Name: FIM Imaging and FIMtrack: Duas novas ferramentas que permitam de alta capacidade e Análise de Custo Efetivo Locomotion (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a rastrear a locomoção de larvas de Drosophila melanogaster usando o sistema FIM e o software FIMTrack. Esta técnica de imagem de alta contraste permite análise comportamental de alto rendimento em condições de movimento livre.

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Somos gratos a S. Tomé, que deu início a este projeto, J. Hermann e U. Burgbacher para ajudar na construção da instalação FIM. Este trabalho foi financiado pelo DFG (SFB 629 B6).

NOTA: Aqui, o uso de FIM é apresentado para análise de alto rendimento útil de locomoção larval para a seleção em condições de movimento livre e sob a influência de um estímulo de calor. Outras aplicações, tais como análise de estímulos olfativos locomoção dependente ou de imagem de alta resolução de comportamentos de rolamento ou outros pode precisar de mudanças sutis no protocolo, que são fornecidos mediante solicitação. 1. Set-up de Experimentos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Use cerca de 100 larvas por genótipo no total (tempo de 1 hora obrigatório) para obter valores estatisticamente significativos. NOTA: No caso de diversos genótipos devem ser avaliados e comparados em diferentes dias, gravar o mesmo número de larvas por genótipo por dia. </li><li> Para a maioria das aplicações, recorde em 10 Hz para a análise de parâmetros. Para aplicações de imagem de alta resolução, variar a velocidade de imagem, se necessário. </li><li> Para acompanhamento de larvas de terceiro instar, conduzir experimentos cerca de 120 horas após a postura dos ovos. Faça sure que as culturas produzem larvas suficiente no período experimental (ver 4.3). </li><li> Para aplicações não-estímulo, preparar uma superfície rastejando contendo ágar translúcido (ver secção 2). Para conter larvas na faixa de estímulo para aplicação gradiente térmico, cercam o campo de visão com uma barreira aversivo agar sal (ver secção 3). Nota: Outras aplicações podem exigir diferentes superfícies. </li><li> Certifique-se de usar uma sala com condições constantes ambientais (temperatura, luz, fluxo de ar, umidade do ar, etc.). </li></ol> 2. Crawling Preparação de Superfície (Translucent Agar) NOTA: Na configuração FIM uma superfície de agar é adicionado para proporcionar uma superfície de crawling úmido. Além disso, também melhora as propriedades de iluminação. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ferva 0,8% agar grau alimentício em água ultrapura deionizada. Para a aplicação de triagem preparar 400 ml. </li><li> Despeje agar a 50 ° C (à mão quente) em uma separada 33 centímetros x 33 centímetros acplaca rylic de vidro. A tensão da superfície do agar e, portanto, a temperatura irá definir a espessura da placa de agar. A 50 ° C, são obtidas placas de agar de 2 mm de espessura. Não agite depois de ferver e despeje constantemente para evitar bolhas. Prepare placas de ágar fresco para cada período de imagem de cerca de 4 horas. </li><li> Preencha padrão pratos seis centímetros de Petri com a solução de agar restantes 0,8% para classificar, limpo e habituar as larvas antes do experimento (1 prato por genótipo). </li><li> Caso seja necessária uma barreira agar aversivo para o aplicativo, vá para a seção 3. </li><li> Apare cerca de 2 cm do perímetro da placa de ágar para obter uma superfície quadrada plano para gravação. Remover o excesso de ágar. NOTA: O tamanho é dependente da aplicação. </li><li> Transferir a placa de agar para a configuração FIM directamente após arrefecimento, empurrando suavemente o agar de deslizamento ao longo do bordo da placa de vidro acrílico. </li></ol> 3. Opcional: Adicionando um aversivo Agar Barrier ao Crawling Superfície (Salt Agar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ferva 2,5% agar de qualidade alimentar com 3 M NaCl em água ultrapura deionizada. Para o rastreio em um gradiente térmico preparar 200 ml. NOTA: O volume depende da aplicação. </li><li> Cortar um entalhe de 2 cm de largura na superfície previamente vertida rastejando em torno do campo de visão (22 x 22 cm). NOTA: Os formulários de barreira diferentes e campos de visão pode ser necessária, dependendo da aplicação. </li><li> Encha o entalhe com agar sal 0,1-0,3 cm maior do que a superfície de rastreamento. </li></ol> 4. Fly Handling <ol style="margin-left: 40px;"><li> Voa traseira em 25 ° C incubadora com luz de 12 h / ciclo escuro ajustado para o tempo do experimento em alimentos fly padrão a 65% de umidade do ar. </li><li> Para cruzes, anestesiar 30 moscas fêmeas virgens e 8 machos com CO 2 e cruze-os em 130 frascos de cultura ml com 35 ml de alimentos. NOTA: Um frasco de 130 ml de cultura com 35 ml de alimentos vai render cerca de 20-30 lComeram larvas de terceira instar de dentro do espaço de imagem de 4 h. Imagem e rastreamento de obras para todas as