Name: Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprenda a isolar miofibroblastos primários de esôfago de camundongo e humano usando digestão com colagenase. Este método permite estudar interações epitelio-estromais em biologia celular.

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Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo para realizar experimentos com animais, a lógica e os objetivos da pesquisa, foram submetidos e aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e do Comitê Use. O protocolo para estabelecimento de culturas primárias de identificados de-esofagectomia espécimes humanos foi aprovado pela University of Southern California Institutional Review Board. 1. Obtenha Mouse ou Esôfago Humano <ol><li> Obter Rato Esôfago: <ol><li> Eutanásia do rato velho 8-12 dias com 2% de isoflurano sobredosagem inalante seguido por deslocação cervical. </li><li> Pin o animal para baixo com a barriga voltada para cima e molhar a superfície ventral com etanol 70%. Com uma pinça, agarrar e levantar a pele anterior à abertura da uretra com uma pinça. Use uma tesoura cirúrgica retas padrão para cortar ao longo da linha média ventral a partir da abertura da uretra até o queixo. Tenha cuidado para cortar somente a pele. &lt;/ Li&gt; <li> Fazer uma incisão da abertura uretral para baixo para o joelho em ambos os lados do animal, que formam uma cabeça para baixo &quot;Y&quot;. Fazer uma outra incisão em ambos os lados do animal ao longo da caixa toráxica. </li><li> Retire cuidadosamente a pele em ambos os lados, fora do peritônio subjacente e da caixa torácica, e se deitou para os lados. Examinar a caixa torácica que se sobrepõe à cavidade torácica e o peritoneu que se sobrepõe à cavidade abdominal. <ol><li> Levante o peritônio com uma pinça e cortar por ele até a gaiola diafragma e costela, apontando uma tesoura para cima para evitar danos ao conteúdo abdominal. Suavemente levantar o lobo esquerdo do fígado, do estômago expor subjacente, a junção esôfago-gástrica e a porção abdominal do esófago. </li></ol></li><li> Use uma tesoura cirúrgica autoclavados para cortar o esterno e costelas ao longo da linha média até a cintura cervical. Ponto de tesoura para cima, para evitar danos ao conteúdo torácicos. Totalmente expor o conteúdo docavidade torácica, puxando a caixa torácica para os lados. </li><li> Suavemente remover o coração e os dois lobos dos pulmões. Absorve o excesso de sangue com cotonetes. O esôfago torácico é uma, tubo deitado posterior estreito flexível para a traquéia e anterior à vértebra torácica. NOTA: O esôfago pode ser difícil de identificar em recém-nascidos de murino. Localização da junção esôfago-gástrica torna a identificação do esôfago simples. </li><li> Siga cuidadosamente o esôfago acima do estômago, dissecando a vasculatura, gordura ao redor e do mesentério todo o caminho até a origem da dor na cavidade cervical. Tesouras cirúrgicas com ponta romba funcionam melhor para esta finalidade. </li><li> Ressecção de todo o comprimento do esófago e do lugar em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) para posterior processamento descrito abaixo. Retirar uma porção do estômago para fins de orientação, se desejado. NOTA: Devido ao tamanho pequeno tecido, a separação das muscular própria do muscularé mucosa não é viável dentro murino esôfago recém-nascido e de todo o esôfago é submetido ao processamento descrito abaixo. </li></ol></li><li> Obter Esôfago Humano: <ol><li> Lave espécimes ressecção do esôfago (tipicamente 5 cm ou menos) com HBSS e remover qualquer anexo do tecido conjuntivo, tecido adiposo, ou vasculatura. </li><li> Ressecção de uma porção da amostra e colocam-se em formalina para exame histológico futuro, se desejado. </li><li> Separe os mucosa restantes do subjacente muscular própria dissecadas. </li><li> Corte mucosa em fragmentos centímetros sub e sujeito com o protocolo descrito abaixo. NOTA: ressecções esófago humanos podem ser armazenadas em PBS durante até 6 h antes do processamento descrito abaixo. Fonte de espécimes esofagectomia vai ditar o tamanho da amostra e será laboratório dependente. </li></ol></li></ol> 2. Isolar Murino e esôfago humano células estromais <ol><li> Isolar células estromais esofágicas fmurino rom e tecidos humanos