Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar substratos de cultura de tecidos com múltiplas escovas PEG de micro padrão, apresentando químicas ortogonais que permitem a imobilização espacialmente precisa e específica do local de ligantes biológicos. Isso é conseguido por matrizes de deposição de acan thiol, um iniciador TRP por uma impressão robótica de micro contato em substratos revestidos de ouro. Como segunda etapa SI, um TRP é realizado nos substratos de micro padrão, que gera escovas PEG com grupos terminais de bromo.

Em seguida, os grupos terminais de bromo são funcionalizados com um ou dois grupos reativos químicos para permitir a mobilização IM de ligantes biológicos adequadamente preparados. Em seguida, todo o processo é repetido para funcionalizar com um segundo grupo químico. Os resultados mostram microarrays de duas escovas PEG funcionalizadas ortogonalmente sobrepostas com precisão de 10 mícrons.

Isso é verificado usando um software de análise de imagem personalizado após a conjugação dos grupos reativos com moléculas fluorescentes. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos como a impressão manual de micro contato é que a impressão robótica de micro contato é capaz de sobrepor várias etapas de impressão com precisão de mícron, além de permitir a máxima flexibilidade e design de substrato. A precisão proporcionada por este método, juntamente com reações sequenciais de substituição nucleofílica, nos permite gerar substratos de cultura de tecidos que são funcionalizados com múltiplos ligantes biológicos que são então capazes de exercer controle temporal e espacial do sulfato na escala de mícrons.

Antes do S-I-A-T-R-P, um slide de capa revestido de ouro deveria ter sido padronizado pelo selo A-P-D-M-S. Este procedimento relativamente comum é explicado em um protocolo de texto. Comece removendo a corrediça da tampa da patente do robô liberando o vácuo.

Em seguida, transfira-o para um balão de 50 mililitros de comprimento sch, feche o balão e aplique um vácuo negativo de 30 PSI. Em seguida, adicione 5,5 mililitros de mistura de reação A TRP no frasco usando uma seringa e, em seguida, adicionando 0,5 mililitros de L de ascorbato de sódio em água também via seringa. Observe a reação mudar de cor de verde claro para marrom escuro.

Deixar a reacção prosseguir durante 16 horas em gás inerte. Quando a reação estiver completa, remova a lâmina da tampa e enxágue-a com etanol, depois com água e depois com etanol novamente. Em seguida, seque-o suavemente com nitrogênio.

O microarray de pincéis P-E-G-M-E-M-A enxertados deve ser visível a olho nu. Use microscopia para revelar essas mudanças em detalhes para Azad funcionalizar, as cadeias P-E-G-M-E-M-A. Transfira a lâmina de cobertura do padrão para um frasco de reação de vidro de 20 mililitros e adicione seis mililitros de DMF contendo 100 milimolares de azida sódica.

Deixe a reação ir por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue a lâmina da tampa da patente com etanol e seque-a sob um jato suave de nitrogênio para pacificar as cadeias P-E-G-M-E-M-A funcionalizadas com bromo restantes. Transfira a lâmina de cobertura de micropadrão para um frasco de reação de vidro de 20 mililitros e adicione seis mililitros de DMSO contendo 100 milimolares de etanol amina e 300 milimolares de trietil amina.

Permita que essa reação prossiga por 24 horas a 40 graus Celsius no dia seguinte. Enxágue a lâmina de cobertura do padrão com etanol e seque-a suavemente sob uma corrente de nitrogênio. O próximo passo é repetir a impressão de microcontato do robô usando um segundo carimbo PDMS e após o carimbo.

Use SI A TRP novamente para representar graficamente o segundo pincel PEG de micro array. Então é hora de acetileno funcionalizar o segundo micro array P-E-G-M-E-A cadeias François. A capa de micro padrão.

Deslize para um frasco de reação de vidro de 20 mililitros com seis mililitros de propagamina molar de 100 mililitros em DMF. Deixe a reação prosseguir por 24 horas. À temperatura ambiente no dia seguinte, enxágue a lâmina da tampa da patente com etanol e seque sob um jato suave de nitrogênio.

A lâmina da capa da patente está então pronta para a biotina. Comece colocando a micro lâmina de cobertura de patente em um frasco de reação de vidro de 20 mililitros. Primeiro, a biotina comeu as cadeias terminadas de acetileno.

Adicione seis mililitros de sulfato de cobre com o conjugado de azida PEG quatro biotina ao frasco de reação, seguido por 1,2 mililitros de 0,15. Ácido milimolar rbic em água para inicializar a reação, borbulhar a reação com nitrogênio por 10 segundos. Em seguida, feche o frasco para injetáveis com paraforme e deixe a reação agir por 24 horas.

Em temperatura ambiente no dia seguinte, enxágue a lâmina da tampa com água e transfira-a para um prato de poliestireno de 12 poços. Em seguida, à temperatura ambiente em DPBS com soro de burro por uma hora uma hora depois, corar nos grupos eufóricos de biotina com estreptococo DEIN 5 46 conjugado a dois microgramas por mililitro em DPBS corar por duas horas em temperatura ambiente duas horas depois. Enxágue a lâmina de cobertura em DPBS cinco vezes com vegetação suave.

Tobi ITIN aate as cadeias encerradas. Coloque a lamínula em um poço de uma placa de poliestireno de seis poços e aplique dois mililitros de DPBS contendo 20 micromolares D-B-C-O-P-G quatro biotina. Em seguida, incube a lâmina de cobertura por 24 horas em temperatura ambiente 24 horas depois.

Enxágue a lâmina da tampa como antes e manche-a com estreptavidina 4 88. Conjugar a dois microgramas por mililitro em DPBS. Duas horas depois.

Enxágue a lâmina de cobertura novamente e depois fotografe-a com microscopia. Usando este protocolo de impressão de micro contato de robô. Uma matriz padronizada com precisão da interface do usuário ANN do pincel PEG com grupos alkin terminais foi padronizada dentro de uma matriz separada da interface do usuário ANN do pincel PEG maior com grupos azi terminais.

A distribuição espacial dos grupos azida e alcina foi visualizada usando a química do clique e a ligação de estreptavidina de sondas fluorescentes. Uma sobreposição de ambos os canais fluorescentes mostra como os selos não se sobrepõem. A precisão do alinhamento foi calculada em menos de 10 mícrons, que está nos limites da SCAR.

Um sistema usado para fazer a impressão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar substratos de cultura de tecidos personalizados usando a impressão robótica de micro contato para sobrepor várias matrizes de pincéis de pinos. Funcionalizado com químicas ortogonais.