Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar as mudanças no processo fagocítico ou atuar na polimerização após a adição de agonistas ou antagonistas. Isso é conseguido adicionando partículas marcadas com fluorescência às células fagocíticas e permitindo tempo suficiente para que a fagocitose ocorra. Como segundo passo para parar a fagocitose, as células são tratadas com azul de triam para extinguir a fluorescência de partículas não internalizadas, lavadas e posteriormente fixadas com paraldeído.

Em seguida, vem a coloração e quantificação. A fim de facilitar a detecção fluorescente de células e partículas, células sustentadas com DPI ou actina, os resultados mostram o efeito do tratamento na fagocitose e polimerização da actina quantificado por meio de uma razão de fluorescência verde vermelho para azul com base na análise métrica fluorada. A principal vantagem da técnica de fluorometria sobre os métodos existentes é que ela é um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliação da fagocitose.

Ele permite a manipulação mínima da amostra e a quantificação rápida da intensidade fluorescente por célula. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia e biologia celular, como a eficácia e a rapidez da eliminação desse patógeno. Mudança de polimerização de ação durante a fagocitose e como a fagocitose ou polimerização do axônio é modulada por agonistas ou antagonistas.

Para iniciar a placa de procedimento, os macrófagos da linhagem celular Murine J 7 74 em uma placa de 96 poços com fundo transparente ou preto incubam as células de aderência a 37 graus Celsius por uma a duas horas para permitir o adion na placa. Em seguida, adicione os agonistas ou antagonistas desejados ou o controle do veículo às células na concentração de dois x em 50 microlitros de PBS ou meio suplementado e incube por um período de tempo desejado. Nesta etapa, certifique-se de que as partículas fluorescentes e os rótulos estejam protegidos da luz o tempo todo durante o processamento, lavagem e incubação.

Para evitar o fotobranqueamento, use as partículas em suspensão, como grânulos dextra marcados com fluorescência ou a solução de estoque por um minuto. Em seguida, adicione uma quantidade igual de reagente opsonizante às partículas fluorescentes e vore vigorosamente por mais um minuto. Posteriormente, incubar a mistura a 37 graus Celsius por uma hora após a centrífuga de incubação as partículas foram cinco minutos.

A 500 vezes G. Remova o sobrenadante S contendo excesso de reagente opsonizante. Em seguida, lave as partículas com 100 microlitros de PBS. Vortex a amostra para ressuspender o pellet e centrifugue-o por cinco minutos de 500 a vezes G. Repita essas etapas mais duas vezes para garantir a otimização e remoção adequadas do anticorpo não ligado.

Para preparar a solução de trabalho de partículas ionizadas, suspenda novamente as partículas em cinco mililitros de meio. Em seguida, guarde-o longe da luz até uso posterior. Agora coloque a solução de trabalho de partículas em um reservatório de reagente estéril.

Adicione 50 microlitros de partículas opsonizadas às células preparadas anteriormente até uma concentração final de 15 nanogramas por mililitro e permita que a fagocitose ocorra em condições padrão de cultura de células. Para o método de fagocitose contínua, aguarde de 30 minutos a uma hora para que as partículas fluorescentes atinjam o fundo do poço e entrem em contato com as células. Se estiver conduzindo um experimento de curso de tempo, adicione bactérias em diferentes intervalos de tempo e pare toda a placa de reações ao mesmo tempo.

Para aumentar a velocidade de processamento das células de aderência, remova o sennet e adicione 50 microlitros de azul triam diluído com PBS para extinguir a fluorescência de bactérias não internalizadas após a incubação triana. Lave a placa duas vezes com PBS para remover qualquer trian residual. Em seguida, fixe as células com 50 microlitros de 4% de paraldeído e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, lave a placa com PBS. Retire todo o líquido e adicione 50 microlitros de DPI Após cinco minutos de coloração, lave a placa duas vezes com PBS. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS a cada poço e registre a fagocitose após a fixação do paraldeído.

Lave a placa duas vezes com 100 microlitros de PBS por poço para cada lavagem. Em seguida, adicione 50 microlitros de 0,1% de Triton X 100 em PBS às células para permeação e incube-as por três a cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave o Triton X de 0,1% com PBS duas vezes.

Em seguida, bloqueie as células com 1% BSA por 20 minutos para evitar a ligação não específica do rótulo. Agora prepare a solução de trabalho da coloração de Rod domine adicionando 100 microlitros de solução estoque de metanol em cinco mililitros de PBS. Após o bloqueio, remova a solução BSA imediatamente.

Adicione 50 microlitros de foid de rumina e solução de trabalho a cada poço e incube as células no escuro por 20 minutos em temperatura ambiente. Para quantificar a fagocitose, coloque a placa em um leitor de placas fluorescentes Registre a fluorescência verde usando um filtro de excitação em um comprimento de onda de 488 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 518 nanômetros e fluorescência azul usando um filtro de excitação em um comprimento de onda de 355 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 460 nanômetros. Para quantificar a polimerização da actina usando um leitor de placa fluorescente, registre a fluorescência vermelha por meio de um filtro de excitação em um comprimento de onda de 584 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 620 nanômetros e fluorescência azul.

Filtro de fogo e excitação em um comprimento de onda de 355 nanômetros e um filtro de emissão em um comprimento de onda de 460 nanômetros. Em seguida, divida a RFU total de fluorescência verde ou vermelha pela leitura de fluorescência azul, dependendo do rótulo da partícula ou quantificação fagocítica versus actina devido à placa alta. Para a variância do prato, use índices relativos para melhor ilustrar as tendências observadas e facilitar uma análise estatística mais confiável.

Esta imagem ilustra as mudanças na polimerização da actina após a adição do inibidor. Estes são os pseudópodes formação e aqui estão as mudanças no rugado da membrana. Nesta imagem, as células foram autorizadas a internalizar grânulos X conjugados fitzy em uma proporção de 20 para um grânulo para célula por 60 minutos.

Em seguida, as células serão lavadas com trian e PBS fixadas com paraldeído, permeáveis com acetona e corante para F actina Usando bastonete domine, F loin e dpi, a fagocitose contínua de partículas opsonizadas e não oxidadas é bastante comparável. Onde J 7 74 células estão internalizando grânulos dextras. Curiosamente, a polimerização da actina após a fagocitose aumenta a desaceleração em pontos posteriores, enquanto a polimerização da actina após a internalização de partículas unop não aumenta nenhum dos métodos fagocíticos usando partículas extras resulta em mudanças na viabilidade celular Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em uma a duas horas com várias placas ao mesmo tempo, se for realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar a análise métrica de flúor como um método eficiente e econômico de alto rendimento para analisar fagocitose e outros processos celulares.