fases estádio larval. </li><li> Largar um pouco de água em frascos de cultura de conduzir final do terceiro instar movimento larval e recolher o maior larvas das paredes frasco utilizando um pequeno pincel. </li><li> 2-5 minutos antes da gravação, larvas de transferência para um vídeo para uma placa de Petri contendo 0,8% de agar de grau alimentar em água ultrapura desionizada que se habituem e limpá-los. </li></ol> 5. Ajustar o Setup FIM Imaging para Recordings (não Estímulo Condições) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ajuste o foco da lente da câmera e da abertura, se necessário. Defina o tempo de exposição para a respectiva câmara. NOTA: Essas configurações não precisam ser alteradas durante um experimento. </li><li> Ajuste a intensidade de iluminação para obter um bom contraste criando uma imagem larva. </li><li> Mantenha as condições ambientais em constante quarto durante as gravações. Escurecer o quarto para não perturbar as larvas com luz direcional. </li></ol> 6. Opcional: Ajustando o Setup FIM Imaging para Recordings (Temperatura Gradual estímulo Condições) NOTA: O dispositivo gradiente térmico é uma cm 3 placa de alumínio de 42 x 42 x 0,2 com uma pintura em preto fosco e material de isolamento na parte superior do site. A placa é perfundido com água a partir de dois circuitos diferentes ligados a calorifiers / refrigeradores e bombas em ambas as extremidades (ver Figura 1B). As temperaturas podem ser reguladas de -5 a 50 ° C. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ligue o gradiente térmico dispositivo 1 hora antes das experiências e colocá-lo acima da configuração para permitir o estabelecimento do perfil temperatura desejada e componentes para equilibrar. </li><li> Transfira o agar superfície rastejando com uma barreira de sal para a configuração. </li><li> Colocar a placa do radiador sobre o agar e ajustar o espaçamento entre a placa e a superfície de rastreamento a 2 mm (~ 1 mm acima larvas). </li><li> Estabelecer um gradiente linear depelo menos 0,8 ° C / cm a partir de 34 ° C (aprox. 2 cm da barreira no campo de visão) a 18 ° C (aprox. 2 cm da barreira no local oposto do campo de vista), ajustando o temperatura dos circuitos de água para 1 ° C e 45 ° C. Nota: diferentes propriedades do gradiente da placa de metal requerem temperaturas diferentes que precisam ser verificada empiricamente. Essas configurações não precisam ser alteradas durante os experimentos. </li><li> Ajuste as definições conforme descrito no capítulo 5. </li><li> Permitir que a superfície rastejando para equilibrar no gradiente antes de experimentos para 20 min. Teste o gradiente de temperatura com um pirômetro. </li><li> Prossiga com a secção 8. </li></ol> 7. Criação de Imagens FIM (não Stimulus Condições) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Use um pincel pequeno molhado para reunir suavemente 15 larvas dos habituação placas de petri e transferi-los para o centro da superfície de rastreamento. Não transferir restos de comida ou muitoágua (ver 7.8). </li><li> Grave 1-50 larvas em uma área de 22 centímetros x 22 centímetros de rastreamento. Use 15 animais por vídeo para a maioria das aplicações de seleção (por razões estatísticas usar pelo menos 100 indivíduos por genótipo). </li><li> Delicadamente separar larvas e esperar por cerca de 10-20 segundos até que todas as larvas começou a se mover em linha reta antes da gravação. </li><li> Grave locomoção larval durante 2 minutos a 10 quadros por segundo para condições não estímulo. Use imagens tif descompactados como formato de saída. </li><li> Durante a gravação, coleta de larvas para o próximo vídeo a partir de frascos de habituar-los Crítica:. Não perturbe larvas gravado com luz. </li><li> Após a gravação, remover as larvas com um pincel grande e descartá-las de acordo com as normas de segurança e legislação local. </li><li> Depois de retirar as larvas, use o pincel para limpar e hidratar a superfície crawling com água ultra pura deionizada. </li><li> Crítica: Mantenha a superfície úmida em todos os momentos, mas evitar mo excessivoisture, que pode ser visto como halos ou gotas vizinhas larvas em gravações e perturbar tracking. </li></ol> 8. Opcional: Imagem FIM (Temperatura Gradual estímulo Condições) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Depois que o gradiente de temperatura é estabelecido (ver secção 6), preparar o software de gravação para gravar dentro de 20 seg instantânea depois de colocar as larvas na superfície do crawling (ver 8.2), por exemplo, definir o número de quadros por vídeo e definir o caminho de salvação. </li><li> Levantar a placa de radiador ligeiramente e colocar as larvas aos 33 ° C a 2 cm da barreira salina. Consulte a 6. e 7. Para obter mais instruções gerais. Abaixe a placa radiador novamente e começar a gravar para 3-4 min diretamente após larvas começou a se mover em linha reta. </li><li> Após a gravação, remover larvas diretamente, limpar e hidratar a