Name: Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a implantar uma câmara óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de camundongos para imagens longitudinal in vivo. Este método permite estudar dinâmicas celulares sem cirurgias repetidas.

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Agradecemos ao Dr. Joseph R. Fetcho por sua contribuição durante todo o desenvolvimento do procedimento. Gostaríamos de agradecer o financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01 EB002019 para C.B.S e DP OD006411 para Joseph R. Fetcho) e do Conselho Nacional de Ciência e Pesquisa do Canadá (para M.J.F.) para apoio financeiro.

NOTA: O cuidado e manipulação experimental de todos os ratinhos neste trabalho foi aprovado pelo Comitê Institucional Animal Care e Uso da Universidade Cornell. 1. Preparação para Cirurgia <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos necessários usando uma autoclave ou procedimentos de esterilização aprovados. No mínimo, incluir um bisturi, tesouras, tesouras vanna, pinça, chave de fenda do joalheiro, cotonetes, um conjunto de afastadores, o implante (Figura 1A) e seu sistema de entrega (Figura 1D, E). </li><li> Limpe todas as superfícies, incluindo as maçanetas estereoscópio, com 70% de etanol e / ou desinfetantes adequados. </li><li> Criar um campo estéril sobrepondo o stereotax custom (Figura 1D) e em torno de bancada com campos estéreis. A almofada de aquecimento (de preferência realimentação controlada) deve ser colocada no topo do stereotax e sob os lençóis esterilizados. </li></ol> 2. Prepararo mouse para Cirurgia <ol><li> Anestesiar um rato com menos de 5% de isoflurano / oxigênio em uma câmara de indução até a taxa de respiração diminui para cerca de 1 respiração / sec. </li><li> Transferir rato para uma área de preparação de distância a partir do campo estéril, utilizando um cone de nariz para continuar exposição isoflurano. Reduzir isoflurano a 2%. Aplicar colírio para evitar o ressecamento da córnea. </li><li> Administrar glicopirrolato (uma droga anticolinérgica) a 0,05 mg / 100 g por via intramuscular no rato, utilizando os membros posteriores 29-30 agulhas G e 3/10 cc seringa, proporcionando aproximadamente 50% do volume de injecção por ramo. NOTA: Glicopirrolato serve para evitar o acúmulo de líquido nos pulmões, enquanto o mouse está sob anestesia. </li><li> Usando clippers elétricos, raspar uma parte do dorso do rato, cerca de 3 cm de comprimento por 2 cm de largura e centradas no arco torácica. Limpe todo o cabelo cortado bem longe da área raspada. </li><li> Administrar as seguintes injecções por via subcutânea e distal ao raspadapatch usando 29-30 agulhas G e seringas de 3/10 cc: 1 ml / 100 g de rato 5% de glucose em soro fisiológico (por hidratação), 5 mg / kg de cetoprofeno rato (um NSAID para analgesia), 0,2 mg / kg de dexametasona rato ( um esteróide anti-inf lamatório para reduzir a inflamação). </li><li> Usando cotonetes, realizar três lavagens alternadas de iodo e etanol a 70%, à espera 1 min entre lavagens. </li><li> Administrar 100 ul de 0,125% de bupivacaína (um bloqueio do nervo periférico) por via subcutânea utilizando 29-30 agulhas G e 3/10 cc seringa para o centro da mancha raspada para reduzir a dor no local da incisão. </li><li> Transferência do mouse para o costume stereotax (Figura 1D), inserir termômetro retal, e esperar cerca de 10 min para bupivicaine entrem em vigor. </li></ol> 3. Exponha e limpar o Dorsal Lâminas de 3 Adjacente Thoracic Vértebras <ol><li> Usando a lâmina de bisturi, criar uma pequena (5 mm ou menos) por cima da incisão vértebras de interesse (Figura 2A). </li><li&gt; Usando o auxílio de pinças ou por inserção da ponta de uma tesoura cirúrgica e espalhando as alças, aumentar o tamanho da abertura na pele por dissecação romba. </li><li> Usando um bisturi ou tesouras cirúrgicas, dissociar suavemente fáscia conjuntivo entre a pele e o músculo subjacente. </li><li> Use afastadores para segurar a pele, permitindo tão grande uma área de trabalho possível (Figura 2B). Tome cuidado para não aumentar a carga sobre o peito e, assim, obstruir a respiração. </li><li> Usando um par de fórceps, pega o rostral-mais vértebra que será exposto através do músculo sobrejacente. Utilizando um bisturi, o tecido cortado em ambos os lados do processo dorsal de todos os três vértebras (Figura 2c). </li><li> A utilização de