Name: Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a avaliar fenótipos de crescimento de axônios sensoriais em embriões de camundongo usando o protocolo de montagem completa. Este método permite visualizar projeções de nociceptores para estudos de neurociência.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Louis Reichardt para os ratos TrkA taulacZ e Dr. Annette Markus para discussão perspicaz e sugestões. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Fundação Burke, bem como Fundação Whitehall bolsa de investigação 2010-08-61, uma bolsa de investigação Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), conceder ZB1-1102-1 do Christopher e Dana Reeve Foundation, e concede 1R01EY022409 e 3R01EY022409-01S1 do National Eye Institute, a JZ. KJo é um companheiro Goldsmith.

NOTA: Todos os procedimentos em conformidade com o Manual do NIH para o uso e cuidados de animais de laboratório. O protocolo animal foi aprovada pelo IACUC no Weill Cornell Medical College. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Eutanásia fêmeas cronometrado com a gravidez por deslocamento cervical 15. Dissecar embrionárias E16 - E18 embriões de fêmeas cronometrado com a gravidez e embriões lugar individualmente em poços de uma de 6 poços prato, preenchidas com solução salina fosfato tamponada (PBS). </li><li> Enxágüe embriões em PBS frio. </li><li> Retirar uma pequena porção da membrana amniótica do embrião e no lugar de uma solução de proteinase K pré-preparadas para a genotipagem subsequente. Alternativamente, se a membrana amniótica é perdida, remover uma pequena porção da ponta da cauda do embrião e colocá-lo em solução de proteinase K </li><li> Picar furos na pele ao redor do embrião usando pinos de insetos (pelo menos 100 de cada lado). </li><li> Remover PBS e lentamente adicionar fresco 2% paraformaldeído (PFA),pH 7,4, para o bem. </li><li> Agite suavemente durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar embriões duas vezes em PBS e armazenar em PBS a 4 ° C até a coloração. </li></ol> 2. A genotipagem <ol><li> Mergulhe membranas amnióticas ou rabos de embriões em proteinase mistura K de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Incubar a 56 ° C durante 10 min. </li><li> Extrai-se o ADN utilizando um kit de purificação de ADN comercialmente disponível. </li><li> Utilizar 0,5 mL do total de 200 uL de solução de ADN genómico purificado, combiná-la com 0,5 ul de cada um dos iniciadores com sentido e anti-sentido específico para o gene (10 uM), 2 ul de dNTP Mix (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 0,2 jil de polimerase Taq (5 U / uL) e 2 ul de tampão de PCR (10x), adicionar H 2 O para um volume total de 20 ul. NOTA: As sequências dos iniciadores são como se segue (Tabela 1): TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragmento comprimento: 400 pares de bases (pb). Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; Comprimentos fragmento de PCR: tipo selvagem, 304 pb; Bax null, 507 pb. TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR de comprimento de fragmentos: 360 pb. </li><li> Executar uma PCR com o seguinte programa para TrkA: passo 1: 1 min a 95 ° C, passo 2: 10 seg a 95 ° C, passo 3: 20 seg a 68 ° C, passo 4: 30 segundos a 72 ° C. Repita os passos 2-4 para 40 ciclos. <ol><li> Para LacZ e Bax, executar um PCR com o seguinte programa: passo 1: 1 min a 95 ° C, passo 2: 10 seg a 95 ° C, passo 3: 1 min a 54 ° C, passo 4: 1 min a 72 ° C, repita os passos 2-4 para 35 ciclos. </li></ol></li><li> Executar amostras de PCR num gel de agarose a 2% a 100 V, em tampão 1 x Tris-acetato-EDTA durante 20 min, com uma pista de escada de ADN para avaliar comprimentos de fragmentos. </li><li> Analise embriões para a presença do tipo selvagem de TrkA, TRKA-tauLacZ e Bax alelos nulos. Os genótipos de embriões experimentais são TrkA taulacZ / WT: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, dependendo das perguntas experimentais. Os embriões sem o repórter tauLacZ será negativo para a coloração axonal e pode, por conseguinte, servem como controlos negativos para calibrar o processo de coloração. </li></ol> 3. Embryo Coloração <ol><li> Usar um kit comercial para a coloração lacZ com algumas modificações como descrito em baixo nas secções 3,2-3,8. Aqui, use o kit Millipore. </li><li> Imergir embriões em Tampão A durante pelo menos 1 hora, sacudindo suavemente, à temperatura ambiente. </li><li> Imergir directamente embriões em tampão B durante pelo menos 15 min, agitando suavemente à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto os embriões são em tampão A / B, pré-solução quente base de tecido a 37 ° C. Utilize 5 ml de solução de base Tissue por embrião. </li><li> Enquanto os embriões são em Tampão A / B, preparar fresco 5-brOmo 4- cloro-3- indolilo α-D-galactopiranósido (X-gal) a uma concentração de 40 mg / ml em 100% de dimetil sulfóxido (DMSO). </li><li> Dilui-se com X-gal para a solução de base de tecido pré-aquecido a uma concentração de 1 mg / ml e adicionam-se 5 ml de X-gal / mistura base de tecido para um frasco de cintilação de vidro. </li><li> Transferir os embriões para um frasco de cintilação de vidro contendo mistura de base de X-gal / Tissue. Selar tampa com Parafilm e incubar a 37 ° C durante a noite, verificando-se a presença de corante azul. </li><li> Postfix com embriões frescos PFA 4%, pH 7.4. Agitar suavemente durante 4 horas a 4 ° C. </li><li> Enxágüe embriões duas vezes em PBS frio. </li></ol> 4. Tissue Desidratação e Clearing <ol><li> Colocar em embriões de 50% de metanol / 50% de mistura de PBS durante 30 min à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro. </li><li> Continuar a desidratar em 75% de metanol / 25% de PBS durante 30 min à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro. </li><li> Continuar a desidratar em 90% de metanol / 10% PBS durante 30 min à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro. </li><li> Continuar a desidratar em metanol a 100% durante 30 min (2x), à temperatura ambiente, agitando em frascos de vidro. </li><li> Enquanto os embriões são desidratação, preparar uma mistura 1: 1 (v: v) de uma mistura de álcool de benzoílo e benzoílo benzoato. NOTA: álcool benzoílo e benzoílo benzoato é tóxico. </li><li> Imergir embriões no 1: 1 (v: v) de uma mistura de metanol a 100%: 100% BABB durante 15 min. Usar apenas porque o vidro BABB irá dissolver plástico. </li><li> Mergulhe embriões em 100% BABB para limpar completamente o tecido e visualizar coloração X-gal no embrião desmarcada. NOTA: A imagem o mais rapidamente possível, porque a mancha X-gal vai desaparecer ao longo do tempo. </li></ol> 5. Monte todo Imagem <ol><li> Estabilizar o embrião, imerso em 100% BABB, nos ângulos adequados para fotografia usando uma pinça de metal. Iluminar usando uma combinação de up-luz e sob luz luz fontes. </li><li> Adquirir imagens com um microscópio de dissecaçãoequipado com uma câmera digital. Tire várias exposições a campos brilhantes em cinco planos focais sucessivas 0,5 milímetros de distância ao longo do eixo Z. Os tempos de exposição e f-stops podem variar de acordo com a iluminação e câmera especificações e precisam ser otimizados para cada configuração. </li><li> Use um software de processamento de imagem padrão para processar imagens de sobreposição e gerar fotomontagens. </li></ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
<li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibers+in+Fabry+disease%3A+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li>
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<li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li>
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<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li>
<li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li>
<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesses conflitantes.