por uma combinação de digestão enzimática e mecânica. <ol><li> Mecanicamente digerir picando o tecido com uma tesoura e múltiplas lavagens com HBSS. Enzimaticamente digerir o tecido, por incubação com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante 25 min (tecido de murino) ou de até 6 horas (tecido humano). Certifique-se de que os instrumentos utilizados para picar foram autoclavados e esterilizado. NOTA: As colagenases são enzimas que quebram o colágeno, uma proteína de matriz extracelular responsável pela realização de tecido animal juntos. Colagenase XI tem alta atividade da colagenase e tem visto o sucesso neste protocolo de isolamento. Dispase é uma enzima bacteriana com actividade proteolítica dissociação suave que preserva a actividade da membrana celular e é usada em combinação com uma enzima colagenase como secundário. </li><li> Coloque fragmentos de mucosa obtidos a partir do mouse ou tecido humano em 1,7 ml micro-centrífuga ou tubos de 5 ml, respectivamente, contendo HBSS. Tecido Mince maisem 2-3 pedaços mm usando uma tesoura com uma largura de ponta aberta que se encaixam em seus respectivos tubos. Permitir tempo suficiente para permitir a fragmentos de mucosa esofágica para sedimentar para o fundo do tubo. </li><li> Lentamente decantar HBSS, tomando cuidado para não inadvertidamente descartar o tecido. Substituir com HBSS seguinte por agitação suave. Como alternativa, remova HBSS com uma pipeta de 1 ml. </li><li> Lave o tecido dessa forma um total de 8 vezes com agitação suave entre lavagens dar tempo aos fragmentos de esôfago para sedimentar entre cada lavagem. NOTA: O tecido humano vai exigir mais picados que o tecido recém-nascido mouse. </li></ol></li><li> Incubar tecido murino com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante 25 min num agitador de balanço regulada para uma velocidade lenta, à temperatura ambiente. <ol><li> Incubar o tecido humano com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante até 6 horas, num agitador de balanço regulada para uma velocidade lenta, à temperatura ambiente. NOTA: A disponibilidade de esopha humanogus é variável. Mucosa esofágica Human incubadas com enzimas para até 6 horas resulta em uma geração bem sucedida de culturas primárias. </li></ol></li><li> Após a digestão enzimática de tecido tritura ainda com uma tesoura e centrifugar a 200 xg durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante. Transferir o sedimento, que consiste de uma suspensão mista de células para um tubo de 5 ml e lava-se 5 vezes em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 2% de sorbitol para eliminar as células não viáveis ​​e detritos. </li><li> Semear as células em placas de 6 poços e cultura em DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), 10 mg / ml de insulina, 10 ng / ml de transferrina, 10 ug / ml de gentamicina, e factor de crescimento epidérmico 2 ng / ml (EGF) . Filtro de vácuo (0,22 mm) todos os componentes, com excepção de EGF que podem ser adicionados após a filtração. Distribuir as células obtidas a partir de amostras de ressecção humanos entre múltiplas placas de 6 poços, dependendo do tamanho da ressecção. </li><li> Depois de os poços são 80% confluentes, passagem células aderentes a T25 nos frascosção de 0,05% de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Neutralizar com a mídia e rotação a 400 x g. <ol><li> Para uma passagem de 6 poços para um frasco T25, as células de passagem na proporção de 1: 1. Frascos T25 confluentes podem ser passadas a uma proporção de 1: 3: 2 ou 1. Para a passagem de um frasco de T25 a um frasco T75, utilizar uma proporção de 1: 1. Troca de mídia a cada 2-3 dias, independentemente do navio. </li><li> Crescer as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 e cultura de miofibroblastos nos meios descritos acima. NOTA: As células epiteliais não sobrevivem sob estas condições de cultura ou de passagem. As células utilizadas para a caracterização e nos estudos descritos abaixo são passagens entre 5 e 15. </li><li> Cryo-preservar células em N2 líquido, adicionando 10% de dimetilsulfóxido à mídia myofibroblast. </li></ol></li></ol> 3. Caracterizar Murino e esôfago humano células estromais <ol><li> Examinar a morfologia das células com um microscópio invertido. Observe