qualquer combinação de uma lâmina de bisturi, cotonetes, e / ou raspador de osso, remover todo o tecido que recobre a partir da lâmina dorsal (Figura 2D). </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica, cortar cuidadosamente tendões ligados às vértebras em ambos lateral bordas da coluna vertebral (Figura 2E). </li><li> Usando o bisturi, com cuidado remover o máximo de tecido a partir dos bordos laterais da coluna vertebral, tal como possível, a fim de proporcionar uma superfície de aperto limpo. </li><li> Suavemente debride as vértebras de qualquer tecido macio restante, utilizando um raspador de osso e / ou um cotonete. Apare qualquer tecido incongruente em outros lugares usando uma tesoura cirúrgica (Figura 2F). NOTA: É essencial para a fixação e realização da laminectomia dorsal que as vértebras são claramente expostos. Um cauterizador pode ser útil no controle da hemorragia subsequente. </li><li> Deslocar afastadores para segurar o tecido circundante da coluna vertebral em adição à pele (Figura 2F). </li><li> Prenda as barras laterais implante para os dentes nos postes de entrega e carregá-los para os detentores de pós-(como na Figura 1E). </li><li> Prenda as vértebras 3 usando as barras laterais, aplicando pressão suficiente para segurar securely (Figura 2G, H). Use uma pinça para ajudar a garantir um nível de fixação das vértebras 3. Note-se que várias tentativas pode ser necessária. Certifique-se de que as barras laterais são tanto a nível e antes paralelo com a realização do laminectomy. </li><li> Cuidadosamente limpar e secar a superfície dorsal das vértebras pinçada usando cotonetes. </li></ol> 4. Execute um Laminectomy Dorsal <ol><li> Insira as pontas das tesouras Vannas no espaço epidural da vértebra pinçada medial e espremer as alças levemente; se o osso for seco, deve rachar ao longo do comprimento da lâmina dorsal. Repita este procedimento no lado contralateral para liberar a lâmina. </li><li> Delicadamente, segurando a lâmina solta pelo processo dorsal com uma pinça, cortar cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo nas extremidades rostral e caudal da lâmina e levante-a. </li><li> Usar soro fisiológico 0,9% e / ou líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF), lave bem longe qualquer overlyi sangueng a medula espinhal. Use cotonetes para absorver o excesso de fluido. </li><li> Com uma tesoura Vannas, aparar cuidadosamente as bordas laterais do osso de volta para as barras laterais do implante. Mais uma vez, lavar e controlar o sangramento usando cotonetes e soro fisiológico / ACSF. </li><li> No caso em que uma porção do periósteo foi isolada e sobrepõe-se a medula espinal, suavemente remover este tecido com cotonetes de algodão e / ou um 29 - agulha 30 G. Tome cuidado para não ferir a medula espinhal nessa porção do procedimento. Não confunda o periósteo solto com a dura-máter embrulhado. </li><li> Cuidadosamente, selar as restantes extremidades expostas do osso com um ou ambos de cianoacrilato e acrílico dental (Figura 2I). Tome especial cuidado para não permitir que as colas a fluir para a medula espinhal exposta. </li></ol> 5. Seal da Câmara <ol><li> Posicione a placa superior com cuidado para que os 4 slots alinhar com os 4 furos nas barras laterais ea abertura recobre o spin expostacabo al (Figura 1B e 2J). </li><li> Usando chave de fenda do joalheiro, comece com cuidado o primeiro parafuso, estabilizando o eixo da chave de fenda com outro par de fórceps. Não aperte o parafuso nesta fase, mas inseri-lo de modo a que os primeiros tópicos estão engajados. Repita esse processo para os outros 3 parafusos. NOTA: É útil para usar titânio ou outros fórceps não magnetizáveis ​​para ajudar a posicionar os parafusos nesta fase. </li><li> Com todos os 4 parafusos no lugar, aperte cada parafuso alternadamente pela mesma quantidade em pequenos incrementos até parafusos estão bem fixados (Figura 2K). Note-se que isto não é invulgar para a placa de topo a flectir durante este processo. Tome cuidado para não apertar os parafusos muito, pois a cabeça do parafuso pode quebrar e pressão descendente excessiva vai desalojar a braçadeira e / ou resultar em lesão medular. </li><li> Usar um elastómero de silicone para preencher o espaço entre a medula espinal e da janela de vidro. Porque corças não produzem ácido acético durante a cura, use KwikSil marca elastômero e dicas de mistura. Aplicar