superfície. Não toque no agar sal para evitar a propagação de NaCl. </li><li> Crítica: Mantenha a superfície úmida em todos os momentos, mas evitehumidade excessiva, o que pode ser visto como halos ou gotas larvas vizinhas em gravações e perturbar rastreamento. </li><li> Permitir que a superfície do ágar para equilibrar novamente depois de hidratação para 1-2 min, ao salvar imagens e coleta de novos animais antes de preparar para o próximo vídeo. Controlar o gradiente de temperatura usando um pirómetro cada 5 vídeos e ajustar a temperatura do dispositivo, se necessário (a temperatura da água, altura e orientação xy em relação à superfície de rastreamento). </li></ol> 9. Acompanhamento de larval Locomotion NOTA: Para obter mais detalhes, consulte o manual em anexo para FIMTrack (suplemento). Para um fluxograma programa consulte a Figura 2. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ajustar os parâmetros de rastreamento para as respectivas experiências usando a opção de visualização. <ol><li> Ajuste pixel por cm de acordo com câmera e campo de visão. </li><li> Ajuste frames por segundo com base nas configurações da câmera. </li><li> Ajuste limiares brilho para them todos os animais são detectados corretamente (feedback é dado na pré-visualização). </li><li> Ajuste limiares de área de larvas. Note-se a opção de feedback na visualização: animais individuais são destacados em amarelo, colidindo larvas são destacadas em vermelho ea área de cada animal é dada em azul. </li></ol></li><li> Iniciar o acompanhamento utilizando o botão no canto inferior direito. NOTA: Depois de rastreamento bem sucedido, uma imagem com faixas de larvas e um arquivo CSV que contém as características de locomoção e postura calculados é armazenado no diretório de imagens. </li><li> Use o módulo visualizador Resultados da FIM (Editar&gt; Resultados de Visualizador ...) para rever e ajustar manualmente os resultados de rastreamento. Se for necessário, definem regiões de estímulo para avaliar os dados em relação ao regime de estímulo por exemplo, rastejando orientação em relação ao gradiente térmico ou a distância de uma fonte de odor. Para uma descrição mais detalhada, por favor use o manual (suplemento). </li></ol> 10. Avaliação dos Dados <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importe o arquivo CSV em Excel, Matlab ou qualquer outro programa para posterior análise estatística. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Em neurociência comportamental é obrigatório para decifrar quantitativamente traços comportamentais complexas. Procedimentos Assim, um grande número de indivíduos devem ser observadas em alta resolução e automatizados são necessários para a análise estatística. Aqui, a imagem latente FIM é descrito, um romance, configuração simples e robusta de imagem, que fornece os meios para acompanhar a locomoção de uma grande variedade de animais. A eficácia da estrutura de imagem MIF foi testado utilizando larvas de Drosophila, e vermes chatos planarian C. vermes elegans. A tecnologia FIM fornece intrinsecamente elevado contraste para detectar mesmo as estruturas internas de animais, tais como o cérebro, traqueia, o intestino ou o proventrículos. É importante notar que estas estruturas internas forem rigorosamente identificado de modo que eles podem servir para identificar automaticamente a orientação do animal 19. A qualidade dos filmes pode ser influenciada por uma quantidade excessiva de água na superfície do rastreamento. Assim, é críticocontrolar a humidade do agar. Água agar ou muito velho demais na superfície pode causar artefatos. Da mesma forma, garantir que não há bolhas de ar estão incluídas na superfície de rastreamento. Em geral, uma superfície de agar bem preparados permite a gravação de filmes durante 4 h. Devido aos princípios físicos subjacentes imaging FIM gera quase ruído gravações de imagens gratuitos, resultando em uma excelente qualidade de imagem. Este, por sua vez facilita a posterior análise de imagem baseada em computador e permite alto rendimento. No entanto, a metodologia é restrita a analisar animais que contactam directamente a superfície do ágar. O software de rastreamento é desafiado por animais que formam uma forma de donut. Apesar de um indicador binário reconhece a forma de rosca, uma espinha errado pode ser calculado. Devido à construção modular da tabela de controle dual e triple imagens a cores está ao alcance. Além disso, outros estímulos (luz, Fragrância, estímulos elétricos ou mecânicos), pode facilmente ser delivered a partir de cima. O programa FIMTrack projetado para combinar o poder da imagem FIM podem ser facilmente adotadas para controlar larvas de Drosophila, C. elegans ou planárias. Assim, e devido à sua construção simples e barata (ver http://FIM.uni-muenster.de), imagiologia FIM é viável para uma grande variedade de aplicações biomédicas e, em particular, permite urgentemente necessários estudos de alta produtividade.