O processo de coloração X-gal acima descrito de ratos embrionárias TrkA taulacZ permite a visualização rápida e detalhada de projeções axônio de longa distância no embrião fixa intacta. Por causa do fundo nulo Bax estes ratos permitir a sondagem de mecanismos de sinalização que podem contribuir para o crescimento do axônio e sobrevivência neuronal. O cruzamento com camundongos transgênicos ou knockout de interesse permite uma avaliação abrangente de fenótipos axonal e pode servir como guia ú...

Estabelecimento de redes neuronais precisas é um processo de desenvolvimento complexo essencial para a funcionalidade do sistema nervoso. Distúrbio neste processo leva à disfunção neuronal que tem sido implicado em doenças neurológicas humanas 1-3. Para estudar os mecanismos moleculares subjacentes de crescimento do axônio e inervação alvo em mamíferos, nós desenvolvemos um protocolo para visualizar as trajetórias axonal de TrkA-expressando neurônios sensoriais usando uma combinação de duas linhas de rato geneticamente modificados. TrkA é um receptor para o factor de crescimento dos nervos NGF e é um marcador funcional de neurónios sensoriais nociceptivos 4. TrkA é altamente expressa em neurónios nociceptivos durante o desenvolvimento precoce e medeia a sobrevivência de neurónios dependente de NGF, o crescimento axonal, arborização e alvo de inervação 5-9. Em ratinhos TrkA taulacZ, o gene de TrkA tipo selvagem é substituído por uma expressão de c taulacZassette 10, de tal modo que a morfologia axonal de neurónios TrkA-positivos putativos pode ser visualizado por β-gal (X-gal) 11 coloração. Usando uma linha de TrkA taulacZ / WT heterozigótico, pode-se examinar os factores que podem regular ou interferir com o desenvolvimento de projecções aferentes sensoriais in vivo. Além disso, a expressão de TrkA está ausente em ratinhos homozigóticos TrkA taulacZ / taulacZ, que pode, portanto, ser utilizados para avaliar a promoção do crescimento axonal na ausência de mecanismos de sinalização NGF / TrkA. Uma vez que os neurónios nociceptivos dependem sinalização NGF / TrkA não só para o crescimento axonal, mas também para a sobrevivência, que empregam uma outra linha de ratinhos, a que falta o gene de pró-apoptótica Bax, para inibir a apoptose em neurónios DRG embrionárias, salvando-los de morte celular que é de outra maneira observada na ausência de sinalização TrkA. O Bax - / - fundo 12 permite, assim, para o molecudissecção lar de vias de sinalização que afectam especificamente 7-9,13-15 crescimento axonal. Em TrkA - / -: Bax - / - ratos, neurónios DRG sobreviver, mas inervação aferente sensorial na pele é completamente abolida 14,15. Podemos ativar seletivamente as vias de sinalização para determinar suas respectivas contribuições para o desenvolvimento de projeções axônio. A utilidade deste método é que ele permite a avaliação de mudanças na fenótipos crescimento axonal quando diferentes modificações genéticas são criados para a TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ou TrkA taulacZ / WT: Bax - / - fundos.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Solução de enxágue de tecido A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Solução de enxágue de tecido B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Solução de base de mancha de tecido</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cintilação de vidro</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Labline</td><td>Modelo 120</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de insetos</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>prato de 6 poços</td><td>EUA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td>primers</td><td></td> de DNA personalizados</tr><tr><td>Takara mistura dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA tampão</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Álcool benzílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato de benzila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Anel de luz</td><td>Leica&nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