uma porção liberal do silicone para a medula espinal exposta. Tome cuidado para se livrar de qualquer silicone contendo bolhas de ar da ponta de mistura antes da aplicação para a medula espinhal. </li><li> Trabalhando rapidamente, pressione suavemente a 5 milímetros # 0 lamela para a inserção na placa superior. Aplicar pressão suficiente para apertar progressivamente o elastómero líquido para cercar a medula espinal, mas não resultar na compressão da medula espinal (Figura 2L). Determinar a hora para o elastômero é de aproximadamente 90 segundos, por isso certifique-se a lamela é aplicada rapidamente. </li><li> Em caso de uma vedação não, espere até que o elastômero definiu, remova-o suavemente a partir do implante com uma pinça, e repetir 5,4-5,5. </li><li> Cobrir as bordas de elastómero exsudado com acrílico dental / cianoacrilato e aderir ao osso circundante, tanto quanto possível para evitar que o elastómero de deslocamento sobre a superfície da medula espinhal. </li><li> Remover afastadores e puxe a pele para cima em torno da borda do implante. Usando cianoacrilato, aderir a pele para as bordas do implante (Figura 2 M, N). </li><li> Inserir # 0-80 - 1/4 &quot;parafusos de ajuste para as asas da placa superior (Figura 1C e 2 O). </li><li> Usando acrílico dental, selar eventuais lacunas nas fendas dos parafusos da placa superior (Figura 2P). </li></ol> 6. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Remover animais da anestesia e coloque em uma grande gaiola limpa. Certifique-se de que a gaiola é suficientemente grande para que a câmara não senão em nada (tal como o mergulho em forma de V para uma garrafa de água e / ou alimentos) durante o curso de locomoção normal durante toda a gaiola. NOTA: uma gaiola de ratos padrão é ideal. </li><li> Coloque a gaiola sobre uma superfície aquecida, enquanto o animal recupera. Não devolva o mouse para a companhia de outros animais, até que se recuperou totalmente. </li><li> Verifique beha animaisvior dentro de 1-2 pós-operatório hr para os sinais de dor ou angústia e integridade do implante. NOTA: Sob condições normais, o animal deve ser capaz de deambulação com perturbações modestos para movimento. </li><li> Continue a verificar animais cada 8 - 12 horas para a primeira 72 horas, medição de peso e monitorar o comportamento. Verifique se os animais são ativos e móvel durante a noite. Alimento molhado na forma de terra chow misturado com água ou géis nutricionais, pelotas de comida e água potável deve ser fornecida ao nível do solo. Hidratação adicional de injeções subcutâneas ou intraperiotoneal devem ser fornecidos, se necessário. </li><li> Administrar 5 mg / kg cetoprofeno mouse e 0,2 mg / kg por via subcutânea rato dexametasona em 24 e 48 pontos no tempo hr, no pós-operatório. Além disso, 0,005-0,010 mg / 100 g de rato deve ser administrada a cada 8 horas por via subcutânea durante 72 h. </li></ol> 7. imagiologia in vivo <ol><li> Anestesiar um rato sob5% de isoflurano / oxigênio em uma câmara de indução até a taxa de respiração diminui para cerca de 1 respiração / sec. </li><li> Transferência do mouse para o costume stereotax (Figura 1D) com feedback controlado almofada de aquecimento e inserir termômetro retal. Reduzir isoflurano a 2%. </li><li> Administrar glicopirrolato 0,05 mg / 100 g por via intramuscular rato nos membros posteriores usando 29-30 agulhas G e 3/10 cc seringa, proporcionando aproximadamente 50% do volume de injecção por ramo. </li><li> Administrar 1 ml / 100 g de rato 5% de glucose (para hidratação) por via subcutânea em soro fisiológico, uma vez por hora. </li><li> Insira os titulares câmara enfiado no pós-titulares utilizados para a cirurgia (Figura 1F). Ajuste a altura e torcer as mensagens sobre os parafusos de ajuste na placa superior. </li><li> Com ambos os titulares anexado, elevar os titulares nos suportes de pós-até que o peito pode expandir-se livremente sobre a inspiração. NOTA: Tanto o firme apego dos titulares e da livre expansão do significan peitotly reduzir artefatos de movimento devido a respiração. </li><li> Realizar imagem como desejado. </li><li> Quando imaging for concluída, os postos mais baixos, torcer fora titulares de câmara, retire termômetro retal, e lugar do mouse sobre uma superfície aquecida para se recuperar. Não devolva o mouse para a companhia de outros animais, até que se recuperou totalmente. </li></ol>