a-fusiformesmorfologia de células aderentes (Figura 1). </li><li> Caracterizar células cultivadas pela avaliação dos seguintes marcadores do citoesqueleto: α-SMA, vimentina, desmina, e cytokeratin. As células estromais com um fenótipo myofibroblast-like expressam marcadores miofibroblastos do citoesqueleto α-SMA e vimentina (Figura 2). <ol><li> Para diferenciar ainda mais as células do estroma cultivadas a partir de células musculares, imunocoloração para desmina. Para realizar a imunocoloração em células cultivadas, placa 1,5 x 10 4 células em lâminas de câmara de 4 cavidades e crescem em meios de miofibroblastos durante 24 h. As células estromais com um fenótipo myofibroblast-like terá fraco ou ausente expressão desmina. As células estromais não ter expressão do marcador pan-epitelial citoqueratina (dados não mostrados). NOTA: Avaliação de culturas inclui avaliação de marcadores do citoesqueleto por marcadores imunocitoquímica e da superfície celular por citometria de fluxo. A imunocitoquimica é utilizado como o principal método de caracterização como o expression perfil de proteínas do citoesqueleto é único para o fibroblasto, miofibroblastos ou células do músculo. A citometria de fluxo estabelece que a cultura de pureza por avaliação de expressão na superfície celular de células epiteliais, endoteliais e células hematopoiéticas marcadores. CD90 é útil como adjuvante de um método de identificação de células estromais humanas, uma vez que é expresso em ambos os fibroblastos humanos e miofibroblastos. CD90 não é útil na caracterização de células estromais de murino, uma vez que também expressa por células T de murideo. </li></ol></li><li> Depois das células atingirem 60% de confluência, enxaguar as lâminas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixar-se com metanol. Incubar as células em metanol durante 10 min a -20 ° C e em seguida armazená em PBS a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Siga o protocolo immunostaining padrão. </li><li> Resumidamente, antes da aplicação do anticorpo primário, bloquear as células fixadas com 5% goatserum em PBS. Dilui-se anticorpos primários e secundários em 5% de soro de cabra bem. <ol><li> Para a detecção de α-SMA e vimentina, utilizar oOs anticorpos e as concentrações seguintes: mAb de murganho para α-SMA em 1: 250 de diluição e de coelho pAB para vimentina em 1: 500 de diluição. </li><li> Incubar com anticorpo primário, à temperatura ambiente durante a noite a 4 ° C, lavar 3 vezes com PBS e adicionar anticorpos secundários rodamina cabra anti-ratinho conjugado a uma diluição de 1: 200 e Cy2 cabra anti coelho conjugado a uma diluição de 1: 1000 durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Contracoloração núcleos com 4 &#39;, 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) a uma concentração de 1 ug / ml durante 1 min e, em seguida, lavar com PBS. Analisar slides com um microscópio invertido. </li></ol></li><li> Estabelecer pureza das culturas através de exame das células esofágicas murinos e humanos para hematopoiéticas (CD45) e endotelial (CD31) marcadores de superfície celular por citometria de fluxo (Figura 3). Caracterizar as células humanas ainda pela expressão do marcador de superfície celular de estroma da CD90. NOTA: CD90 não pode ser utilizado para identificar as células de estroma murino como murino T cells também expressam CD90. <ol><li> Separar as células estromais esofágica do rato em cultura a partir de frascos de cultura por tratamento com celular não-enzimática de dissociação Solução a 37 ° C durante 10 minutos, foram lavadas duas vezes com tampão FACS, contadas e coradas com FITC-CD45 e CD31-APC com os controlos de isotipo correspondentes, de acordo para procedimentos de coloração padrão. </li><li> Coletar células usando FACS Calibur e analisar os dados com software FlowJo. Antes de células marcadas, otimizar anticorpos e titular concentrações usando controles isotipo, baço normal do mouse, e as células da medula óssea. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Helper+2+Cytokines%2C+Transforming+Growth+Factor+beta1%2C+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li>
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<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li>
</ol>

