Minimal procedimento cirúrgico invasivo de induzir Infarto do Miocárdio em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é induzir um infarto do miocárdio altamente reprodutível em camundongos com manipulações minimamente invasivas. Isso é obtido por intubação sob um microscópio estéreo para controlar a posição da cânula de intubação durante o procedimento. Na segunda etapa, é feita uma discreta incisão lateral esquerda entre as costelas para abrir a cavidade torácica e facilitar a cicatrização rápida.

A ligadura da artéria coronária descendente esquerda é então colocada de acordo com a manipulação apropriada a jusante. Em última análise, o tamanho e a forma do infarto podem ser avaliados por análise imuno-histomorfométrica padrão. As principais vantagens desta técnica dos métodos existentes são que é minimamente invasiva, altamente reprodutível e de fácil execução, permitindo que pesquisadores com experiência mínima com um método possam aplicá-la em modelos de pequenos animais.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o tamanho do coração do camundongo requer alta precisão de manipulação. Durante a microcirurgia. Comece colocando um macho anestesiado de oito a 10 semanas de idade, C 57 BL seis camundongos do tipo selvagem na posição supina em uma mesa de cirurgia aquecida.

Depois de confirmar o nível adequado de sedação por pinça do dedo do pé, aplique pomada para os olhos no animal e use uma pequena navalha para remover os pelos da área ventral do pescoço e a metade esquerda do tórax desinfete a pele com etanol 70% e derme de ninhada. Em seguida, faça uma pequena incisão mediana de 0,5 centímetro no centro do pescoço. Uma vez sob a pele, passe um par de pinças curvas estéreis pelos dois corpos gordurosos para facilitar a visualização da traqueia através do músculo de cobertura.

Com um microscópio estereoscópico, introduza a cânula de intubação por via oral na traqueia. A cânula deve ser observada através do tecido transparente. Depois de confirmar a colocação adequada do instrumento, conecte a cânula ao ventilador de pequenos animais e ajuste as configurações de ventilação para um volume corrente entre 100 e 150 microlitros e uma frequência respiratória entre 100 e 150 aspirações por minuto para induzir um infarto do miocárdio.

Em seguida, faça uma incisão com menos de 0,5 centímetros de comprimento na pele entre o processo xifóide e o Xi esquerdo.Em seguida, usando uma pinça, separe a camada muscular das costelas subjacentes para um infarto crônico. Faça uma incisão no quinto espaço intercostal para um modelo de isquemia e reperfusão. Faça a incisão no quarto espaço intercostal.

Em seguida, coloque afastadores na incisão para abrir a cavidade torácica e visualizar o coração. Em seguida, remova cuidadosamente o pericárdio para evitar processos fibróticos excessivos e visualize a artéria coronária descendente esquerda como o vaso vermelho claro profundamente posicionado. Para o modelo de infarto crônico, coloque uma ligadura no meio do lado ventral do coração entre o oráculo e o ápice usando a artéria coronária descendente esquerda como referência.

Em seguida, para obter o infarto transmural anterior e posterior, use uma sutura de seda zero sete para ligar os dois ramos da artéria. Para o modelo de isquemia e reperfusão, colocar a ligadura sob o oráculo e sobre um tubo de silicone e o corpo principal da artéria coronária descendente esquerda. Durante o período de isquemia, coloque suturas temporais nas costelas, umedecendo as suturas com uma compressa para evitar o ressecamento do tecido.

Em seguida, após a isquemia, remova o tubo de silicone e corte a sutura com uma pequena tesoura para visualizar a reperfusão. Após induzir o infarto, encha o tórax com solução salina isotônica quente para eliminar o ar residual. Em seguida, feche o tórax com 3 0 6 suturas, posicionando as suturas mediais em um ângulo de 90 graus para garantir um fechamento selado das costelas.

Feche a camada muscular com duas suturas, seguidas de fechamento da pele com três a quatro suturas, conforme necessário. Em seguida, desconecte a cânula de intubação do ventilador para permitir a marcação espontânea da respiração do camundongo para posterior identificação e coloque o animal sob uma lâmpada vermelha até que ele acorde. Para analisar os dados de infarto do miocárdio, monitore regularmente a fração de ejeção, o encurtamento fracionário, o débito cardíaco e as dimensões cardíacas por ecocardio.

No ponto final do experimento, abra a cavidade torácica e excise o coração. Coloque o lenço de papel em PBS estéril para lavagem extensiva. Então, uma vez que todo o sangue tenha sido removido, pare o coração em diástole com uma solução saturada de cloreto de potássio e fixe o tecido em 10% de formalina durante a noite.

Incorpore a seção fina do tecido cardíaco em parafina, posicionando a ponta do coração na parte inferior do bloco de montagem para permitir a secção transversal do tecido. Em seguida, colete 20 seções seriais de cinco mícrons, descartando os próximos 300 mícrons. Continue a coletar seções de 25 mícrons a cada 300 mícrons até que o nível da válvula mitral seja atingido.

Em seguida, use a coloração de uma etapa de Mori para medir o tamanho do infarto do tecido para realizar a coloração TTC. Reconstrua a ligadura e use uma cânula aórtica para perfundir o coração com 200 microlitros de solução azul de Evans a 1% e congele o coração em um pequeno saco plástico a 20 graus Celsius negativos sem lavar. Após duas horas, use um bisturi afiado para colher cinco seções transversais do tecido e incube as seções por 10 a 15 minutos.

Em solução TTC a 37 graus Celsius de acordo com as instruções do fabricante. Após mais 10 minutos de fixação em formalina a 10%, transfira as seções para lâminas de microscópio de vidro. Para análise histológica.

Dependendo do modelo usado, o tamanho do infarto será diferente. O modelo de infarto crônico induz um infarto transmural circular do ápice, enquanto o modelo de isquemia reperfusão induz uma parede média fina em todo o coração. Para analisar o efeito direto do infarto na viabilidade cardíaca, a coloração TTC com azul de Evans pode ser usada para revelar o miocárdio saudável não afetado pela isquemia em azul, o miocárdio viável de risco dentro da área isquêmica em vermelho e o tecido morto em branco.

Normalmente, o tamanho do infarto é expresso como uma porcentagem da área de risco para os maoris. A coloração em uma etapa permite a medição da cicatriz madura resultante do processo de remodelação com as áreas ventriculares saudáveis infartadas e vermelhas analisadas na primeira seção de cada nível do tecido cardíaco adquirido antes da valva mitral. O infarto de todos os cortes é então expresso como uma porcentagem do volume total do ventrículo esquerdo.

Procedimentos convencionais de coloração também podem ser realizados, por exemplo, nessas imagens. A coloração para CD 31 e actina de músculo liso foi usada para revelar a presença de angiogênese e miofibroblastos no tecido infartado, respectivamente. Use coloração fluorescente dupla para identificar as diferentes moléculas-alvo na área do infarto, pois nenhuma autofluorescência é observada na ausência de cardiomiócitos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 25, 30 minutos se for executada corretamente. O controle suficiente da dor é necessário para garantir alta reprodutibilidade Após este procedimento. Outras análises funcionais podem ser realizadas, como medições intraventriculares, de pressão, ultrassom ou pulmão cardíaco isolado.

Fim da perfusão.