A maioria dos animais têm a capacidade de se mover de uma maneira altamente controlada e sofisticado. Para decifrar a base genética subjacente controle de locomoção é obrigatório para avaliar quantitativamente diferentes padrões comportamentais. A este respeito, Drosophila pode servir como um modelo ideal. Rastreamento de voar livremente Drosophila é tentadora 1-4, mas o rastreamento de larvas de Drosophila ocorre em duas dimensões em velocidade relativamente baixa e pode, assim, ser monitorada facilmente. Setups baseado em câmera combinadas com uma iluminação adequada são usados ​​para adquirir imagens 5. Ambos incidente ou luz transmitida é empregado em experimentos comportamentais 6,7. No entanto, devido ao corpo semi-translúcido das larvas e possíveis reflexos de luz do rastejando superfície fiel registro dos movimentos larval pode ser um desafio. Para superar esses problemas, alguns métodos complexos foram criadas. Recentemente, iluminação de campo escuro foi introduzido para aumentar o primeiro plano / fundo contrast 8. Como uma alternativa à gravação à base da câmara, imagiologia óptica da lente e menos de sensor de imagem inferior-on-chip técnicas de aquisição ter sido introduzida 9-11. Vários programas de monitoramento foram introduzidos recentemente, incluindo o software de 12 e personalizadas soluções disponíveis no mercado. Exemplos de programas de rastreamento de alto rendimento são o Rastreador Worm multi (MWT) 13 e Multianimal marcha e Track (Magat) 8. Ambos têm em comum, que vários animais podem ser rastreados em uma única arena de campo aberto para que os animais que colidem levar a várias novas identidades animais. Para superar essa limitação, uma configuração multi-bem foi introduzido separando 12 animais em poços individuais 14. A quantificação precisa de locomoção dos indivíduos isolados pode ser conseguido usando uma fase móvel de seguimento em combinação com um microscópio 15. No entanto, todas estas abordagens são ineficientes, quer custo, falta de re suficientesolução ou muito demorado em alta fenotipagem rendimento. Para superar as limitações acima referidas, temos desenvolvido FIM (Método de imagem baseado no FTIR) baseado em reflexão interna total frustrada (FTIR) 16 (Figura 1). Esta nova abordagem de imagem fornece uma alto contraste sem precedentes e até mesmo permite a gravação multi-color de bichos rastejantes, 16. O princípio subjacente a este método prático e eficaz é fácil. Uma placa de vidro acrílico é inundado de luz (por exemplo, 875 nm infravermelho). Devido a diferentes índices de refracção de vidro acrílico e ar, a luz é totalmente reflectida no limite de vidro / ar. Sem aquecimento do vidro acrílico é anotado 16. Só no caso de objetos com maior índice de refração tocar a mesa inundado de luz, pode acender inserir esses objetos. Se os animais toque na superfície, a luz é reflectida e podem ser capturados a partir de baixo (Figura 1). Em consequência, só o contactoárea dos animais aparece como um ponto brilhante, que permite imagens detalhadas com um fundo preto global. Assim, FIM-imaging permite gravar filmes perfeitos para algoritmos de visão computacional. O uso simples e robusto de FIM agora traz análise de alto rendimento detalhada do comportamento animal complexo em alcance e pode ser usado para o estudo do processamento de informação: por exemplo, o olfato 8, 16; visão 17 ou thermosensation 18. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650"> Figura 1. Configuração FIM com a integração de calor de estímulo e os princípios físicos subjacentes. (A) A configuração FIM. Intensidade de iluminação pode ser regulado no painel frontal. (B) para entregar um estímulo térmico, um pintado de preto placa de alumínio, perfundidos com água quente e fria em ambos os lados, é colocado 2 mm acima da superfície do ágar queem si é de 2 mm de espessura. O gradiente é estabelecida na placa radiador de calor e o agar pelas diferenças de temperatura (C) O princípio físico da reflexão interna total frustrada:. Uma placa de vidro acrílico é iluminado por luz infravermelha. θ 1, θ 2 e θ 3 indicam os ângulos de reflexão de luz. n A, n 1, n 2 e n 3 denotar os índices de refracção do ar, vidro acrílico, o agar e a larva respectivamente e cumprir a desigualdade n A &lt;1 n &lt;n2 &lt;n3. Devido à refração, o ângulo de reflexão muda durante a transição. Se o ângulo é inferior ao ângulo crítico, a luz não é mais refletida, pode passar através das camadas e pode ser capturado a partir de baixo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A spectrum de processos que podem ser analisadas por FIM é ampla. Sem quaisquer outros ajustes, a imagem latente FIM pode ser usado para monitorar todos os estágios larvais de Drosophila (Figura 5B) ou pode ser usado para acompanhar os pés-impressões de adulto Drosophila 19. Da mesma forma, as trajetórias de C. elegans ou o movimento de vermes chatos planarian pode ser facilmente registada (Figura 5C). Mesmo a análise dos fungos hypha ou raiz do cabelo crescimento parece viável 19. Em nossa configuração atual FIM, 4 x 16 diodos emissores de luz infravermelha (IR- LEDs) são integrados em um cm 