Name: Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda uma técnica cirúrgica pós-auricular para entrega viral direta na cóclea de camundongos através da membrana da janela redonda. Este método minimiza perda sanguínea e mortalidade, facilitando terapias genéticas para recuperação auditiva.

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Este trabalho é apoiado por uma doação R21 do National Institutes of Health e por uma doação da Hearing Research, Incorporated.

NOTA: Todos os procedimentos e manejo de animais respeitadas as diretrizes de ética do NIH e requisitos protocolo aprovado do Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Universidade da Califórnia, em San Francisco. 1. Preparar o animal para a cirurgia <ol><li> Realizar procedimentos cirúrgicos em um espaço dedicado limpo. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, esterilizar com um esterilizador de esferas de vidro antes da cirurgia. NOTA: Neste protocolo, utilize dia pós-natal (10-12 P10-12) camundongos FVB. Diferentes idades e linhagens de camundongos podem ser usados ​​para atender às necessidades de um projeto específico. Ratos com idade superior a P40 pode ser um desafio, porque o osso bolha fica mais difícil. </li><li> Anestesiar os ratos com injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg), hidrocloreto de xilazina (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Comece a preparação cirúrgica só depois que o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada. Se necessary, administrar uma dose de reforço (um quinto da dose original) do cocktail de anestésico para restaurar o plano anestésico originais. Nota: Tenha cuidado nesta etapa porque a maioria da mortalidade observada nesta idade é causada por overdose de anestésico. </li><li> Cubra os olhos do animal com uma pomada oftálmica de proteção para manter os olhos úmidos durante a anestesia, suprimindo piscar reflexo do animal. </li><li> Posicione o mouse com o pescoço estendido sobre uma almofada de aquecimento durante todo o processo até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia. </li><li> Raspar a região pós-auricular esquerdo com um clipper e desinfectar com álcool 70% e iodopovidona antes de manipulação cirúrgica. </li></ol> 2. O procedimento cirúrgico e Vector Injection <ol><li> Use uma abordagem pós-auricular para expor a bula timpânica. Inciso a tecido subcutâneo com uma tesoura pequena para expor o músculo pós-auricular. Depois de recolher o tecido adiposo para poe lado posterior da incisão, para separar os músculos do lado direito e esquerdo perpendicularmente à incisão para expor o osso temporal. Certifique-se de que esta incisão é tempo suficiente para trabalhar confortavelmente com visualização adequada. </li><li> Perfurar a bula timpânica com uma agulha de 25 G e expandir o buraco, se necessário com uma pinça por descascar o osso de volta para permitir o acesso ao giro basal da cóclea, e, em seguida, ampliar o suficiente para visualizar a artéria estapediana ea membrana da janela redonda (VM) . </li><li> Perfurar o VM suavemente no centro com uma pipeta de borosilicato capilar. Observe efluxo fluido através da VM neste ponto; isso é normal. Aguarde até que o efluxo estabilizou (o fluido effluxed da cóclea é seca com um papel de filtro estéril). NOTA: Tome cuidado ao segurar e fazer avançar a agulha de vidro para que a perfuração RWM é tão pequeno quanto possível. Dependendo do microscópio utilizado, segurar as pipetas utilizando um micromanipulador ou à mão, utilizando uma pipetatitular. </li><li> Prepare as pipetas para injecção utilizando uma pipeta extrator da mesma forma que as pipetas de fixação de membranas são preparadas. Certifique-se de que o diâmetro da ponta é grande (cerca de 15 m de diâmetro), de modo que a pipetagem do vírus dentro e para fora é feito facilmente. </li><li> Elaborar 1-2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP em uma pipeta de injeção. Depois do efluxo é estabilizada (5 a 10 min), microinject este volume fixo na rampa timpânica através do mesmo orifício feito previamente RWM. </li><li> Selar o nicho RW rapidamente depois de retirar a pipeta com uma pequena porção de músculo e fixe-o com uma pequena gota de cola de tecido colocado no músculo para evitar fugas da janela redonda. NOTA: Selar este furo muito bem após a agulha é removida com uma pequena camada de músculo para impedir qualquer fuga de perilinfa a cóclea-este passo é crítico para preservar audição. Falha para selar completamente o VM irá resultar em perda de audição ao longo do tempo. </li><li> Após a injeção, cobrir oburaco na bula auditivo com o tecido adiposo, os músculos retornar pós-auricular e tecido adiposo para a sua posição normal e suturar a ferida em camadas com uma sutura absorvível 6-0 crómico ou menor. </li><li> Desinfectar a ferida com iodopovidona. </li></ol> 3. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Coloque os ratos em uma gaiola quente e não deixá-los abandonados até que sejam totalmente recuperado depois movê-los de volta com a mãe. Recomenda-se a remover o macho da gaiola antes de colocar os filhotes de volta com a mãe. </li><li> Administrar Carprofeno subcutânea (2 mg / kg) para analgesia pós-operatória e a cada 24 horas depois durante 3 dias, para gerir a inflamação e dor. Monitorar os animais diariamente para sinais de sofrimento, perda de peso anormal, dor ou infecção. Geralmente pelo 3º dia após a cirurgia todos os ratos devem estar agindo normalmente. Se quaisquer sinais de angústia ou doença aparecer em um rato após o 3º dia, considerar a eutanásia de tele rato conforme diretrizes institucionais. </li></ol> 4. Avaliação da função coclear Após Parto Viral Usando Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) Recordings NOTA: O tronco encefálico (ABR) é um potencial auditivo extraído da atividade elétrica em curso no cérebro e gravado através de eletrodos colocados sob o couro cabeludo evocado. O animal é estimulado com som. A gravação resultante consiste de cinco ondas que reflectem a actividade eléctrica dos pontos sucessivos da via auditiva nos primeiros 10 ms após o início do estímulo auditivo. <ol><li> Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina. </li><li> Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento durante todo o teste de audição até que o mouse é totalmente acordado, para evitar pós-anestésica hipotermia. NOTA: Useos seguintes estímulos sonoros nesta experiência: clique (5 ms de duração, 31 de taxa de apresentação Hz). </li><li> Coloque eletrodos de agulha subdérmicos no vértice, abaixo do pavilhão auricular esquerdo (de referência), e abaixo da orelha contralateral (terra) e começar a gravação ABRs como descrito anteriormente em uma câmara à prova de som 27,28. Grave ondas ABR em 5 intervalos de nível de pressão sonora dB para baixo de amplitude máxima. </li><li> Determinar os limiares ABR postoperatively logo aos quatro dias após o parto viral NOTA: Threshold é definido como o nível mais baixo de estímulo no qual a resposta picos de ondas I-V foram claramente e repetidamente presente na inspeção visual. </li><li> Medida da onda I analisar a atividade do nervo coclear. O nível mais baixo estímulo que produz uma forma de onda ABR detectável é definido como o limiar. </li></ol> 5. Coclear Transgene Expression Protein, através de imunofluorescência <ol><li> Anestesiar ratos com uma sobredosagem de intraperitoneal injeção de uma mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina, conforme descrito no ponto 1.2 do presente protocolo, excepto sem acepromazina. </li><li> Decapitar a cabeça somente após o animal já não responde a estímulos dolorosos, como toe pitada. </li><li> Dissecar o cochleae fora e processo para imunofluorescência todo o monte, como descrito 26. Um protocolo detalhado do conjunto de montagem coclear imunofluorescência utilizando anticorpos anti-VGLUT3 7a e anticorpos anti-miosina é descrito em Akil et al., 2013 29. </li><li> Para a etiquetagem de GFP, incubar as cocleares inteiras montagens durante a noite a 4 ° C com um anticorpo de coelho anti-GFP em 1: 250 de diluição. </li><li> Lavar as cócleas duas vezes durante 10 min com PBS e depois incubar durante 2 horas em IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy2 diluído 1: 4000 em PBS. </li><li> Lavar as cócleas com PBS duas vezes durante 10 minutos e incubar com DAPI durante 15 min. </li><li> Monte o cochleae em lâminas de vidro e observar under um microscópio com imunofluorescência confocal. </li></ol>

