Name: Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a quantificar fagocitose e polimerização de actina em linhagens de macrófagos usando método fluorométrico de alto rendimento. Esta técnica permite análise rápida e custo-efetiva em imunologia.

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Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (para S.R) e F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (para J.N.).

NOTA: Este protocolo pode ser utilizado para várias aplicações, tais como a quantificação de fagocitose e actina de polimerização tal como utilizado no nosso trabalho previamente publicado 12. O protocolo presta-se a uma variedade de modificações, e tipos Tabela 1 apresenta a lista de células e partículas utilizado com sucesso em estudos anteriores. Uso padrão deste protocolo para a quantificação de fagocitose ou actina polimerização é ilustrado no diagrama 1. <img alt="Diagrama 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600"> Diagrama 1:. Diagrama de ensaio fluorométrico para a quantificação de fagocitose e a polimerização da actina Depois as células são plaqueadas, tratada, e deixou-se aderir, partículas marcadas com fluorescência verde (FITC) são adicionados às células para a fagocitose. A reacção é parada por tripano ou antibilavagem ótica (para eliminar partículas não interiorizado) e a fixação é realizada com 4% paraformaldeído. As células são posteriormente corados com etiqueta vermelha fluorescente actina (rhodamine phalloidin) e etiqueta fluorescente azul (DAPI). Os índices de fagocitose e a polimerização da actina são quantificadas como uma proporção de unidades de fluorescência relativa de verde / azul (FITC / DAPI) ou azul (rodamina / DAPI) fluorescência / vermelho. 1. chapeamento e tratamento de células NOTA: Antes de começar, execute os tratamentos com pelo menos 4 repetições técnicos, e incluem os seguintes controles no layout da placa: apenas células (imaculada, com DAPI sozinho ou rhodamine sozinho) e de partículas só. <ol><li> Conduzir todo adição de reagentes nos passos 1-4 em uma capa de cultura de células estéril, a fim de proteger as amostras de contaminação. </li><li> Placa de macrófagos (linha de células de murino J774) em uma placa de 96 cavidades, com 1-5 x 10 células em 4 ul (50 por poço) suplementado meios de pré-aquecido. Pratos ideais para este método são negros placas de 96 poços com fundos transparentes ou pretos, consoante as capacidades de leitor. <ol><li> Por meio suplementado, utilizar 10% de FBS inactivado pelo calor a fim de evitar a interferência da cascata do complemento, e 1% de penicilina / estreptomicina (se não utilizar bactérias vivas para fagocitose). Se se trabalha com células aderentes permitir 1-2 h, para aderência, e para as células não aderentes, girar para baixo a placa com as células durante 10 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Adicionar desejados agonistas / antagonistas ou controlo de veículo a uma concentração 2x (ressuspensas em PBS ou, mais preferivelmente, em meio suplementado) em 50 ul, para um volume final de 100 ul (1x) e incubar durante um período de tempo desejado. Pipeta multicanal e de reagente reservatórios irá facilitar o processamento mais rápido. </li></ol> 2. Opsonização de partículas fluorescentes ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/&gt; Tabela 1: Testado tipos de células e partículas fluorescentes em análise fluorométrico de fagocitose e a polimerização da actina Tabela 1 ilustra combinações de tipos de células (linhagens de células, e as células primárias) que o nosso grupo utilizados através do método fluorométrico.. Excepto olhando para a fagocitose e a polimerização da actina por células do tipo selvagem, que também têm utilizado algumas dessas partículas para exame de fagocitose por células transfectadas que expressam um GFP (proteína fluorescente verde). A fluorescência das células transfectadas com plasmídeos contendo repórteres fluorescentes também pode ser utilizado como um marcador celular, além de DAPI individualidades Tabela:. A - a polimerização da actina; P - fagocitose; PT - a fagocitose por células transfectadas GFP marcado; OPDex - opsonizado talão dextrano; HKOP - calor matou opsonizado. <ol><li> Certifique-se de que as partículas fluorescentes e etiquetas são protegidos da luz em todos os momentos, during processamento, lavar roupa, bem como durante a incubação, a fim de evitar a fotodegradação <ol><li> Para partículas secas, pesar mortos opsonizadas (HKOP) bactérias calor fluorescente (E2861: E. coli K-12 estirpe), por meio de especificações do fabricante. Tome cuidado para se certificar de que as contas de massa para 10: 1 - 20: 1 bactérias: índice de célula (ou, pelo menos, uma proporção de 10: 1 - comumente usado na quantificação de fagocitose) 13,14. Número de partículas pode ser fornecida pelo fabricante ou determinados através couting diluições em série