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<li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081(2013).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).</li>
<li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular%2C+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar e nenhum interesse financeiro conflitante.

A técnica demonstrada aqui permite repetida, time-lapse, in vivo de imagens do mouse dorsal SC para muitas semanas pós operatório sem a necessidade de procedimentos cirúrgicos subsequentes. Este procedimento representa uma melhoria substancial sobre estudos de imagem repita-cirurgia ou sobre abordagens histológicas portmortem, cuja informação sobre a dinâmica celular é perdido. Temos anteriormente 30 demonstraram o valor desta técnica para estudar SCI patologia in vivo. A extensão longitudinal máxima de imagens foi determinada pelo crescimento de um denso tecido fibroso sobre a superfície dorsal do SC. Ao longo do tempo, este crescimento resultou na perda de contraste de imagem e resolução. Este crescimento também tem sido visto em preparações cirúrgicas alternativas 31. Curiosamente, observou-se que este crescimento podem ser minimizados lavando cuidadosamente superfície dorsal SC para remover produtos derivados do sangue, a superfície de vedação deo osso corte com cianoacrilato, bordas da câmara de vedação bem com elastômero de silicone, e minimizando o espaço intersticial entre o SC dorsal e a tampa de vidro. Recentemente, outra abordagem semelhante à nossa própria utilizando uma câmara de policarbonato tem sido demonstrada 32. A utilização de policarbonato é vantajosa uma vez que é compatível com raios-X e modalidades de imagem acústica, que não é o caso para as peças em aço inoxidável. No entanto, com a tecnologia agora ubíqua de impressoras 3D, partes da câmara pode ser fabricada a partir de uma ampla variedade de materiais para atender necessidades específicas. Nós imprimimos recentemente todas as nossas peças em um fotopolímero clara. Uma desvantagem principal de uma câmara fechada, é a incapacidade de administrar dosagens repetidas de drogas exógenas ou corantes adequados para imagiologia de 34 SC. No entanto, por capitalizando sobre a estabilidade mecânica do nosso sistema atual, nós já usou nossa câmara de presente para o sucessoly ancorar um cateter intratecal ligado a uma porta implantada subcutaneamente por injecção, o que permitiu a administração de fármaco em vários pontos de tempo, mesmo num sistema de câmara fechada (trabalho não publicado). Além disso, devido à natureza modular da placa de topo, as futuras versões desta preparação incluirá uma câmara possa ser fechada novamente para permitir a aplicação repetida de ambos os agentes terapêuticos e marcadores fluorescentes. É também possível prever placas de topo é montado com os eléctrodos para a gravação de inserções, ópticos, e as portas para a entrega de drogas. Essas adições provavelmente seria mais difícil aplicar a usar o sistema mais minimalista de Fenrich et al. 31. Em conclusão, a nossa câmara fornece uma plataforma de gateway em que diversos experimentos podem ser baseadas.

Time-lapse em microscopia vivo em organismos intactos permite a visualização direta dos processos biológicos complexos que são inacessíveis para análise de ponto-time única tradicional, tais como imuno-histoquímica. Especificamente, a microscopia multi-fotão (MPM) 1 permite a formação de imagens de tecido de espalhamento, tais como o neocórtex roedor, quando tiver sido alcançado imagiologia até 2,3 e em excesso de 4 de 1 mm. Quando combinado com os preparativos cirúrgicos 5-7 em que um único procedimento permite acesso óptico para o cérebro por semanas a meses, estas abordagens de microscopia foram usados ​​para estudar os processos dinâmicos do cérebro em estados saudáveis ​​e doentes 11/08. Além disso, os protocolos foram desenvolvidos 12,13 que prevêem a imagem in vivo em vigília (ou seja, não anestesiados) animais, permitindo a imagem funcional celular resolução durante ensaios comportamentais. Estes protocolos foram utilizados para comparisons de atividade neuronal correlacionada 14, astrócitos sinalização 15 em animais anestesiados e vigília de cálcio, a identificação de aglomerados neuronais específicos de tarefas 16, bem como a capacidade dos neurônios de discriminar localização objeto sobre suiça de estimulação 17. Dado o potencial desta abordagem para elucidar os mecanismos saudáveis ​​e patológicas, lapso de tempo de imagem in vivo foi aplicado para a medula espinal de rato (SC), permitindo a identificação de degeneração axonal aguda (DAA), um mecanismo 18 de doença. Estudos subsequentes investigados os efeitos de lesões periféricas em gânglios da raiz dorsal (DRG) de regeneração axonal 19, a função dos vasos sanguíneos na regeneração axonal 20, a quimiotaxia de células gliais em resposta ao ferimento 21, a migração de células T em encefalomielite auto-imune experimental (EAE) de 22, a actividade de 23,24 a microglia e astrócitos 25 em resposta a amyotrophesclerose ica lateral (ALS), o papel de STAT-3 em brotamento axonal após a lesão SC (SCI) 26, e um mecanismo de perda axonal e recuperação 27 na EAE. Apesar do sucesso destas abordagens, todos estes estudos foram limitados a qualquer uma sessão de imagem única, limitando assim os estudos de dinâmica de curto prazo, ou então necessário repetir aberturas cirúrgicas do animal em cada ponto de tempo de imagem, o que limita o número de pontos no tempo acessíveis e aumentando a probabilidade de artefatos experimentais de confusão. Protocolos para estas cirurgias foram previamente publicados 28,29. Recentemente, publicamos uma técnica de 30 para a implantação de uma câmara espinhal crônica que permitiu time-lapse imaging MPM no rato SC ao longo de várias semanas sem a necessidade de cirurgias repetidas. Resumidamente, esta preparação cirúrgica incluiu a realização laminectomia na coluna vertebral torácica inferior e a implantação de uma câmara de quatro partes. A câmara incluídatrês peças de aço inoxidável custom-usinadas que apertadas as vértebras em torno do laminectomy, e uma lamela de vidro colocado sobre o SC e presa com elastômero de silicone. Esta técnica permitiu para a imagem latente de rotina a mais de cinco semanas de pós-operatório em estados saudáveis ​​e feridos, sem a necessidade de cirurgias repetidas. O número de pontos de tempo de imagem foi limitada apenas pela frequência a que o animal pode tolerar a indução da anestesia. A visualização foi vida limitado pelo crescimento de um denso tecido fibroso sobre a superfície da SC. Além disso, verificou-se que o implante cirúrgico não teve efeito a longo prazo sobre a função motora. Desde a nossa primeira publicação, abordagens alternativas que permitam também de imagem a longo prazo na SC foram descritos em outro 31-33. Este protocolo demonstra o nosso procedimento para a implantação da câmara de medula desenvolvemos.

