e sua capacidade de precisão padrão de um conjunto de PEG escova anéis com 300 mm ID e 600 ...

Substratos de cultura de células funcionalizados com padrões em microescala de ligantes biológicos têm imensa utilidade no campo da engenharia de tecidos. Aqui, demonstramos a fabricação versátil e automatizada de substratos de cultura de tecidos com várias escovas de poli (etilenoglicol) micropadronizadas apresentando químicas ortogonais que permitem a imobilização espacialmente precisa e específica do local de ligantes biológicos.

Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar substratos de cultura de tecidos com múltiplas escovas PEG de micro padrão, apresentando químicas ortogonais que permitem a imobilização espacialmente precisa e específica do local de ligantes biológicos. Isso é conseguido por matrizes de deposição de acan thiol, um iniciador TRP por uma impressão robótica de micro contato em substratos revestidos de ouro. Como segunda etapa SI, um TRP é realizado nos substratos de micro padrão, que gera escovas PEG com grupos terminais de bromo.Em seguida, os grupos terminais de bromo são funcionalizados com um ou dois grupos reativos químicos para permitir a mobilização IM de ligantes biológicos adequadamente preparados. Em seguida, todo o processo é repetido para funcionalizar com um segundo grupo químico. Os resultados mostram microarrays de duas escovas PEG funcionalizadas ortogonalmente sobrepostas com precisão de 10 mícrons.Isso é verificado usando um software de análise de imagem personalizado após a conjugação dos grupos reativos com moléculas fluorescentes. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos como a impressão manual de micro contato é que a impressão robótica de micro contato é capaz de sobrepor várias etapas de impressão com precisão de mícron, além de permitir a máxima flexibilidade e design de substrato. A precisão proporcionada por este método, juntamente com reações sequenciais de substituição nucleofílica, nos permite gerar substratos de cultura de tecidos que são funcionalizados com múltiplos ligantes biológicos que são então capazes de exercer controle temporal e espacial do sulfato na escala de mícrons.Antes do S-I-A-T-R-P, um slide de capa revestido de ouro deveria ter sido padronizado pelo selo A-P-D-M-S. Este procedimento relativamente comum é explicado em um protocolo de texto. Comece removendo a corrediça da tampa da patente do robô liberando o vácuo.Em seguida, transfira-o para um balão de 50 mililitros de comprimento sch, feche o balão e aplique um vácuo negativo de 30 PSI. Em seguida, adicione 5,5 mililitros de mistura de reação A TRP no frasco usando uma seringa e, em seguida, adicionando 0,5 mililitros de L de ascorbato de sódio em água também via seringa. Observe a reação mudar de cor de verde claro para marrom escuro.Deixar a reacção prosseguir durante 16 horas em gás inerte. Quando a reação estiver completa, remova a lâmina da tampa e enxágue-a com etanol, depois com água e depois com etanol novamente. Em seguida, seque-o suavemente com nitrogênio.O microarray de pincéis P-E-G-M-E-M-A enxertados deve ser visível a olho nu. Use microscopia para revelar essas mudanças em detalhes para Azad funcionalizar, as cadeias P-E-G-M-E-M-A. Transfira a lâmina de cobertura do padrão para um frasco de reação de vidro de 20 mililitros e adicione seis mililitros de DMF contendo 100 milimolares de azida sódica.Deixe a reação ir por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue a lâmina da tampa da patente com etanol e seque-a sob um jato suave de nitrogênio para pacificar as cadeias P-E-G-M-E-M-A funcionalizadas com bromo restantes. Transfira a lâmina de cobertura de micropadrão para um frasco de reação de vidro de 20 mililitros e adicione seis mililitros de DMSO contendo 100 milimolares de etanol amina e 300 milimolares de trietil amina.Permita que essa reação prossiga por 24 horas a 40 graus Celsius no dia seguinte. Enxágue a lâmina de cobertura do padrão com etanol e seque-a suavemente sob uma corrente de nitrogênio. O próximo passo é repetir a impressão de microcontato do robô usando um segundo carimbo PDMS e após o carimbo.Use SI A TRP novamente para representar graficamente o segundo pincel PEG de micro array. Então é hora de acetileno funcionalizar o segundo micro array P-E-G-M-E-A cadeias François. A capa de micro padrão.Deslize para um frasco de reação de vidro de 20 mililitros com seis mililitros de propagamina molar de 100 mililitros em DMF. Deixe a reação prosseguir por 24 horas. À temperatura ambiente no dia seguinte, enxágue a lâmina da tampa da patente com etanol e seque sob um jato suave de nitrogênio.A lâmina da capa da patente está então pronta para a biotina. Comece colocando a micro lâmina de cobertura de patente em um frasco de reação de vidro de 20 mililitros. Primeiro, a biotina comeu as cadeias terminadas de acetileno.Adicione seis mililitros de sulfato de cobre com o conjugado de azida PEG quatro biotina ao frasco de reação, seguido por 1,2 mililitros de 0,15. Ácido milimolar rbic em água para inicializar a reação, borbulhar a reação com nitrogênio por 10 segundos. Em seguida, feche o frasco para injetáveis com paraforme e deixe a reação agir por 24 horas.Em temperatura ambiente no dia seguinte, enxágue a lâmina da tampa com água e transfira-a para um prato de poliestireno de 12 poços. Em seguida, à temperatura ambiente em DPBS com soro de burro por uma hora uma hora depois, corar nos grupos eufóricos de biotina com estreptococo DEIN 5 46 conjugado a dois microgramas por mililitro em DPBS corar por duas horas em temperatura ambiente duas horas depois. Enxágue a lâmina de cobertura em DPBS cinco vezes com vegetação suave.Tobi ITIN aate as cadeias encerradas. Coloque a lamínula em um poço de uma placa de poliestireno de seis poços e aplique dois mililitros de DPBS contendo 20 micromolares D-B-C-O-P-G quatro biotina. Em seguida, incube a lâmina de cobertura por 24 horas em temperatura ambiente 24 horas depois.Enxágue a lâmina da tampa como antes e manche-a com estreptavidina 4 88. Conjugar a dois microgramas por mililitro em DPBS. Duas horas depois.Enxágue a lâmina de cobertura novamente e depois fotografe-a com microscopia. Usando este protocolo de impressão de micro contato de robô. Uma matriz padronizada com precisão da interface do usuário ANN do pincel PEG com grupos alkin terminais foi padronizada dentro de uma matriz separada da interface do usuário ANN do pincel PEG maior com grupos azi terminais.A distribuição espacial dos grupos azida e alcina foi visualizada usando a química do clique e a ligação de estreptavidina de sondas fluorescentes. Uma sobreposição de ambos os canais fluorescentes mostra como os selos não se sobrepõem. A precisão do alinhamento foi calculada em menos de 10 mícrons, que está nos limites da SCAR.Um sistema usado para fazer a impressão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar substratos de cultura de tecidos personalizados usando a impressão robótica de micro contato para sobrepor várias matrizes de pincéis de pinos. Funcionalizado com químicas ortogonais.

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