da solução de reserva de 1 mg / ml. </li><li> Ressuspender em 50 ul de PBS e em vórtice durante 1 minuto, a configuração mais elevada. Assegurar vórtex adequada (aqui e em todo o protocolo) que as partículas tendem a agregar o que pode afectar a eficácia de opsonização. </li><li> Para as partículas em suspensão tais como pérolas de dextrano marcados com fluorescência (esferas DEX), a solução estoque de vórtice durante 1 minuto, duração de 50 ul de suspensão ou, dependendo da concentração do volume do grânulo determine monte de contas para facilitar a 10: 1 talão: índice de célula. </li></ol></li><li> Adicionar um volume igual de reagente de opsonização de partículas e vortex vigorosamente por mais um minuto. </li><li> Incubam-se as partículas com opsonizantes reagente a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Após a incubação, as partículas centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, e remover o sobrenadante contendo excesso de reagente opsonizante. Lavam-se as partículas através da adição de 100 ul de PBS, vortex para ressuspender o sedimento, e centrifugado durante 5 min a 500 x g. <ol><li> Repita essas etapas duas vezes para assegurar opsonization adequada e remoção do anticorpo não ligado. </li></ol></li><li> Preparar a solução de trabalho de partículas opsonizadas por ressuspensão em 5 ml de meio (suficiente para uma placa de 96 poços) e armazenar até ao abrigo da luz adição às células. </li></ol> 3. A fagocitose <ol><li> Coloque a solução de trabalho de partículas em um recipiente de reagente estéril. A partir daqui, adicionar 5056; l de partículas opsonizadas para as células preparadas na etapa 1 (para uma concentração final de 50 ng / ml) e permitir que a fagocitose ocorrer em condições de cultura de células padrão. São apresentados abaixo dois métodos de fagocitose que podem ser avaliadas através deste método (Esquema 2). </li></ol><img alt="Diagrama 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600"> Diagrama 2:. Comparação de fagocitose contínua versus fagocitose sincronizar contínua indica interiorização contínua de partículas ao longo do tempo à medida que lentamente atingir as células no fundo do poço. Um passo de sincronização contrastante (centrifugação) força as partículas de afundar para o fundo, aumentando o contacto de partícula com a célula, e que conduz à internalização imediato pelas células. Fagocitose sincronizado é um processo mais rápido que internaliza mais rapidamente parteicles devido ao aumento da célula: o contato de partículas. <ol><li><ol><li> Para o método de fagocitose contínua (Diagrama 2) que permitem que as células de fagocitar bactérias opsonizados continuamente à medida que lentamente afundam para o fundo e entrar em contacto com as células, utiliza intervalos de tempo mais longos para permitir que as bactérias para atingir o fundo do poço e em contato com as células. Se a realização de uma experiência timecourse, adicionar bactérias em intervalos de tempo diferentes e parar a totalidade da placa de reacções ao mesmo tempo para aumentar a velocidade de processamento. </li><li> Para o método sincronizado fagocitose (Diagrama 2) que aumenta a partícula: o contacto de células através de centrifugação, rotação para baixo toda a placa contendo as células e partículas (5 min a 500 xg), logo que as partículas são adicionadas, para facilitar a sincronização de todos os pontos de tempo e para acelerar a partícula: interação célula. <ol><li> Medir o curso de tempo começando logo após a conclusão do centripasso fugation. Se a realização de uma experiência ao longo do tempo, parar cada ponto de tempo, independentemente, em diferentes intervalos de tempo, como descrito abaixo. </li></ol></li></ol></li></ol> NOTA: O método fagocitose sincronizado é um pouco mais trabalhoso do anterior, mas fornece o índice fagocitário maior em menos tempo. 4. A fagocitose Parando <ol><li> Para as células aderentes, remover o sobrenadante e adicionar 50 ul de azul de tripano diluída com PBS (diluição 1: 2), a fim de extinguir a fluorescência das bactérias não-internalizado. </li><li> No caso de células não-aderentes, girar para baixo a placa e remover o sobrenadante. Adicionar 50 ul de azul de tripano diluída. Assegurar a centrifugar a placa a (5-10 minutos a 500 xg) entre cada lavagem, a fim de minimizar a perda de células e permitir a lavagem adequada. </li><li> Após a incubação de tripano, lavar as células duas vezes com PBS, para remover qualquer resíduo de tripano (até o PBS removido do poço ficar transparente). Trypan foi mostrado para extinguir a fluorescência de 15,16 não internalizados marcado por fluorescência, mortas pelo calor, partículas de bactérias, mas não para as bactérias vivas ou grânulos OPDex. Para as bactérias vivos, incluem uma lavagem com antibióticos, como a penicilina, estreptomicina, gentamicina ou em vez da lavagem de tripano para evitar efeitos de confusão de fluorescência de partículas não-internalizado. </li><li> Fixar as células com 100 uL de paraformaldeído a 4%, e incubar durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida lava-se com PBS (em 100 ul por poço para cada lavagem). Neste passo, salvar as células a 4 ° C durante até uma semana, ou prosseguir directamente para a coloração e quantificação. NOTA: Todos os passos subsequentes formar este ponto prefácio pode ser feito fora da capa de cultura de células. </li><li> Remover todo o líquido e adicionar 50 ul de DAPI a 5 ng / ml reconstituídos em PBS. Permitir 5 min para a coloração, e depois lave duas vezes com PBS. Após o passo de lavagem, adicionar 50 ul de PBS a cada poço e ficha fagocitose. 