<table><tbody><tr><td>Tesoura Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>fórceps, tesoura, bisturi, etc.</td><td>Ferramentas de Belas</td><td>Ciências&nbsp; múltiplas&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kit retrator -fixador magnético</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>kit retrator -retrator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>outros retratores também podem ser usados</td></tr><tr><td>kit retrator -elastômero</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>manta de aquecimento controlada por feedback</td><td>CWE Inc.</td><td>Modelo: TC-1000 Mouse&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Parte nº 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>estereotaxa</td><td></td>, <td>ver Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplemento (online)</td><td></td></tr> <tr><td>câmara</td><td></td> espinhal <td>ver Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplemento (online)</td><td></td></tr> <tr><td>suportes</td><td></td> de câmara espinhal <td>ver Farrar et al, Nat. Metanfetamina, 9, 297, 2012, Suplemento (online)</td><td></td></tr> <tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>múltiplo fornecedores</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (pó acrílico dental)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Parte: 8101</td><td>vários fornecedores</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (líquido acrílico dental)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>vários fornecedores</td></tr><tr><td>Glicopirrolato</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaína</td><td>MWI Suprimento Veterinário</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Cetoprofeno</td><td>MWI Suprimento Veterinário</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>MWI Suprimento Veterinário</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastômero</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Dicas de mistura KwikSil</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

um processo de implantação de uma câmara spinal para longitudinal in vivo criação de imagens do cordão do rato spinal

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Estudos no neocórtex de mamíferos permitiram uma resolução sem precedentes da estrutura cortical, atividade e resposta a insultos neurodegenerativos por imagens repetidas de lapso de tempo in vivo em roedores vivos. Esses estudos foram possíveis graças a procedimentos cirúrgicos simples, que permitiram acesso óptico por um período prolongado de tempo sem repetição de procedimentos cirúrgicos. Em contraste, estudos análogos da medula espinhal foram anteriormente limitados a apenas algumas sessões de imagem, cada uma das quais exigiu uma cirurgia invasiva. Conforme descrito anteriormente, desenvolvemos uma câmara espinhal que permite acesso óptico contínuo por mais de 8 semanas, preserva a estabilidade mecânica da coluna vertebral, é facilmente estabilizada externamente durante a imagem e requer apenas uma única cirurgia. Aqui, o design da câmara espinhal com seus implementos cirúrgicos associados é revisado e o procedimento cirúrgico é demonstrado em detalhes. Resumidamente, este vídeo demonstrará a preparação da área cirúrgica e do camundongo para a cirurgia, exposição da vértebra espinhal e desbridamento adequado do tecido, a entrega do implante e pinçamento vertebral, a conclusão da câmara, a remoção do sistema de entrega, selamento da pele e, finalmente, cuidados pós-operatórios. O procedimento para imagens crônicas in vivo usando microscopia não linear também será demonstrado. Por fim, são discutidos resultados, limitações, variabilidade típica e um guia para solução de problemas.