todo-mount imagem de embrião de rato projeções sensorial axon

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

A visualização das projeções neuronais de corpo inteiro em embriões é essencial para ganhar uma compreensão de como mamíferos redes neuronais desenvolver. Aqui nós descrevemos um método para rotular in situ um subconjunto do gânglio da raiz dorsal (DRG) projeções axônio para avaliar suas características fenotípicas usando várias linhas de rato geneticamente manipulados. Os neurônios TrkA-positivos são neurônios nociceptores, dedicados à transmissão de sinais de dor. Nós utilizamos uma linha rato TrkA taulacZ para rotular as trajetórias de todos os axônios periféricos TrkA-positivos no embrião intacto mouse. Nós produzir ainda mais a linha TrkA taulacZ sobre um fundo nulo Bax, que essencialmente suprime a apoptose neuronal, a fim de avaliar as questões relacionadas com o crescimento, independentemente de possíveis efeitos das manipulações genéticas na sobrevivência neuronal. Posteriormente, os ratos geneticamente modificados, de interesse são criados com o TrkA TAULACZ / Bax linha nula e está então pronto para o estudo utilizando as técnicas aqui descritas. Esta apresentação inclui informações detalhadas sobre os planos de melhoramento do rato, genotipagem no momento da dissecção, a preparação do tecido, a coloração e de compensação para permitir a visualização de todo o comprimento trajetórias axonal em preparação todo o monte.

Os genótipos de TrkA WT / taulacZ: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embriões pode ser determinada sem ambiguidades por genotipagem de PCR padrão (Figura 1). X-gal de coloração exibe detalhado mandris axonal periféricos por via subcutânea em embriões coradas convencionalmente (Figuras 2, 3A), e em todo o embrião após clearing tecido (Figuras 3b, 4). Temos produzido a TrkA WT / taul...

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar efetivamente os fenótipos de crescimento sensorial do axônio em camundongos fetais em desenvolvimento. Isso é conseguido primeiro criando e genotipando adequadamente os camundongos repórter tre a tau laxy, de modo que os ensaios de coloração a jusante possam ser realizados como uma segunda etapa. Os embriões de camundongos são fixados e corados para permitir a visualização das projeções sensoriais dos axônios em todo o animal.Em seguida, os embriões são desidratados e limpos para visualizar completamente as projeções profundas dos axônios que, de outra forma, não seriam visíveis. Os resultados demonstram que esses métodos são um meio eficaz de avaliar rapidamente os fenótipos de crescimento de axônios nociceptivos embrionários. Usando a faixa de um repórter Tau Lae, este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do crescimento sensorial do axônio, permitindo que os pesquisadores cruzem seu gene de interesse para o rastreamento de um fundo tlac Z e rastreiem quaisquer alterações nos fenótipos de crescimento sensorial do axônio.As implicações de nossa técnica se estendem à terapia no sentido de que os cientistas podem

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Source: Liau, E. S. et al. Visualização da navegação do axônio motor e quantificação da arborização do axônio em embriões de camundongo usando microscopia de fluorescência de folha de luz. J. Vis. Exp. (2018). Este vídeo demonstra o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para obter imagens de projeções de neurônios motores e ramificação de axônios em embriões de camundongos transgênicos. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação da amostra, imagem e reconstrução 3D da...

Visualização de projeções de neurônios motores e ramificação de axônios usando microscopia de fluorescência de folha de luz

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

Aprenda a avaliar fenótipos de crescimento de axônios sensoriais em embriões de camundongo usando o protocolo de montagem completa. Este método permite visualizar projeções de nociceptores para estudos de neurociência.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

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