5. Actin Coloração NOTA: Para além da fagocitose, método fluorométrico irá permitir a quantificação de a polimerização da actina, medindo a intensidade de actina, que é reduzida durante a inibição da lamelipï¿½ios, pseudopodiae, e enrugamento da membrana, como resultado de tratamento com um inibidor (Figura 1A). Este é um passo opcional se interessado na quantificação da polimerização de actina em adição à fagocitose. Se a polimerização de actina é o objetivo final, utilizando partículas fluorescentes para a fagocitose é opcional. <ol><li> A seguir à fixação paraformaldeído (passo 4.3), lavar a placa duas vezes com PBS a 100 ul por poço para cada lavagem. Adicionar 50 ul de 0,1% de Triton X-100 em PBS durante a permeabilização e incubar durante -5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave a 0,1% de Triton X-100 a 2 vezes com PBS (como acima), e bloquear com 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 20 minutos para evitar a ligação não específica do label. </li><li> Após o bloqueio, retire a solução BSA e adicione imediatamente rhodamine phalloidin. Para preparar a solução de trabalho de rodamina mancha, utilizar 100 ul de solução metanóico (fornecido pelo fabricante) em 5 ml de PBS (suficiente para uma placa). A partir da solução de trabalho adicionar 50 ul por cavidade e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. NOTA: Seguindo os passos de lavagem e coloração DAPI como no passo 4.4 células estará pronto para a quantificação. </li></ol> 6. Quantificação <ol><li> Para quantificar a fagocitose usando um leitor de placas fluorescentes, ficha fluorescência verde usando filtro de excitação em λ = 488 nm e filtro de emissão de fluorescência em λ = 518 nm, e azul com filtro de excitação em λ = 355 nm e filtro de emissão em λ = 460 nm. </li><li> Para quantificar a polimerização de actina utilizando um leitor de placas fluorescentes, ficha azul fluorescência via λ = 355 nm e λ = 460 nm (como acima), e vermelho gripeorescence através de filtro de excitação a λ = 584 nm e filtro de emissão λ = 620 nm. NOTA: Orbital ou central de detecção é aceitável para a gravação. Alguns tipos de células para recolher mais a borda do poço do centro da cidade, caso em que a gravação orbital pode ser vantajosa. Em particular, a média de três pontos em torno da órbita também poderia ser usado para obter resultados mais precisos. </li><li> Dividir a RFU total de fluorescência verde ou vermelha por azul de leitura de fluorescência (a partir de DAPI), dependendo da etiqueta partícula ou fagocítica vs quantificação actina (Diagrama 1). Devido à alta variância placa-to-plate, use índices relativos (como em relação a T = 0 controle), para melhor ilustrar as tendências observadas e para facilitar a análise estatística mais confiável. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).</li>
<li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Bone+And+Joint+Surgery.+British+Volume%22%5BJournal%5D)">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633(2013).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621(2012).</li>
<li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development%2C+stress+response%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li>
<li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li>
<li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li>
<li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory%2C+GM-CSF-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898(2013).</li>
<li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li>
<li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRP%2Fanti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70(2011).</li>
<li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-%2C+Rac-1-%2C+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+Of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li>
<li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193(2007).</li>
<li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li>
<li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22132%22%5BJournal%5D)">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li>
<li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