Seguindo o procedimento anterior, cada fase da cirurgia deve imitar os resultados obtidos em cada estágio da operação delineado na Figura 2. Cuidado especial deve ser feita quando a aplicação do elastómero de silicone para eliminar as bolhas de ar sob o vidro ou, pelo menos, para assegurar que eles são localizado na periferia da área de interesse (Figura 2L). Para um cirurgião com experiência, complicações cirúrgicas que exigem a eutanásia, quer durante a cirurgia ou durante o primeiro 24 horas pós-cirurgia ocorrem em aproximadamente 20% das operações. Estas complicações mais freqüentemente surgem de hemorragia tecido mole excessiva ou falta de fixar firmemente a câmara para a coluna vertebral. Em câmaras implantadas com sucesso, a janela tipicamente permanece opticamente transparente para várias semanas (Figura 3). Apesar dos melhores esforços, um crescimento fibroso opaco,, neoplásicas forma frequentemente dentro de alguns dias, resultando em obscuri parcialng de janela (Figura 3C - F, linha tracejada preta). Estruturas fluorescentes são difíceis de ver usando microscopia 2PEF debaixo deste tecido fibroso. Encontramos uma distribuição bimodal de resultados, com aproximadamente 50% de janelas implantadas com sucesso restante clara durante mais de 5 semanas após a cirurgia, e aproximadamente 50% ofuscado tornando-se dentro de 1 - 3 semanas. Para janelas que ficam claras a maioria dos lugares, dentro da experiência de visualização de janela só um modesto grau de neovascularização em ou acima da dura-máter (Figura 3D - F, asteriscos verde), o que não impede 2PEF imagem. O nosso estudo anterior 30 mostrou um aumento em microglia mas não densidade astrócitos sob a janela e vértebras adjacentes, indicando ligeira inflamação análoga à observada nas preparações de janela cranianos 5. Em ratinhos transgénicos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) em um subconjunto de raiz dorsal GangliA (DRG) neurónios (linha YFPH; Jackson Labs), axónios foram claramente distinguível por semanas no pós-operatório (Figura 4A e b) e, desde que quatro meses de um animal (dados não mostrados). Os vasos sanguíneos (Figura 4A e B) foram feitas visível por retro-orbital injetar fluorescente Texas Red marcado dextrano no plasma sanguíneo. Também microglia foram visualizadas em ratinhos que expressam GFP numa CX3CR1 knock-in rato (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) cruzou a linha YFPH (Figura 4C). Contraste e resolução modestamente deteriorou ao longo do tempo (Figura 4C), devido à formação de um crescimento fibroso excessivo anteriormente descrito 30. Rotineiramente fotografada durante 3 horas em uma única sessão, sem mortalidade e quantas vezes a cada 12 horas. A duração das sessões e freqüência é limitada pela tolerância do animal para indução anestésica, concomitante com as considerações éticas que acompanham a dor e sofrimento para animais de laboratório. &lt; p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "always"&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg"> Figura 1. Um conjunto personalizado cirúrgico facilita a entrega câmara durante a implantação e estabiliza a câmara durante as sessões de imagem subsequentes. Duas barras laterais e uma placa superior (A) são montadas (B) usando pequenos parafusos da coluna vertebral para dentro da câmara (C). A mesa cirúrgica, com mensagens extensíveis (D) permite a entrega e de fixação das barras laterais para as vértebras utilizando pinos de detenção (E). Sessões de imagem subsequentes em vez usar mensagens com rosca interna para anexar à câmara através dos parafusos de ajuste nas asas do implante (F). Painel b desta figura foi modificado a partir Farrar et al., Nature Methods, 30, 2012 com a permissão da Nature Publishing Group.96 / "target =" _ blank "52196fig1large.jpg&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg"> Figura 2. Uma laminectomia dorsal e é realizada uma câmara de imagem crónica é implantado para fornecer acesso óptico para a medula espinal. O processo está descrito em montagem. Em primeiro lugar, a pele (painéis A, B; secções protocolo 3,1-3,4) e músculos (C; 3,5) são retraídos para expor a três vértebras subjacente. O tecido que recobre estes três vértebras é removido (D, E, F; 3,6-3,10) e os processos laterais são raspadas limpo antes de serem fixadas em ambos os lados (G, H; 3,12). Cuidadosamente, a lâmina dorsal da vértebra central é removida, e os bordos do osso selado (I (J; 5.1) e parafusos apertados na posição (K; 5.3) para fixar a câmara antes de a câmara de vedação com elastómero de silicone e vidro de cobertura (L; 5,5). Depois de os pinos de entrega são removidos (M; 5,8), a pele é colada às paredes da câmara (M, N; 5,8) e os parafusos de fixação são inseridos nas asas (S; 5,9). Finalmente, os slots de parafusos são selados com acrílico dental (P; 5.10). E o mouse é colocado em uma gaiola limpa para recuperar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg"> Figura 3. Uma câmara espinhal crônica permanece ov opticamente transparenteser várias semanas. Imagens de luz branca da medula espinal, que vão desde alguns minutos (A) a três semanas após a cirurgia (F). Marcos vasculares são identificáveis ​​em todos os pontos temporais (setas amarelas). Pouca mudança é vista em um dia após a cirurgia (B). Supercrescimento denso fibroso (C - F, delimitada pela linha tracejada no canto inferior direito) está presente em até três dias e resulta em obscurecimento parcial da área de imagem. Neovascularização Mild (D, E, F, asteriscos verdes) também está presente, mas não obscurece a vasculatura original na luz branca ou 2PEF de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg"><pclasse>Figura 4. Uma câmara de medula crónica permite repetido imagem multi-fotão sem a necessidade de cirurgias de repetição. imagiologia repetida de ratinhos transgénicos que expressam YFP em um subconjunto de axónios DRG (verde) em funicular dorsais da medula cabo e vasculatura (vermelho) marcado por injecção intravascular corante (A, B). A atividade da microglia (malva) também pode ser acompanhada ao longo do tempo em Thy1-YFP / CX3CR1-GFP camundongos transgênicos dupla (C). Enquanto axônios e microglia permanecem visíveis, contraste e resolução declínio modestamente ao longo do tempo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </pclasse>