2 placa de vidro acrílico 32 x 32, chamada de tabela de rastreamento (Figura 1). A intensidade do IR-LED é ajustada em função do peso dos objectos na mesa de acompanhamento, os quais podem ser facilmente realizados por um micro controlador do circuito da via modulação de largura de impulso (PWM). FIM produz imagens muito alto contraste em uma ampla gama de intensidades de iluminação. Importante, generados resultados excelentes a já baixa irridation infravermelho geral. Uma câmera com um filtro infravermelho é colocado abaixo da tabela de rastreamento, que permite a integração de estímulos adicionais para a instalação. Estímulos de calor pode ser facilmente aplicado por uma chapa de radiador de calor e estímulos luminosos são aplicados por um projector LCD. Também odorants pode estar contido em gradientes por tampas simples 8. Para as experiências de gradiente de calor, a placa do radiador de calor é submetido a perfusão com água quente e fria sobre ambos os lados, respectivamente, e colocado de 2 mm acima do larvas (Figura 1B). A geração de alto contraste, filmes de alta qualidade abre a possibilidade para sofisticado baseado em computador de análise de imagem, portanto, foi implantado o software FIMTrack para extrair um grande conjunto de recursos a partir de imagens (Figura 2). Primeiros seis características primárias foram definidas a partir do contorno do animal (Figura 3A). Esses recursos fornecem a linha de basepara posterior cálculo de seis características secundárias que descrevem a forma de animais e a sua posição em certos estímulos num dado ponto de tempo (Figura 3B). Atualmente, nove características terciárias são calculados que estão integrando aspectos temporais e, portanto, caracterizar a locomoção do animal, juntamente com as características primárias e secundárias (Figura 3C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650"> Figura 2. Visão FIMTrack, workflow algorítmica e representação larval. (A) Como usar FIMTrack. As imagens são carregadas. Limiar Gray e limiares de larvas que definem único larvas deve ser definido. A área de larvas devem ser apresentados em [-tamanho min, de tamanho max]. Rastreamento é iniciado pelo botão realçado. Workflow (B) Rastreamento. Após o botão de partida é clicado, a imagem de fundo é calculated (intensidades mínimas ao longo do tempo). Enquanto existem quadros à esquerda, as larvas são segmentados com base no limiar de cinzento e o limite máximo de mineração e de tamanho. Para todas as segmentações as representações de larvas são calculadas (compare a (C)). Cada novo modelo está associado a uma determinada trajectória, se uma faixa válida está disponível. Se o último quadro for atingido, a finalizar o processamento pós é feito seguindo-se a geração de saída. (C) representação larval. O animal é constituído por uma cabeça e uma cauda ponto (h e t). Entre esses pontos um número ímpar arbitrário de pontos da coluna s i pode ser definido com um raio r i. Além disso, o centro de massa m e o corpo principal de flexão γ ângulo são calculados. Vários parâmetros de movimento relacionados são esboçados por linhas roxas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3. Características calculados pelo FIMTrack. (A) recursos primários com base no contorno dos animais. (B) Características secundárias, com base em recursos primários. (C) características terciárias, com base em recursos primários em quadros consecutivos e insumos adicionais <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Configuração do FIM</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td><td>detalhes para construção ou compra de configurações estão disponíveis mediante solicitação</td></tr><tr><td>Placa de vidro acrílico</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td><td>Adicional para despejo de ágar</td></tr><tr><td>Placa de radiador de calor</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td><td>Placa de alumínio (pintura em preto fosco) perfusável em locais opostos com montagem ajustável</td></tr><tr><td>Bombas e mangueiras de calorificador de água/resfriamento</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td><td>baseado na GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) e Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td></tr><tr><td>Câmera padrão (4 MP)</td><td>Basler</td><td>acA2040-25gm</td><td>Câmera usada por padrão para a configuração FIM</td></tr><tr><td>Câmera de teste (1.4 MP)</td><td>QImaging</td><td>&nbsp; 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td><td>Câmera usada para comparação</td></tr><tr><td>Câmera de Teste (0.8 MP)</td><td>Point Grey</td><td>Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)Câmera</td> <td>usada para comparação</td></tr><tr><td>Câmera de Teste (0.3 MP)</td><td>Câmera</td><td>Sony PS Eye USB2.0</td><td>Câmera usada para comparação</td></tr><tr><td>Computador</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td></td><td>equipado com pelo menos processador Intel i5 ou melhor, 16 GB de RAM e espaço de armazenamento suficiente no HDD [>1TB]</td></tr><tr><td>Padrão Fly food</td><td>Custom&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos padrão para moscas 135 ml</td><td>Sarstedt AG& Co, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>78.895</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 9 cm</td><td>Sarstedt AG& Co, N&uuml; mbrecht, Alemanha</td><td>821.473</td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada ultrapura</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha</td><td>Synergy&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Ágar de qualidade alimentar</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemanha</td><td>A0917,5000</td><td></td></tr><tr><td>Pincel (pequeno e grande)</td><td>Milan</td><td>Aquarell 310 Tamanho 0 e 2</td><td></td></tr><tr><td>Pirômetro</td><td>Trotec</td><td>BP20</td><td></td></tr></tbody></table>

