Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada.

O objetivo geral deste procedimento é implantar uma câmara de imagem sobre a medula espinhal dorsal de um camundongo para permitir imagens ópticas longitudinais sem a necessidade de convulsões cirúrgicas repetidas. Isso é feito expondo primeiro três vértebras torácicas e removendo o tecido mole acima da coluna. O segundo passo é pinçar as vértebras expostas usando as peças laterais da câmara e realizar uma laminectomia dorsal.

Em seguida, a placa superior da câmara é firmemente presa sobre a medula espinhal exposta e selada com elastômero de silicone e uma tampa de vidro. A etapa final é selar a pele ao redor do implante usando adesivos e permitir que o animal se recupere. Em última análise, a microscopia de fluorescência multifóton é usada para obter imagens do comportamento celular e da estrutura do tecido na medula espinhal com resolução subcelular ao longo do tempo.

A principal vantagem de nossa nova metodologia sobre os métodos existentes, como a abertura cirúrgica repetida da medula espinhal, é a capacidade de ter um número quase arbitrário de pontos de tempo de imagem espalhados por um longo período de tempo sem as complicações associadas à cirurgia repetida, como infecção potencial, trauma cirúrgico ou estresse animal. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando estávamos considerando o sucesso anterior da imagem longitudinal após lesão na medula espinhal no peixe-zebra transparente. Decidimos então expandir esse paradigma para o modelo de mamíferos.

Comece este procedimento raspando a área do arco torácico de um camundongo anestesiado com isof flúor. Em seguida, remova o cabelo aparado. Em seguida, administre a mistura de solução salina, cetoprofeno e dexametasona ao camundongo por via subcutânea.

Usando cotonetes. Realize três lavagens alternadas de iodo e etanol a 70% e aguarde um minuto entre as lavagens. Em seguida, administre 100 microlitros de bupivacaína 0,125% no centro do adesivo raspado por via subcutânea para reduzir a dor no local da incisão.

Em seguida, transfira o mouse para os ataques estéreo personalizados. Insira o termômetro retal e aguarde aproximadamente 10 minutos para que a bupivacaína faça efeito ao microscópio. Crie uma incisão de cinco milímetros acima das vértebras de interesse com uma lâmina de bisturi.

Depois disso, aumente o tamanho da abertura na pele por dissecção romba. Em seguida, dissocie suavemente a fáscia conjuntiva entre a pele e o músculo subjacente. Segure a pele para trás para uma área de trabalho maior com os afastadores e tome cuidado para não aumentar o peso no peito e obstruir a respiração.

Em seguida, segure o rostral, a maior parte da vértebra que será exposta através do músculo sobrejacente com um par de pinças. Corte o tecido em ambos os lados do processo dorsal longe de três vértebras. Em seguida, remova todo o tecido sobrejacente do laminado dorsal.

Depois, corte cuidadosamente os tendões presos às vértebras em ambas as bordas laterais da coluna vertebral. Remova suavemente o máximo possível de tecido das bordas laterais da coluna vertebral para fornecer uma superfície de fixação limpa. Em seguida, desbride suavemente as vértebras de qualquer tecido mole restante.

Usando um raspador de osso e cotonete, apare qualquer tecido incongruente usando a tesoura cirúrgica. Em seguida, ajuste os afastadores para reter o tecido ao redor da coluna vertebral. Juntamente com a pele, prenda as barras laterais do implante aos pinos nos postes de entrega e coloque-as nos suportes dos postes.

Em seguida, prenda as três vértebras. Usando as barras laterais aplicando pressão suficiente para segurá-las com segurança. Em seguida, use a pinça para ajudar a garantir um clampeamento nivelado das três vértebras.

Certifique-se de que as barras laterais estejam niveladas e paralelas antes de realizar a laminectomia. Depois disso, limpe e seque cuidadosamente a superfície dorsal das vértebras presas usando cotonetes. Neste procedimento, insira as pontas da tesoura Vana no espaço peridural da vértebra medial presa e aperte levemente as alças.