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

O objetivo geral deste procedimento é implantar uma câmara de imagem sobre a medula espinhal dorsal de um camundongo para permitir imagens ópticas longitudinais sem a necessidade de convulsões cirúrgicas repetidas. Isso é feito expondo primeiro três vértebras torácicas e removendo o tecido mole acima da coluna. O segundo passo é pinçar as vértebras expostas usando as peças laterais da câmara e realizar uma laminectomia dorsal.Em seguida, a placa superior da câmara é firmemente presa sobre a medula espinhal exposta e selada com elastômero de silicone e uma tampa de vidro. A etapa final é selar a pele ao redor do implante usando adesivos e permitir que o animal se recupere. Em última análise, a microscopia de fluorescência multifóton é usada para obter imagens do comportamento celular e da estrutura do tecido na medula espinhal com resolução subcelular ao longo do tempo.A principal vantagem de nossa nova metodologia sobre os métodos existentes, como a abertura cirúrgica repetida da medula espinhal, é a capacidade de ter um número quase arbitrário de pontos de tempo de imagem espalhados por um longo período de tempo sem as complicações associadas à cirurgia repetida, como infecção potencial, trauma cirúrgico ou estresse animal. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando estávamos considerando o sucesso anterior da imagem longitudinal após lesão na medula espinhal no peixe-zebra transparente. Decidimos então expandir esse paradigma para o modelo de mamíferos.Comece este procedimento raspando a área do arco torácico de um camundongo anestesiado com isof flúor. Em seguida, remova o cabelo aparado. Em seguida, administre a mistura de solução salina, cetoprofeno e dexametasona ao camundongo por via subcutânea.Usando cotonetes. Realize três lavagens alternadas de iodo e etanol a 70% e aguarde um minuto entre as lavagens. Em seguida, administre 100 microlitros de bupivacaína 0,125% no centro do adesivo raspado por via subcutânea para reduzir a dor no local da incisão.Em seguida, transfira o mouse para os ataques estéreo personalizados. Insira o termômetro retal e aguarde aproximadamente 10 minutos para que a bupivacaína faça efeito ao microscópio. Crie uma incisão de cinco milímetros acima das vértebras de interesse com uma lâmina de bisturi.Depois disso, aumente o tamanho da abertura na pele por dissecção romba. Em seguida, dissocie suavemente a fáscia conjuntiva entre a pele e o músculo subjacente. Segure a pele para trás para uma área de trabalho maior com os afastadores e tome cuidado para não aumentar o peso no peito e obstruir a respiração.Em seguida, segure o rostral, a maior parte da vértebra que será exposta através do músculo sobrejacente com um par de pinças. Corte o tecido em ambos os lados do processo dorsal longe de três vértebras. Em seguida, remova todo o tecido sobrejacente do laminado dorsal.Depois, corte cuidadosamente os tendões presos às vértebras em ambas as bordas laterais da coluna vertebral. Remova suavemente o máximo possível de tecido das bordas laterais da coluna vertebral para fornecer uma superfície de fixação limpa. Em seguida, desbride suavemente as vértebras de qualquer tecido mole restante.Usando um raspador de osso e cotonete, apare qualquer tecido incongruente usando a tesoura cirúrgica. Em seguida, ajuste os afastadores para reter o tecido ao redor da coluna vertebral. Juntamente com a pele, prenda as barras laterais do implante aos pinos nos postes de entrega e coloque-as nos suportes dos postes.Em seguida, prenda as três vértebras. Usando as barras laterais aplicando pressão suficiente para segurá-las com segurança. Em seguida, use a pinça para ajudar a garantir um clampeamento nivelado das três vértebras.Certifique-se de que as barras laterais estejam niveladas e paralelas antes de realizar a laminectomia. Depois disso, limpe e seque cuidadosamente a superfície dorsal das vértebras presas usando cotonetes. Neste procedimento, insira as pontas da tesoura Vana no espaço peridural da vértebra medial presa e aperte levemente as alças.Se o osso estiver seco, ele deve rachar ao longo da lâmina dorsal. Repita este procedimento no lado contralateral para liberar a lâmina enquanto segura a lâmina solta Delicadamente, pelo processo dorsal com uma pinça, corte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo nas extremidades rostral e mimada da lâmina. Em seguida, lave completamente qualquer sangue que recobre a medula espinhal com solução salina a 0,9% ou espinhal cerebral artificial absorva o excesso de líquido com cotonetes.Depois disso, apare as bordas laterais do osso e prossiga para as barras laterais do implante. Em seguida, controlar o sangramento usando cotonetes e soro fisiológico. No caso de uma parte do periósteo ter se desprendido e recoberto pela medula espinhal, remova suavemente o tecido usando cotonetes e uma agulha de calibre 29 a 30.Tenha cuidado para não ferir a medula espinhal e não confunda o periósteo solto com um dator bem enrolado. No final. Sele as bordas expostas restantes do osso com dental, acrílico e cianoacrilato.Tome cuidado especial para evitar que a cola entre na medula espinhal exposta. Agora, posicione a placa superior no animal com cuidado para que as quatro ranhuras se alinhem com os quatro orifícios nas barras laterais e a abertura sobreponha a medula espinhal exposta. Usando uma chave de fenda de joalheiro com cuidado, comece com o primeiro parafuso, estabilizando o eixo da chave de fenda com outro par de pinças.Não aperte o parafuso neste stage, mas insira-o de forma que as primeiras roscas fiquem engatadas. Repita esse processo para os outros três parafusos. Com todos os quatro parafusos no lugar, aperte cada parafuso alternadamente nos mesmos pequenos incrementos até que todos os parafusos estejam firmemente presos.Em seguida, use o elastômero de silicone da marca peitoril rápido para preencher o espaço entre a medula espinhal e a janela de vidro e aplique-o na medula espinhal exposta. Certifique-se de se livrar de qualquer silicone contendo bolhas de ar da ponta de mistura antes de sua aplicação. Em seguida, coloque rapidamente uma lamínula de cinco milímetros na inserção na placa superior.Aplique pressão suficiente para espremer gradualmente o elastômero líquido para envolver a medula espinhal, mas não resultando em compressão da medula espinhal. Depois, cubra as bordas do elastômero exsudado com dental, acrílico e cianoacrilato e use os adesivos para aderir o elastômero ao osso circundante o máximo possível para evitar que o elastômero se desloque sobre a superfície da medula espinhal. Em seguida, remova os afastadores e puxe a pele para cima ao redor da borda do implante.Use o cianoacrilato para aderir a pele às bordas do implante. Depois disso, insira os parafusos nas asas da placa superior. Posteriormente, sele as lacunas nas ranhuras dos parafusos da placa superior usando acrílico dental antes de colocar o animal de volta na gaiola para recuperação.Antes das sessões de imagem, anestesiar novamente o mouse e prender os parafusos expostos do implante aos pinos roscados para estabilização. Esta figura mostra que uma câmara espinhal crônica permanece opticamente transparente por várias semanas. Estas são imagens brancas a claras da medula espinhal que variam de vários minutos a três semanas após a operação.Os marcos vasculares são identificáveis em todos os momentos. Pouca mudança é vista em um dia após a cirurgia. O crescimento fibroso denso está presente em parte da janela já em três dias e resulta em ofuscação parcial da área de imagem.A neovascularização leve também está presente, mas não obscurece a vasculatura original na luz branca ou em duas imagens de PFE. A câmara espinhal crônica permite imagens multifótons repetidas sem a necessidade de cirurgias repetidas. Aqui estão as imagens de um camundongo transgênico expressando YFP em um subconjunto de axônios DRG no fii dorsal da medula espinhal.A vasculatura foi marcada por injeção de corante intravascular mostrada em vermelho. A atividade da microglia também pode ser rastreada ao longo do tempo em camundongos transgênicos duplos da coxa um, YFP, CX, três, CR, um GFP, enquanto os axônios e a microglia permanecem visíveis. O contraste e a resolução diminuem modestamente ao longo do tempo.Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em aproximadamente uma hora se for realizada corretamente Após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para explorarmos a heterogeneidade temporal e espacial da morte do axônio após uma lesão na medula espinhal.E ratos.