fim imaging and fimtrack: duas novas ferramentas que permitam de alta capacidade e análise de custo efetivo locomotion

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

A análise da função rede neuronal requer uma medição confiável de traços comportamentais. Uma vez que o comportamento dos animais que se deslocam livremente é variável até um certo grau, muitos animais têm de ser analisados, para se obter dados estatisticamente significativos. Este, por sua vez, exige um computador assistida quantificação automática de padrões de locomoção. Para obter imagens de alto contraste de objetos que se movem quase translúcidas e pequenos, foi desenvolvida uma nova técnica de imagem baseada na reflexão interna total frustrada chamado FIM. Nesta configuração, os animais são apenas iluminado com luz infravermelha na posição muito específica de contato com a superfície crawling subjacente. Esta metodologia resulta em imagens de contraste muito alto. Posteriormente, estas imagens de alto contraste são processados ​​usando algoritmos de rastreamento de contorno estabelecidas. Com base nisto, foi desenvolvido o software FIMTrack, que serve para extrair uma série de recursos necessários para descrever, quantitativamente uma grande variedade de locomoçãocaracterísticas. Durante o desenvolvimento deste pacote de software, nós nos concentramos nossos esforços em uma arquitetura de código aberto que permite a fácil adição de novos módulos. O programa funciona independente de plataforma e é acompanhada por uma interface gráfica intuitiva guiando o usuário através de análise de dados. Todos os valores de parâmetros de locomoção são dadas em forma de arquivos CSV que permitam uma maior análise dos dados. Além disso, um visualizador de resultados integrados no software de rastreamento fornece a oportunidade de rever de forma interativa e ajustar a saída, pois pode ser necessária durante a integração de estímulo. O poder de FIM e FIMTrack é demonstrada pelo estudo da locomoção de larvas de Drosophila.

Para geração de imagens de várias câmeras diferentes, com diferentes propriedades de resolução foram testadas (Figura 4). Todas as câmeras onde equipados com um filtro IR adequado. De acordo com a baixa resolução da câmara de preço mais baixo neste teste, o campo de visão é limitado a 10 cm x 10 cm. Os melhores resultados foram obtidos usando uma câmera de 4 megapixels (MP). Isto conduz a uma resolução de 100 pixels por comprimento das larvas de terceiro instar e permitiu reconhecer facilmente estruturas internas. Além disso, o peristaltismo do animal pode ser facilmente extraída (Figura 4A). No entanto, ainda se pode obter filmes de alto contraste usando câmeras menos caras, que também podem ser analisadas por FIMTrack. Usando uma câmera de 1.4 MP com uma profundidade de 8 bits e uma resolução de 1392 x 1040 pixels é de cerca de metade do preço e permite uma resolução de 45 pixels por terceiro instar larval comprimento no campo de visão. A cabeça, mas não há outras estruturas internas podem ser reconhecidas (Figura 4B). Seguimento e detecção do peristaltismo é possível, mas a precisão é reduzida (Figura 4B). Com uma câmera ainda mais barato 0.8 MP com uma resolução espacial comparável com a câmera de 1,4 MP, o chefe larval não pode ser reconhecida fielmente mais (Figura 4C). O rastreamento e análise peristaltismo é possível, mas incluindo mais jitter com base no aumento de ruído. Surpreendentemente, até mesmo uma baixa resolução na webcam USB fornece filmes de qualidade suficientes para calcular trajetórias de larvas (0,3 MP câmera, abaixo de 20 €, Figura 4D). O peristaltismo pode ser calculado a partir da área, mas as medidas são muito barulhento. Em nossa configuração rotineiramente usar a câmera 4 MP. Para a seleção, esta câmera permite monitorar a 22 centímetros x 22 centímetros arena, que, obviamente, oferece a oportunidade de analisar um grande número de animais, simultaneamente, de modo que a análise de alto rendimento é viável. Usando esta definição, i comprimento larvals representado por 40 pixels que ainda permite a gravação e análise de peristaltismo. Uma imagem exemplar de 15 larvas em trajectórias um gradiente de calor é dada na Figura 5A. Além disso, a utilização de uma objectiva macro que permite larvas de imagem com resolução muito elevada onde muitos órgãos internos tornar-se visível e reconhecimento da cabeça é ainda