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<li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li>
<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
<li>Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste trabalho, nós descrevemos em pormenor uma técnica que pode ser utilizada para terapia génica coclear, com o objectivo de restaurar ou resgatar função auditiva normal, que está comprometida por um defeito genético. Como é tipicamente atraumática, esta abordagem é seguro para a transferência de genes coclear ou outras terapias moleculares potenciais 30. Outras abordagens para a terapia coclear foram descritas, incluindo uma abordagem ventral 24, cocleostomias 31,32 e saco endolinfáti...

A terapia genética tem sido sugerida como um potencial tratamento para perda auditiva genética, mas o sucesso nesta área permaneceu uma incógnita 1. Até o momento, as metodologias de forma viral mediadas predominaram devido a capacidade teórica para atingir tipos específicos de células dentro da cóclea relativamente inacessível. Ambos os adenovírus (AV) e vírus adeno-associado (AAV) têm sido utilizadas para a entrega de genes coclear. AAV são vantajosos na cóclea por um número de razões. São vírus deficientes na replicação eficiente e pode transferir moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluindo neurónios, um alvo importante para um certo número de causas de perda de audição. Entrada de AAV na célula é mediada por receptores específicos 2; assim, a escolha de um serotipo particular, deve ser compatível com os tipos de células a serem transduzidas. AAV pode eficazmente transfectar células ciliadas 3 e incorporar no genoma hospedeiro, resultando em estabilidade, expressão de longo prazo do traproteína nsgenic e mudança fenotípica na célula 4. Embora não seja necessariamente vantajoso para as aplicações de curto prazo, tais como a regeneração de células de cabelo, expressão de longo prazo é muito importante para o salvamento estável de defeitos genéticos. Porque os AAV não estão associados com qualquer doença humana ou infecção e não demonstram 5,6,7 ototoxicidade, que é um candidato ideal para utilização na terapia de gene para formas herdadas de perda auditiva 8. Transferência de material genético exógeno para o ouvido interno de mamíferos utilizando vetores virais tem sido estudada ao longo da última década e está emergindo como uma técnica promissora para o tratamento de ambas as formas genéticas e adquiridas de perda auditiva 9. A cóclea é potencialmente um alvo ideal para terapia génica, por várias razões: 1) o seu volume pequeno necessita de uma quantidade limitada do vírus necessária; 2) seu relativo isolamento de outros efeitos limites de sistemas de órgãos secundários; e 3) suas câmaras cheias de líquido facilitar viralentrega ao longo do labirinto 10, 11,12,13,14, 15. Modelos de ratos com surdez congênita permitir o uso de vários métodos de estudo para monitorar o desenvolvimento do ouvido interno de uma forma sistemática, replicável. Enquanto o pequeno tamanho do rato cochleae não apresenta alguma dificuldade cirúrgica, o mouse funciona como um modelo extremamente importante no estudo de surdez genética, com várias vantagens em relação a outras espécies experimentais 16. Modelos de ratos permitir a avaliação de um conjunto de características por meio de análise de ligação genética, a coleta de observações morfológicas detalhadas, e simulação de cenários patogénicos; como tal, eles são bons candidatos para a terapia génica mediada por vírus. Estudos genéticos extensas em ratos, combinados com os avanços tecnológicos tornaram possível gerar camundongos geneticamente modificados de forma reproduzíveis em laboratório 17,18, 19, 20,21. Furthermore, existem inúmeros modelos para ambas adquiridas e herdou auditivos fenótipos perda em ratos, permitindo testes rigorosos neste modelo animal 22, 23,24. Assim, corrigindo audiência usando terapia genética mediada por vírus em um modelo de rato é um primeiro passo adequado na busca de uma cura para a doença humana. Nós já mostraram que camundongos transgênicos que faltam glutamato vesicular transporter 3 (VGLUT3) nascem surdos devido à falta de liberação de glutamato na fita sinapse IHC 25. Porque esta mutação não leva a uma degeneração primária das células sensoriais ciliadas, estes ratinhos mutantes são potencialmente um excelente modelo em que para testar a terapia genética coclear para a perda auditiva congênita. Até à data, foram descritos um número de técnicas de entrega virais para terapia genética coclear, incluindo membrana da janela redonda difusão, injecção membrana da janela redonda, e entrega através de um cocleostomias. Existem potenteial vantagens e desvantagens de cada uma destas abordagens 9. Aqui nós relatamos um método cirúrgico para entrega gene viral mediada para o ouvido interno VGLUT3 KO rato através da membrana da janela redonda (VM). O método de injeção RWM pós-auricular é minimamente invasivo, com excelente preservação auditiva, e é relativamente rápido. Como já publicado anteriormente, num esforço para restaurar a audição neste modelo de ratinho, um vector que transporta o gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) foi introduzido na cóclea destes ratinhos surdos, dia pós-natal 12 (P! @), Resultando em a restauração da audição 26. Ouvindo nos ratos VGLUT3 KO foi verificada por audiometria de tronco encefálico (ABR), enquanto que a expressão da proteína transgene foi verificada através de imunofluorescência (IF). Esta metodologia demonstra, portanto, que a terapia génica mediada por vírus pode corrigir um defeito genético que de outra forma seria resulta em surdez.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Fornecida pela UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analgesia de carprofeno</td><td>fornecida pela UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pomada oftálmica de dexametasona (TobraDex)</td> <td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr> Pipeta capilar de borosilicato <tr><td>BD</td><td>305127</td><td></td>agulha <td>25G</td></tr><tr><td></td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sutura PDS*plus Antibacteriano</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Cola de tecido (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Coelho Anticorpo Anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Micropipeta Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Flaming/ Brown&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Extrator de Instrumentos Sutter Modelo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema TDT BioSig III&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Tecnologias</td><td></td><td></td> Tucker-Davis</tr></tbody></table>