a-procedure-for-implanting-spinal-chamber-for-longitudinal-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar...

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

Curta descrição visual da técnica cirúrgica e um dispositivo usado para a entrega de gene (e celular) terapias para a medula espinhal. A técnica é demonstrada no animal, mas é completamente traduzíveis e sendo utilizado para a aplicação em seres humanos.

Técnica cirúrgica para entrega da Medula Espinhal de Terapias: Demonstração de Processo em Göttingen porquinhos

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as...

Implantação de janela da medula espinhal em um camundongo para imagens in vivo

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a encefalomielite autoimune experimental. Essas janelas fornecem acesso óptico crônico à medula espinhal para monitorar a dinâmica celular no nível subcelular em animais vivos usando microscopia de dois fótons.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Apresentamos um protocolo utilizando microscopia de lapso de tempo de excitação de dois fótons para visualizar simultaneamente a dinâmica das lesões de axônio e mielina em tempo real. Este protocolo proposto permite estudos de fatores intrínsecos e extrínsecos que podem influenciar o destino do axônio mielinizado central após a lesão e contribuir para a incapacidade clínica permanente.

Um Ex Vivo Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Doenças desmielinizantes podem ser modeladas em animais por aplicação focal de lisolecitina no SNC. Uma única injeção de lisolecitina na medula espinhal do camundongo produz uma lesão que se repara espontaneamente com o tempo. O objetivo é estudar os fatores envolvidos na desmielinização e remielinização e testar agentes para melhorar o reparo.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Este protocolo descreve a implantação de uma janela de vidro na medula espinal de um rato para facilitar o visualização pela microscopia intravital.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Este protocolo detalha um procedimento cirúrgico para realizar cirurgia da medula espinhal e para implantar e prender uma haste óptica sobre a medula espinhal em roedores.

Implantação de dispositivos optoeletrônicos na medula espinhal de roedores

Este protocolo descreve um sistema de fixação de transdutor de ultrassom projetado especificamente para estimulação de ultrassom da medula espinhal em camundongos acordados. O método emprega um sistema de fixação para garantir o posicionamento preciso do transdutor de ultrassom e, ao mesmo tempo, permitir que os sujeitos experimentais se movam livremente sem comprometer a precisão da estimulação.

Fixação de Transdutores de Ultrassom para Neuromodulação da Medula Espinhal em Camundongos

Aprenda a implantar uma câmara óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de camundongos para imagens longitudinal in vivo. Este método permite estudar dinâmicas celulares sem cirurgias repetidas.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

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