As principais limitações da técnica são fluorométrico de variação experimental, bem como a perda de células associadas com a lavagem e a utilização de células não-aderentes extensa. A variação é observada em grande parte devido à variação em partículas fluorescentes como pesagem e pipetagem durante a preparação da solução não é uma maneira exata de manutenção de números idênticos de partículas de experiência para experiência. Para resolver o problema da variação entre experiências, os dados ...

Quantificação do sinal fluorescente tem sido amplamente utilizado em uma infinidade de métodos científicos que vão de PCR, citometria de fluxo, microscopia confocal, e se aflige análise multiplex ELISA. Imagens de fluorescência e quantificação tem uma ampla aplicação e pode ser uma ótima ferramenta para análise quantitativa de vários processos celulares. A utilização de marcadores fluorescentes e o seu sinal foi revolucionada na última década, e aparecimento de leitores de placas fluorescentes facilitou a elevada taxa de transferência de quantificação de fluorescência emitida durante processos celulares. Análise Fluorometric pode servir como uma grande ferramenta na quantificação de fagocitose. A fagocitose tem sido estudada desde a descoberta dos fagócitos por Metchnikoff em 1800 1. Ao longo dos anos, uma grande variedade de métodos têm sido utilizados para examinar este processo importante essenciais para a defesa imune inata contra a invasão bacteriana, virai, fúngica e parasitas patogénicos 2-5. Os métodos anteriores de microscopia de quantificação utilizados e técnicas de estereologia, a fim de visualizar as células que são fagocitando, que foram, então, quantificada por contagem de partículas internalizadas (manualmente ou com o uso de software) 6-8. Algumas desvantagens de usar microscopia sozinho para análise quantitativa são de que a contagem manual de bactérias é um trabalho intensivo e mais propenso a viés do observador. Outro método utilizado na quantificação da fagocitose é a técnica microbiológica de chapeamento de bactérias a partir de lisados ​​celulares (após fagocitose) em placas de cultura de bactérias, mas este método pode não têm em conta os mecanismos de bactericidas e presença de bactérias parcialmente internalizados. Este método é ainda mais trabalhosa em comparação com microscopia e demora vários dias a analisar. A citometria de fluxo parece ser a forma mais rápida e mais eficaz para quantificar a fagocitose e tem sido utilizado por vários grupos de 9-11, mas o custo elevado comumente associada com o nostrument necessários para a análise faz com que seja o método mais caros quando comparados com os ensaios mencionados anteriormente. O método fluorometric é uma boa alternativa para a citometria de fluxo para análise de partículas internalização uma vez que oferece quantificação imparcial de fluorescência usando equipamento que não é tão custo proibitivo. Outros benefícios adicionais de fluorometria são de alta eficiência, e recursos de alto rendimento para quantificar fluorescência emitida pelas partículas internalizados marcados. Benefícios de fluorometria pode ser extrapolada para a quantificação de outros processos de fagocitose. Por exemplo, a análise fluorométrico pode ser aplicada ao estudo de qualquer processo que conduza a alterações na expressão intracelular ou de receptores ligados a membranas, as alterações na permeabilidade celular / viabilidade, a eficácia de transfecção, e modulação em polimerização da actina. Uma desvantagem da técnica fluorométrico é que, dependendo das etiquetas utilizadas, pode haver um elevadoexperiência para experiência variabilidade que normalmente pode ser resolvido através da demonstração de dados por meio de quantificação relativa, como a mudança vezes ou por cento de aumento do controle.