método cirúrgico para virally mediated gene entrega à orelha de rato inner através da janela redonda membrane

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

A terapia genética, usada para conseguir a recuperação funcional de surdez neurossensorial, promete conceder uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas subjacentes que contribuem para a perda de audição. Introdução de vectores para o ouvido interno deve ser feito de uma maneira que largamente distribui o agente de toda a cóclea ao minimizar lesão das estruturas existentes. Este artigo descreve a abordagem cirúrgica pós-auricular que pode ser utilizado para a terapia da cóclea de rato usando molecular, farmacológica, e entrega viral para ratinhos 10 dias pós-natais e mais velhos através da membrana da janela redonda (VM). Esta abordagem cirúrgica permite a entrega rápida e directa na escala timpânica, minimizando a perda de sangue e evitar a mortalidade animal. Esta técnica envolve negligenciável ou nenhum dano às estruturas essenciais do ouvido interno e médio, bem como os músculos do pescoço, enquanto preservando totalmente a audição. Para demonstrar a eficácia da técnica cirúrgica, a glutam vesicularComeram transportador 3 nocaute (VGLUT3 KO) será utilizado como um exemplo de um modelo de ratinho de surdez congénita que recupera auditiva após a entrega de VGLUT3 para o ouvido interno utilizando um vírus adeno-associado (AAV-1).

Para verificar as características técnicas e utilidade da abordagem pós-auricular para a terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP foram entregues em camundongos P10-12 ouvido interno através da VM. Esta abordagem demonstra a expressão do transgene de sucesso dentro das células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 GFP e GFP Figura 3A), células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) e células de suporte (GFP Figur...