melhorada (Figura 5B). Além disso, estes podem ser utilizados para análise mais pormenorizada de comportamentos de uma vasta gama 20. A mesma configuração pode ser facilmente utilizado para a imagem rastejando C. vermes elegans (Figura 5C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650"> Figura 4. Imagem e acompanhamento de resultados da MIF para câmeras diferentes. (A) Esquerda: imaging FIM de três larvas rastejando em uma fase de monitoramento 10 centímetros x 10 centímetros captadas com uma câmera de 4 MP com 10 fps. Mid:Clipping e centro de trajetória em massa de uma única larva. A área do animal é indicada. Direita: Área da larva traçados ao longo de 100 quadros. A seta vermelha indica o momento de a imagem cortada. (B) equivalente a (A), mas captadas com uma câmera de 1.4 MP. (C) equivalente a (A), mas captadas com uma câmera de 0.8 MP. (D) equivalente a ( A) mas filmada com uma câmara de 0,3 MP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650"> Figura 5. estímulo de calor e alta resolução de aplicações. (A) aplicação do estímulo de calor (comparar a figura 1). Trajetórias calculado via FIMTrack. Image aplicação de alta resolução de um terceiro, segundo e primeiro larva instar usando uma lente macro (B). O comprimento das larvas de terceiro instar é representado por 400 pixels num campo de visão de 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans verme capturado usando imagens FIM. Barras de escala são indicadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

FIM é um sistema novo, o custo de imagem eficaz projetado para monitorar pequenos objetos em movimento, como C. elegans, planaria ou larvas de Drosophila. O programa acompanha FIMTrack foi projetado para oferecer análise de dados rápida e eficiente. Juntas, essas ferramentas permitem a análise de alto rendimento de traços comportamentais.

FIM Imaging and FIMtrack: Duas novas ferramentas que permitam de alta capacidade e Análise de Custo Efetivo Locomotion

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

O objetivo geral da metodologia a seguir é visualizar e quantificar a locomoção de larvas de Drosophila Melan Gaster, permitindo uma triagem de alto rendimento em condições de movimento livre. Isso é obtido criando uma superfície de rastreamento na configuração do FIM e usando a reflexão interna total frustrada para iluminação indireta. Larvas de diferentes genótipos são então colocadas na superfície e o comportamento de rastejamento em resposta a um gradiente de calor é registrado.Os vídeos são então analisados pela FIM Track. O software e os dados obtidos são usados para gerar gráficos que descrevem as diferenças nos padrões de larva e locomoção. Os resultados mostram que quantificações de larvas precisas, de alto rendimento, flexíveis e fáceis de usar.A locomoção pode ser feita com base na técnica de imagem FIM e no programa de rastreamento FIM associado. A principal vantagem desta técnica de imagem dos métodos existentes, como o uso de luz incidente ou transmitida, é que apenas os animais que tocam a superfície são visíveis, resultando em um excelente contraste de fundo em primeiro plano sem artefatos perturbadores, embora este método possa fornecer informações sobre a biologia da lava oph. Também pode ser aplicado para estudar o comportamento de caminhada das moscas e a locomoção de outros monoorganismos, como elegância do mar, plenárias ou mesmo o crescimento das raízes das plantas.A demonstração visual desse método é fundamental para convencer os outros de que uma tecnologia complexa é fácil de usar. O primeiro passo é criar uma superfície de rastreamento úmida para o método de imagem baseado em FITR ou fim. Para fazer esta fervura, 0,8% de trado de grau alimentício em água ultrapura deionizada.Despeje a broca quente em uma placa de vidro acrílico. Não agite o sem-fim após a fervura e despeje constantemente. Para evitar bolhas nessa temperatura, deve-se criar uma laje de dois milímetros de espessura.Use a solução de trado restante para encher placas de Petri padrão de seis centímetros. Estes serão usados para classificar as larvas limpas e habituais antes do experimento. Em seguida, apare aproximadamente dois centímetros do perímetro da laje helicoidal para obter uma superfície quadrada lisa para gravação.Transfira a laje do sem-fim para a configuração do FIM diretamente após o resfriamento. Ao empurrar suavemente a broca sobre a borda da placa de vidro acrílico, a broca deve deslizar no lugar. Agora você está pronto para a preparação da imagem para incluir uma barreira helicoidal aversiva na superfície de rastreamento.Ferva o sem-fim de 2,5% de qualidade alimentar com NACL de três molares em água ultrapura deionizada. Em seguida, corte um entalhe de dois centímetros de largura ao redor do campo de visão na superfície de rastreamento previamente derramada. Quando estiver pronto, encha o entalhe com uma broca de sal 0,1 a 0,3 centímetros mais alta que a superfície de rastreamento.Em seguida, prepare o dispositivo de gradiente de calor. O dispositivo é uma placa de alumínio coberta com uma superfície isolante e perfundida com água de bombas em ambas as