<table><tbody><tr><td>1 &mu; m Fluorescentes amarelo-esverdeadas Fluo-Spheres;</td><td>Sondas Moleculares</td><td>F8852</td><td>combinam 50&mu; l com 50&mu; l opsonizing reagente por 30 min a 37oC antes do uso</td></tr><tr><td>Calor matou E. coli BioParticles fluoresceína conjugado</td><td>Sondas Moleculares</td><td>E2861</td><td>reconstituem (5 mg) em 50 &mu; l de PBS e combinar com 50 &mu; l opsonizando reagente por 30 min a 37 & C antes do uso</td></tr><tr><td>Reagente de opsonização</td><td>Sondas moleculares</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina faloidina</td><td>Sondas moleculares</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Os itens abaixo estão disponíveis em várias marcas, mas os itens que usamos neste estudo são dos seguintes fabricantes:</td></tr><tr><td>Meio de crescimento celular RPMI</td><td>Gibco</td><td></td><td>Suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina; quente em 37 &deg; C antes do uso</td></tr><tr><td>Leitor de placas fluorescentes - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (16%)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>diluir a 4% antes do uso</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>placas transparentes ou pretas ou transparentes Pipeta</td></tr><tr><td>multicanal (8 - 12 canais)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de</td><td></td> reagentes<td></td><td></td></tr><tr><td>1x tubos PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge (0,6 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conículos (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

técnica high throughput fluorometric de avaliação da macrófago fagocitose e actina polimerização

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

O objectivo da análise fluorométrico é para servir como um custo eficaz, eficiente método de transferência, a análise de alta fagocitose e outros processos celulares. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de tipos de células, tanto aderentes e não aderentes, para analisar uma variedade de propriedades celulares. Ao estudar a fagocitose, a técnica utiliza fluorométrico tipos de células fagocíticas, tais como macrófagos, e partículas opsonizadas marcados com fluorescência cuja fluorescência pode ser extinto na presença de azul de tripano. Após plaqueamento de macrófagos aderentes em placas de 96 poços, as partículas fluorescentes (verde ou vermelha) são administrados e células são deixadas a fagocitose por montantes variados de tempo. Após internalização de partículas fluorescentes, as células são lavadas com azul de tripano, a qual facilita a extinção do sinal de fluorescência a partir de bactérias que não são internalizadas, ou são apenas aderem à superfície da célula. Após a lavagem de tripano, as células são lavadas com PBS, fixadas, umand coradas com DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que serve para etiquetar os núcleos de células. Por uma quantificação fluorometric simples através de leitura de placas de nuclear (azul) ou partícula (verde / azul) fluorescência podemos examinar a proporção de unidades de fluorescência relativa de verde: azul e determinar um índice fagocitário indicativo de quantidade de bactérias fluorescentes internalizadas por célula. A duração do ensaio utilizando um método e multicanal 96 poços pipetas para a lavagem, a partir da extremidade de fagocitose ao fim de aquisição de dados, é inferior a 45 min. A citometria de fluxo pode ser usado de uma maneira semelhante mas a vantagem de fluorometria é o seu elevado rendimento, o método de avaliação rápida com o mínimo de manipulação de amostras rápida e quantificação da intensidade de fluorescência por célula. Estratégias similares podem ser aplicados para as células não aderentes, as bactérias marcadas vivo, a polimerização da actina, e essencialmente qualquer processo utilizando fluorescência. Portanto, fluorometria é um método promissor para o seu baixo custo, alta throughpcapacidades ut no estudo de processos celulares.