A abordagem cirúrgica pós-auricular descrita permite a entrega rápida e direta na escala timpânica coclear do camundongo, minimizando a perda de sangue e a mortalidade animal. Este método pode ser usado para terapia coclear usando entrega molecular, farmacológica e viral a camundongos pós-natais através da membrana da janela redonda.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma abordagem cirúrgica pós-auricular que permite a entrega rápida e direta do vírus no timi da escala S da cóclea do camundongo através da membrana da janela redonda. Isso é feito expondo primeiro a bula timpânica. Na segunda etapa, o tecido é perfurado e a artéria edia e a membrana da janela redonda são visualizadas.A membrana da janela redonda é então perfurada e o vírus é injetado no patrocinador. Na etapa final, o orifício é selado. Em última análise, a expressão da proteína transgênica e a recuperação da audição do animal podem ser avaliadas por microscopia imunofluorescente e medição da resposta auditiva do tronco encefálico, respectivamente.As principais vantagens dessa técnica sobre os métodos existentes, como coch, ostomia e abordagem ventral, é que a injeção de membrana de janela redonda pós-ular é minimamente invasiva relativamente rápida, permite injeções de maior volume e facilita a transfecção generalizada de uma variedade de células em toda a cóclea. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque o procedimento depende muito da compreensão completa da anatomia da cóclea. Após confirmar a anestesia pelo dedo do pé, raspe a região pós-auricular esquerda e desinfete a pele de um dia pós-natal, 10 a 12 camundongos com etanol 70% e iodopovidona.Em seguida, cubra os olhos com uma pomada oftálmica protetora e posicione o animal com o pescoço estendido sobre uma almofada de aquecimento. Quando o preparo cirúrgico estiver completo, faça uma incisão no tecido subcutâneo com uma pequena tesoura para expor o músculo pós-auricular. Depois de retrair o tecido adiposo para o lado posterior da incisão, separe os músculos dos lados direito e esquerdo perpendiculares à incisão.Para expor o osso temporal, use uma agulha de calibre 25 para perfurar a bolha timpânica, descascando o osso com uma pinça conforme necessário para expandir o orifício e permitir o acesso ao giro basal da cóclea. Em seguida, alargue o orifício o suficiente para permitir a visualização da artéria estaiada e da membrana da janela redonda. Perfure a membrana da janela redonda suavemente no centro com uma pipeta capilar de silicato de burro.Seque a membrana redonda da janela com um papel de filtro estéril. Em seguida, aguarde de cinco a 10 minutos para que o fluxo de fluido e se estabilize nesta etapa. Tome cuidado ao segurar e avançar a pipeta, para tornar a perfuração da membrana da janela redonda o menor possível.Dependendo do uso do microscópio, a pipeta pode ser segurada manualmente ou por manipulador microm. Como você pode ver aqui, seguramos a pipeta com a mão, pois o microscópio está muito perto do mouse para permitir um micro manipulador. Agora desenhe de um a dois microlitros do vírus em uma pipeta de vidro puxada com uma ponta de 15 micrômetros de diâmetro e microinjete o vírus na escala de timoni através do mesmo orifício feito anteriormente na membrana da janela redonda.Em seguida, retire a pipeta e sele rapidamente o nicho da janela redonda com um pequeno tampão de músculo, prendendo-o com uma pequena gota de adesivo de tecido. Cubra o orifício na bolha auditiva com tecido adiposo e retorne os músculos pós-auriculares e o tecido adiposo à sua posição normal. Em seguida, usando uma sutura crômica absorvível 6.0 ou menor, feche a ferida e desinfete a área da incisão com iodopovidona.Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola quente, devolvendo o pop à mãe após a recuperação total com monitoramento diário. Para avaliar a função coclear quatro dias após o parto viral, posicione um animal transfectado sedado em uma almofada de aquecimento e, em seguida, coloque eletrodos de agulha subdérmica no vértice abaixo do pavilhão auricular da orelha esquerda e abaixo da orelha contralateral. Finalmente, comece a registrar as respostas auditivas do tronco encefálico ou um BR em uma câmara à prova de som, conforme descrito anteriormente, medindo a onda um para analisar a atividade do nervo coclear visto na montagem do orifício coclear.Essa abordagem demonstra a expressão bem-sucedida do transgene nas células ciliadas internas, nas células ciliadas externas e nas células de suporte sem lesão significativa do órgão COR T que diferentes tipos de células expressando GFP podem ser observados no orifício coclear. Mount demonstra que a escolha do sorotipo de vírus adeno associado deve ser compatível com os tipos celulares a serem transduzidos. O número de células transfectadas varia de acordo com a concentração e o volume que o vírus injetou.Neste caso, o aumento de 0,6 para um microlitro resultou em um aumento no número de células transfectadas a um nível comparável ao glúteo três do tipo selvagem A expressão do transgene do glúteo três foi restaurada em camundongos KO injetados como visto nestas imagens aqui, o efeito da entrega da membrana da janela redonda pós-auricular do vírus V GL três no ouvido interno de camundongos V gl três knockout no resgate auditivo é demonstrado como visto em o gráfico. Os traços A BR foram restaurados no VLU três camundongos knockout resgatados atingindo limiares comparáveis aos observados em camundongos do tipo selvagem. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o seu tempo para cada passo para evitar danos às estruturas do ouvido interno e médio, bem como aos músculos do pescoço.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma abordagem pós-cirúrgica para a administração de tratamentos experimentais virais farmacológicos moleculares na bandeja esquelética MAs através da membrana redonda do vento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A orelha interna do rato é um órgão sensorial placode derivado cujo programa é elaborado de desenvolvimento durante a gestação. Nós definimos...