Este trabalho é apoiado pelo NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Instituto Sino da Saúde e Nutrição Research Scholar Award em Fisiologia Gut e Saúde (AS) e um Wright Foundation Award Pilot (AS).

As técnicas para a geração de cultura primária são geralmente semelhantes quando se utiliza tecido murino ou humano com Picadoras de carne e de digestão vezes adaptados para o tamanho do tecido. A nossa experiência com tecido murino sugere que utilizando os métodos descritos acima consistentemente resultar no estabelecimento bem sucedido de culturas primárias. As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem a esterilização de equipamentos cirúrgicos e seguindo técnicas estéreis padrão de cultura de tecidos. A idade do...

Interações epitélio-estromal estão envolvidos na regulação de uma variedade de funções do trato gastrointestinal, incluindo a regeneração das mucosas, reparação, fibrose e carcinogênese 1,2. Estas interacções têm sido melhor estudada no intestino delgado e cólon, e pode desempenhar um papel semelhante nos distúrbios da mucosa esofágica 3. Uma subpopulação de células de miofibroblastos do estroma e intestinais do cólon denominados foi demonstrada para participar na mediação de lesão dos tecidos, inflamação e reparação de 4,5. No tracto GI distal, estas células fusiformes estão localizadas adjacentes à membrana basal, na interface entre o epitélio e da lâmina própria e são definidos como α-SMA positivos e vimentina, citoqueratina pan-negativo, e fracamente positivo ou negativo 5 desmina. O estroma da dor não foi rigorosamente caracterizado ao nível celular ou molecular. Nosso trabalho no esôfago murino minimizarammonstrou α-SMA células e vimentina no estroma de esôfago, ocasionalmente subjacentes ao epitélio escamoso 6. Interacções epiteliais-estromal têm sido implicados em perturbações da mucosa esofágica, tais como lesão mediada gastro-esofágico e esofagite eosinofílica 6 3. Estenoses fibróticas também são uma complicação conhecida de células estromais de lesões esofágicas e têm sido implicados na patogénese da fibrose gastrointestinal. O isolamento dessas células vai ajudar a realizar os estudos necessários para investigar vias de sinalização dementes. Esta apresentação fornece as técnicas necessárias para estabelecer culturas primárias de α-SMA, myofibroblasts positivos vimentina positivos tais que as lacunas existentes no conhecimento sobre as vias de sinalização que medeiam estas interações podem ser abordados. A técnica descrita foi utilizada com sucesso pelos autores para estabelecer miofibroblastos do cólon de murino primários 7 e further adaptado para o estabelecimento de murino 6 e células estromais esôfago humano miofibroblastos. Descrevemos as condições necessárias para estabelecer e caracterizar essas culturas estabelecidas a partir do mouse ou no esôfago humano antes do uso em futuros estudos funcionais. As culturas podem ser cultivadas e utilizou-se para a 15 passagens. O isolamento e estabelecimento de culturas primárias através dos métodos descritos abaixo gera células do estroma com um fenótipo de miofibroblastos; α-SMA, vimentin positivo e fracamente positivo ou negativo para desmina e citoceratina negativo. Este fenótipo é diferente do fenótipo do fibroblasto esofágica que é predominantemente positiva vimentina, α-SMA negativo 3 ou o α-SMA positivos, vimentina fenótipo negativo da mucosa muscularis 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>tripsina / EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes para imunocoloração</td></tr><tr><td>de soro de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB para &alpha;-SMA&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Coelho pAB para vimentina</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugado Cabra anti Coelho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugado com eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugado com APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V e 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block para CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Tubo de 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança e incubadoras</td><td>Nuaire</td><td></td><td><a href="http://www.nuaire.com/products/" target="_blank">http://www.nuaire.com/products/</a></td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Sistema de filtro acionado a vácuo</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td>Placas de 6 poços <td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Frascos</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Tesouras</td><td>de</td><td></td> dissecção Pinças <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>dissecação</td></tr> de ponta <tr><td>única</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Software Metamorph (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de miofibroblastos de mouse e esôfago humano