extremidades. Para permitir o controle de temperatura, ligue o dispositivo de gradiente de calor uma hora antes de usar e coloque-o acima da configuração para permitir que ele atinja a temperatura desejada.Este tempo pode ser usado para preparativos adicionais. Quando estiver pronto, transfira a broca de superfície de rastreamento com uma barreira de sal para a configuração. Coloque a placa do radiador sobre o sem-fim e ajuste o espaçamento entre a placa e a superfície de rastreamento para dois milímetros.Estabeleça um gradiente linear de 34 graus Celsius a 18 graus Celsius ajustando a temperatura dos circuitos de água para um grau Celsius e 45 graus Celsius, o que é apropriado para este equipamento. Deixe a superfície rastejante se equilibrar no gradiente por 20 minutos. Antes de prosseguir, teste o gradiente de temperatura com um TER para preparar as moscas, recupere-as de uma incubadora de 25 graus Celsius e coloque um pouco de água nos frascos de cultura para conduzir o terço final do movimento da larva estrela.Em seguida, colete as larvas maiores das paredes do frasco usando um pincel pequeno, dois a cinco minutos antes da gravação, transfira larvas suficientes para um vídeo em uma placa de Petri preparada anteriormente. Depois que o gradiente de temperatura for estabelecido, configure o software de gravação. Especifique o número de quadros por vídeo.Defina o caminho de salvamento e configure para gravação instantânea em 20 segundos. Depois de colocar as larvas na superfície rastejante para começar, imagine uma das larvas e ajuste a intensidade da iluminação para obter um bom contraste. Quando estiver pronto, levante ligeiramente a placa do radiador e coloque as larvas a 34 graus Celsius, a dois centímetros da barreira de sal.Abaixe a placa do radiador novamente e comece a gravar no escuro para não incomodar os animais. Após o registro, remova as larvas e hidrate a superfície. Para evitar a propagação do NACL, não toque na broca de sal durante o trabalho, enquanto a superfície deve ser mantida úmida o tempo todo, evite umidade excessiva, que pode ser vista como halos ou gotas ao redor das larvas.Em gravações e rastreamento perturbado, deixe a superfície do sem-fim se equilibrar por um a dois minutos antes de prosseguir. Durante esse tempo, salve as imagens coletadas e reúna novos animais. Para se preparar para o próximo vídeo, controle o gradiente de temperatura usando um TER a cada cinco vídeos e ajuste o dispositivo de temperatura, se necessário.Para começar a rastrear a locomoção, ajuste os parâmetros de rastreamento usando a opção de visualização. Ajuste o milímetro por pixel de acordo com a câmera e o campo de visão. Em seguida, ajuste os quadros por segundo com base nas configurações da câmera, use o feedback fornecido na janela de visualização para ajustar os limites de brilho para que todos os animais sejam detectados corretamente.Em seguida, ajuste os limites de tamanho da área larval, animais individuais são destacados por círculos amarelos, larvas em colisão são destacadas em vermelho e a área de cada animal é dada em azul. Comece a rastrear usando o botão no canto inferior direito após a sessão de rastreamento, uma imagem com rastros de larvas e um arquivo CSV contendo as características calculadas de locomoção e postura são armazenadas no diretório de imagens. Por fim, use o módulo visualizador de resultados do FIM para revisar e ajustar manualmente os resultados do rastreamento.Defina a orientação de rastreamento em relação ao gradiente de calor para avaliar os dados com base nesse estímulo. Na representação da larva mostrada aqui, a cabeça e a cauda são marcadas entre esses pontos. Um número ímpar arbitrário de pontos da coluna pode ser definido com um raio.Além disso, o centro de massa e o ângulo de flexão do corpo principal são calculados. Aqui são mostrados os resultados de imagens e rastreamento de FI de diferentes câmeras. As imagens à esquerda capturam três larvas rastejando em um estágio de rastreamento de 10 centímetros por 10 centímetros.A trajetória da massa e a área de uma única larva são mostradas à direita. A seta vermelha indica o ponto de tempo dos resultados da imagem recortada da aplicação. Um estímulo de calor é mostrado aqui como trajetórias de cores diferentes calculadas via trilha F.Essas imagens de aplicação de alta resolução de uma terceira, segunda e primeira larvas de estrelas foram obtidas com uma lente macro. Outros organismos, como o mar, também podem ser fotografados facilmente. Uma vez dominado, cerca de cem laboratórios podem ser analisados por hora por cada configuração de rastreamento.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre gravar nas mesmas condições Seguindo este procedimento. Outros métodos, como estimulação optogenética ou detecção in vivo de atividade neural, podem ser incluídos na configuração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como pode ser fácil analisar com eficiência a locomoção ular.

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Research

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Neuroscience

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