Duas formas principais de quantificar a fagocitose e a subsequente polimerização da actina, através da utilização deste protocolo é de observar fagocitose contínua ou sincronizada. A análise microscópica (Figura 1B) ilustra imagens fluorescentes comparáveis ​​ao que o fluorometer está gravando (veja também o Diagrama 1). Na Figura 1B são fluorescência vermelha de actina, verde 268 fluorescência de FITC etiquetas HKOP E. coli, mancha...

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar as mudanças no processo fagocítico ou atuar na polimerização após a adição de agonistas ou antagonistas. Isso é conseguido adicionando partículas marcadas com fluorescência às células fagocíticas e permitindo tempo suficiente para que a fagocitose ocorra. Como segundo passo para parar a fagocitose, as células são tratadas com azul de triam para extinguir a fluorescência de partículas não internalizadas, lavadas e posteriormente fixadas com paraldeído.Em seguida, vem a coloração e quantificação. A fim de facilitar a detecção fluorescente de células e partículas, células sustentadas com DPI ou actina, os resultados mostram o efeito do tratamento na fagocitose e polimerização da actina quantificado por meio de uma razão de fluorescência verde vermelho para azul com base na análise métrica fluorada. A principal vantagem da técnica de fluorometria sobre os métodos existentes é que ela é um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliação da fagocitose.Ele permite a manipulação mínima da amostra e a quantificação rápida da intensidade fluorescente por célula. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia e biologia celular, como a eficácia e a rapidez da eliminação desse patógeno. Mudança de polimerização de ação durante a fagocitose e como a fagocitose ou polimerização do axônio é modulada por agonistas ou antagonistas.Para iniciar a placa de procedimento, os macrófagos da linhagem celular Murine J 7 74 em uma placa de 96 poços com fundo transparente ou preto incubam as células de aderência a 37 graus Celsius por uma a duas horas para permitir o adion na placa. Em seguida, adicione os agonistas ou antagonistas desejados ou o controle do veículo às células na concentração de dois x em 50 microlitros de PBS ou meio suplementado e incube por um período de tempo desejado. Nesta etapa, certifique-se de que as partículas fluorescentes e os rótulos estejam protegidos da luz o tempo todo durante o processamento, lavagem e incubação.Para evitar o fotobranqueamento, use as partículas em suspensão, como grânulos dextra marcados com fluorescência ou a solução de estoque por um minuto. Em seguida, adicione uma quantidade igual de reagente opsonizante às partículas fluorescentes e vore vigorosamente por mais um minuto. Posteriormente, incubar a mistura a 37 graus Celsius por uma hora após a centrífuga de incubação as partículas foram cinco minutos.A 500 vezes G. Remova o sobrenadante S contendo excesso de reagente opsonizante. Em seguida, lave as partículas com 100 microlitros de PBS. Vortex a amostra para ressuspender o pellet e centrifugue-o por cinco minutos de 500 a vezes G. Repita essas etapas mais duas vezes para garantir a otimização e remoção adequadas do anticorpo não ligado.Para preparar a solução de trabalho de partículas ionizadas, suspenda novamente as partículas em cinco mililitros de meio. Em seguida, guarde-o longe da luz até uso posterior. Agora coloque a solução de trabalho de partículas em um reservatório de reagente estéril.Adicione 50 microlitros de partículas opsonizadas às células preparadas anteriormente até uma concentração final de 15 nanogramas por mililitro e permita que a fagocitose ocorra em condições padrão de cultura de células. Para o método de fagocitose contínua, aguarde de 30 minutos a uma hora para que as partículas fluorescentes atinjam o fundo do poço e entrem em contato com as células. Se estiver conduzindo um experimento de curso de tempo, adicione bactérias em diferentes intervalos de tempo e pare toda a placa de reações ao mesmo tempo.Para aumentar a velocidade de processamento das células de aderência, remova o sennet e adicione 50 microlitros de azul triam diluído com PBS para extinguir a fluorescência de bactérias não internalizadas após a incubação triana. Lave a placa duas vezes com PBS para remover qualquer trian residual. Em seguida, fixe as células com 50 microlitros de 4% de paraldeído e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, lave a placa com PBS. Retire todo o líquido e adicione 50 microlitros de DPI Após cinco minutos de coloração, lave a placa duas vezes com PBS. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS a cada poço e registre a fagocitose após a fixação do paraldeído.Lave a placa duas vezes com 100 microlitros de PBS por poço para cada lavagem. Em seguida, adicione 50 microlitros de 0,1% de Triton X 100 em PBS às células para permeação e incube-as por três a cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave o Triton X de 0,1% com PBS duas vezes.Em seguida, bloqueie as células com 1% BSA por 20 minutos para evitar a ligação não específica do rótulo. Agora prepare a solução de trabalho da coloração de Rod domine adicionando 100 microlitros de solução estoque de metanol em cinco mililitros de PBS. Após o bloqueio, remova a solução BSA imediatamente.Adicione 50 microlitros de foid de rumina e solução de trabalho a cada poço e incube as células no escuro por 20 minutos em temperatura ambiente. Para quantificar a fagocitose, coloque a placa em um leitor de placas fluorescentes Registre a fluorescência verde usando um filtro de excitação em um comprimento de onda de 488 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 518 nanômetros e fluorescência azul usando um filtro de excitação em um comprimento de onda de 355 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 460 nanômetros. Para quantificar a polimerização da actina usando um leitor de placa fluorescente, registre a fluorescência vermelha por meio de um filtro de excitação em um comprimento de onda de 584 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 620 nanômetros e fluorescência azul.Filtro de fogo e excitação em um comprimento de onda de 355 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 460 nanômetros. Em seguida, divida a RFU total de fluorescência verde ou vermelha pela leitura de fluorescência azul, dependendo do rótulo da partícula ou quantificação fagocítica versus actina devido à placa alta. Para a variância do prato, use índices relativos para melhor ilustrar as tendências observadas e facilitar uma análise estatística mais confiável.Esta imagem ilustra as mudanças na polimerização da actina após a adição do inibidor. Estes são os pseudópodes formação e aqui estão as mudanças no rugado da membrana. Nesta imagem, as células foram autorizadas a internalizar grânulos X conjugados fitzy em uma proporção de 20 para um grânulo para célula por 60 minutos.Em seguida, as células serão lavadas com trian e PBS fixadas com paraldeído, permeáveis com acetona e corante para F actina Usando bastonete domine, F loin e dpi, a fagocitose contínua de partículas opsonizadas e não oxidadas é bastante comparável. Onde J 7 74 células estão internalizando grânulos dextras. Curiosamente, a polimerização da actina após a fagocitose aumenta a desaceleração em pontos posteriores, enquanto a polimerização da actina após a internalização de partículas unop não aumenta nenhum dos métodos fagocíticos usando partículas extras resulta em mudanças na viabilidade celular Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em uma a duas horas com várias placas ao mesmo tempo, se for realizada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar a análise métrica de flúor como um método eficiente e econômico de alto rendimento para analisar fagocitose e outros processos celulares.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Ensaio de atração de macrófagos transwell baseado em fluorescência: um método in vitro para estudar a interação tumor-macrófago por meio de quimiotaxia induzida por produtos químicos

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&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

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Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

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