Se o osso estiver seco, ele deve rachar ao longo da lâmina dorsal. Repita este procedimento no lado contralateral para liberar a lâmina enquanto segura a lâmina solta Delicadamente, pelo processo dorsal com uma pinça, corte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo nas extremidades rostral e mimada da lâmina. Em seguida, lave completamente qualquer sangue que recobre a medula espinhal com solução salina a 0,9% ou espinhal cerebral artificial absorva o excesso de líquido com cotonetes.

Depois disso, apare as bordas laterais do osso e prossiga para as barras laterais do implante. Em seguida, controlar o sangramento usando cotonetes e soro fisiológico. No caso de uma parte do periósteo ter se desprendido e recoberto pela medula espinhal, remova suavemente o tecido usando cotonetes e uma agulha de calibre 29 a 30.

Tenha cuidado para não ferir a medula espinhal e não confunda o periósteo solto com um dator bem enrolado. No final. Sele as bordas expostas restantes do osso com dental, acrílico e cianoacrilato.

Tome cuidado especial para evitar que a cola entre na medula espinhal exposta. Agora, posicione a placa superior no animal com cuidado para que as quatro ranhuras se alinhem com os quatro orifícios nas barras laterais e a abertura sobreponha a medula espinhal exposta. Usando uma chave de fenda de joalheiro com cuidado, comece com o primeiro parafuso, estabilizando o eixo da chave de fenda com outro par de pinças.

Não aperte o parafuso neste stage, mas insira-o de forma que as primeiras roscas fiquem engatadas. Repita esse processo para os outros três parafusos. Com todos os quatro parafusos no lugar, aperte cada parafuso alternadamente nos mesmos pequenos incrementos até que todos os parafusos estejam firmemente presos.

Em seguida, use o elastômero de silicone da marca peitoril rápido para preencher o espaço entre a medula espinhal e a janela de vidro e aplique-o na medula espinhal exposta. Certifique-se de se livrar de qualquer silicone contendo bolhas de ar da ponta de mistura antes de sua aplicação. Em seguida, coloque rapidamente uma lamínula de cinco milímetros na inserção na placa superior.

Aplique pressão suficiente para espremer gradualmente o elastômero líquido para envolver a medula espinhal, mas não resultando em compressão da medula espinhal. Depois, cubra as bordas do elastômero exsudado com dental, acrílico e cianoacrilato e use os adesivos para aderir o elastômero ao osso circundante o máximo possível para evitar que o elastômero se desloque sobre a superfície da medula espinhal. Em seguida, remova os afastadores e puxe a pele para cima ao redor da borda do implante.

Use o cianoacrilato para aderir a pele às bordas do implante. Depois disso, insira os parafusos nas asas da placa superior. Posteriormente, sele as lacunas nas ranhuras dos parafusos da placa superior usando acrílico dental antes de colocar o animal de volta na gaiola para recuperação.

Antes das sessões de imagem, anestesiar novamente o mouse e prender os parafusos expostos do implante aos pinos roscados para estabilização. Esta figura mostra que uma câmara espinhal crônica permanece opticamente transparente por várias semanas. Estas são imagens brancas a claras da medula espinhal que variam de vários minutos a três semanas após a operação.

Os marcos vasculares são identificáveis em todos os momentos. Pouca mudança é vista em um dia após a cirurgia. O crescimento fibroso denso está presente em parte da janela já em três dias e resulta em ofuscação parcial da área de imagem.

A neovascularização leve também está presente, mas não obscurece a vasculatura original na luz branca ou em duas imagens de PFE. A câmara espinhal crônica permite imagens multifótons repetidas sem a necessidade de cirurgias repetidas. Aqui estão as imagens de um camundongo transgênico expressando YFP em um subconjunto de axônios DRG no fii dorsal da medula espinhal.

A vasculatura foi marcada por injeção de corante intravascular mostrada em vermelho. A atividade da microglia também pode ser rastreada ao longo do tempo em camundongos transgênicos duplos da coxa um, YFP, CX, três, CR, um GFP, enquanto os axônios e a microglia permanecem visíveis. O contraste e a resolução diminuem modestamente ao longo do tempo.

Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em aproximadamente uma hora se for realizada corretamente Após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para explorarmos a heterogeneidade temporal e espacial da morte do axônio após uma lesão na medula espinhal.

E ratos.