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

De murino e humano esofágicas miofibroblastos são geradas através de digestão enzimática. Neonato (8-12 dias de idade) de murino esófago é colhida, triturada, lavada, e submetidos a digestão enzimática com colagenase e dispase durante 25 min. Espécimes ressecção do esôfago humanos são despojados de muscular própria e adventícia ea mucosa restante é picada, e submetido a digestão enzimática com colagenase e dispase por até 6 horas. As células cultivadas expressar α-SMA e vimentina e desmina expressa fracamente ou não em todos. Condições de cultura não são favoráveis ​​para o crescimento de células epiteliais, hematopoiético, ou células endoteliais. A pureza da cultura é ainda confirmada pela avaliação de citometria de fluxo de superfície celular expressão do marcador do potencial de contaminação da hematopoiético e células endoteliais. A técnica descrita é simples e resulta na geração consistente de não-hematopoieitc, células estromais não endoteliais. As limitações desta técnica são inerentes ao uso deculturas primárias em estudos de biologia molecular, ou seja, a variabilidade inevitável encontrou entre as culturas estabelecidas em diferentes ratos ou de seres humanos. As culturas primárias, porém, são uma reflexão mais representativo do estado in vivo em comparação com as linhas celulares. Estes métodos também fornecer aos investigadores a capacidade de isolar e cultura de células estromais de diferentes condições clínicas e experimentais, permitindo comparações entre os grupos. Células estromais esofágicas caracterizados também pode ser usado em estudos funcionais investigando interações epiteliais-estromal em doenças do esôfago.

Células estromais esofágicas isoladas usando a digestão mecânica e enzimática são inicialmente banhado e cultivadas em placas de 6 poços. O exame de células com um microscópio invertido dentro de horas de plaqueamento demonstra uma suspensão mista de células fracamente aderentes à placa de fundo (Figura 1A). Durante o próximo 24 horas, as células em forma de fuso firmemente aderentes ao fundo da placa são observados de disparo a partir da suspensão de células mista (Figura 1B) .Estes cé...

Apresentamos um protocolo para gerar culturas primárias de células estromais esofágicas murinas e humanas com fenótipo de miofibroblastos. As células cultivadas têm morfologia fusiforme, expressam α-SMA e vimentina e carecem de marcadores de superfície celular epitelial, hematopoiética e endotelial. As células estromais caracterizadas podem ser usadas em estudos funcionais de interações epitelial-estromal.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar miofibroblastos primários do esôfago de camundongos e humanos. Isso é feito pela primeira coleta de todo o esôfago do camundongo recém-nascido doador com tecido humano. A mucosa é separada da muscular própria.O segundo passo é picar o tecido e lavar várias vezes em HBSS. Em seguida, o tecido é digerido com colagenase diss e ainda picado, liberando as células mesenquimais junto com o epitélio anexado. A população de células heterogêneas é então cultivada em meios de miofibroblastos nos quais os miofibroblastos aderem enquanto as células epiteliais não sobrevivem e são lavadas.Em última análise, a imunoquímica e a citometria de fluxo são usadas para confirmar que as células em cultura primária são miofibroblastos. Demonstrando os procedimentos estaremos eu, Matthew Gargas, um técnico, e chow new, um pós-doutorado do meu laboratório, Tori. Depois de sacrificar um camundongo de oito a 12 dias de idade, prenda o lado dorsal do animal e molhe a superfície ventral com etanol a 70%.Em seguida, usando uma pinça, agarre e levante a pele anterior à abertura uretral. Corte ao longo da linha média ventral da abertura uretral até o queixo. Corte apena

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o isolamento de miofibras únicas do músculo extensor longo dos dedos murino (EDL) colhido. As miofibras isoladas podem ser cultivadas para estudar a atividade das células-tronco musculares associadas à miofibra.

Isolamento de miofibras: uma técnica para obter miofibras únicas do músculo extensor longo dos dedos (EDL) de camundongo colhido

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e estabelecer culturas primárias de fibroblastos/miofibroblastos (MF) de células gástricas, pequenas intestinais e produtoras de tecido colônico congeladas com fenótipo MF. Essas células expressam CD90, α-SMA e vimentina. Os MFs podem ser usados para uma variedade de ensaios funcionais, incluindo atividade enzimática e produção de citocinas.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

Co-culturas organóide-fibroblastos fornecem um modelo para estudar o nicho de células-tronco in vivo . Aqui é descrito um protocolo para co-culturas esofágico-organóide-fibroblasto. Além disso, imagens de montagem inteira são usadas para visualizar a interação fibroblasto-organoide.

Caracterização funcional e visualização de fibroblastos esofágicos utilizando co-culturas organoides

Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica 

Aprenda a isolar miofibroblastos primários de esôfago de camundongo e humano usando digestão com colagenase. Este método permite estudar interações epitelio-estromais em biologia celular.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

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