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualização direta do núcleo coclear dorsal murino para estimulação optogenética da via auditiva. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a transferência de genes mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal (DCN) de camundongos para permitir a estimulação auditiva induzida por luz. Um vetor viral que codifica opsina, um canal iônico sensível à luz, é injetado no DCN após uma craniotomia e aspiração cerebelar para acesso direto. As opsinas expressas permitem que...

Transferência gênica mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal do camundongo para estimulação auditiva induzida por luz

Este vídeo mostra a canalostomia, um procedimento que permite a administração local de drogas no ouvido interno de um camundongo através do canal semicircular com danos mínimos à audição e à função vestibular. Este método permite a inoculação de vetores virais, produtos farmacêuticos e pequenas moléculas no ouvido interno do camundongo.

Canalostomia para administração local de medicamentos no ouvido interno de um camundongo adulto

Fonte: Akil, O., et al., Método cirúrgico para entrega de genes mediada por vírus ao ouvido interno de camundongos através da membrana da janela redonda. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento de entrega de um gene terapêutico no ouvido interno de um filhote de camundongo com perda auditiva geneticamente induzida. Usando um vetor viral adeno-associado (AAV), o gene é injetado através da membrana da janela redonda, permitindo que as partículas virais entrem nas células ciliadas,...

Terapia gênica baseada em vetores virais para restauração auditiva em um modelo de camundongo

Existem vários métodos para a introdução de agentes ototóxicos na cóclea de modelos animais. Apresenta-se um protocolo cirúrgico para entrega de agentes ototóxicos no nicho da janela redonda. O procedimento é confiável, cria lesões intracocleares direcionadas e evita danos mecânicos à microarquitetura. O exame do autorreparo/regeneração coclear é possível.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Duas abordagens de microcirurgia para administração local de medicamentos no ouvido interno são descritas aqui e comparadas em termos de impacto nos parâmetros auditivos, citoarquitetura coclear e expressão de marcadores inflamatórios.

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica

Nós relatamos um método cirúrgico para administrar medicamentos para o ouvido interno de um primata não-humano, o sagui comum (Callithrix jacchus), através da membrana da janela redonda.

Um procedimento cirúrgico para a administração de drogas para o ouvido interno em um Non-Human primatas Sagui (Callithrix jacchus)

Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método confiável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Aqui descrevemos o procedimento canalostomy, que permite a entrega de drogas local para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais através do canal semicircular com danos mínimos para a função auditiva e vestibular. Esse método pode ser usado para inocular vetores virais, fármacos e moléculas pequenas para o ouvido interno do rato.

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Aprenda uma técnica cirúrgica pós-auricular para entrega viral direta na cóclea de camundongos através da membrana da janela redonda. Este método minimiza perda sanguínea e mortalidade, facilitando terapias genéticas para recuperação auditiva.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

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