Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar miofibroblastos primários do esôfago de camundongos e humanos. Isso é feito pela primeira coleta de todo o esôfago do camundongo recém-nascido doador com tecido humano. A mucosa é separada da muscular própria.

O segundo passo é picar o tecido e lavar várias vezes em HBSS. Em seguida, o tecido é digerido com colagenase diss e ainda picado, liberando as células mesenquimais junto com o epitélio anexado. A população de células heterogêneas é então cultivada em meios de miofibroblastos nos quais os miofibroblastos aderem enquanto as células epiteliais não sobrevivem e são lavadas.

Em última análise, a imunoquímica e a citometria de fluxo são usadas para confirmar que as células em cultura primária são miofibroblastos. Demonstrando os procedimentos estaremos eu, Matthew Gargas, um técnico, e chow new, um pós-doutorado do meu laboratório, Tori. Depois de sacrificar um camundongo de oito a 12 dias de idade, prenda o lado dorsal do animal e molhe a superfície ventral com etanol a 70%.

Em seguida, usando uma pinça, agarre e levante a pele anterior à abertura uretral. Corte ao longo da linha média ventral da abertura uretral até o queixo. Corte apenas a pele.

Em seguida, faça incisões da abertura uretral até os joelhos, formando um Y de cabeça para baixo. Depois de concluir as incisões, retire cuidadosamente a pele e coloque-a de lado. Agora levante o peritônio e corte-o até o diafragma e a caixa torácica.

Mantenha a tesoura apontada para cima para evitar danos ao conteúdo intratorácico e abdominal. Em seguida, levante suavemente o lobo esquerdo do fígado para expor o estômago subjacente, a junção gástrica esofágica e a porção abdominal do esôfago usando uma tesoura cirúrgica cortada ao longo da linha média do esterno e da caixa torácica até a cintura cervical. Outra vez. Ao fazer isso, mantenha a tesoura inclinada para longe dos órgãos subjacentes.

Em seguida, afaste a caixa torácica para expor o conteúdo da cavidade torácica. Agora remova suavemente o coração e os dois lobos dos pulmões. Use aplicadores de algodão para absorver o sangramento conforme necessário.

O esôfago torácico é um tubo estreito e flexível posterior à traqueia e anterior à vértebra torácica. Em neonatos, encontre a junção gástrica esofágica para identificar o esôfago a partir do estômago. Sem rodeios, disseque a vasculatura ao redor do esôfago, incluindo gordura e tecido mesentério, até a origem esofágica na cavidade cervical.

Agora ressecção todo o comprimento do esôfago e transfira-o para HBSS resfriado, se desejar. Além disso, remova uma parte do estômago para fins de orientação. Comece este protocolo picando fragmentos de mucosa obtidos de tecido de camundongo ou humano em HBSS em um tubo de micro fuge de 1,7 mililitro ou um tubo de cinco mililitros, respectivamente.

Agora, ao obter células estromais esofágicas humanas, é importante separar a mucosa da muscular própria subjacente por dissecção aguda. Agora, no tubo, cunha ainda mais o tecido em pedaços de dois a três milímetros usando uma tesoura fina. Após o sedimento fragmentado da mucosa esofágica, decanta lentamente o HBSS, tomando cuidado para não descartar inadvertidamente o tecido.

Você também pode usar uma pipeta de ponta grande para remover HBSS adicional. Em seguida, adicione HBSS fresco. Misture o tubo com uma agitação suave e deixe o tecido assentar.

Depois de assentado, transvase novamente o HBSS e repita esta lavagem. Passo oito vezes ao todo. Após as oito lavagens, incubar o tecido com colagenase 11 e diss incubar o tecido murino por até 25 minutos em um agitador de balanço em velocidade lenta e em temperatura ambiente.

Nas mesmas condições, incubar o tecido humano durante seis horas. Após a digestão, misture ainda mais o tecido com uma tesoura fina e, em seguida, centrifugue o tecido a 200 G por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante e decantar o tecido peletizado para um tubo limpo de 1,7 mililitros.

Em seguida, sob a capa de cultura de tecidos, lave as células cinco vezes em DMEM com 2% de sorbitol para eliminar as células não viáveis e outros detritos. Para cada lavagem, deixe as células assentarem por gravidade e decantar a solução de lavagem. Após as lavagens, semeie as células em três poços de um seis.

Poço e cultivá-los em DMEM suplementado filtrado a vácuo. O tecido humano pode exigir mais poços ou placas, dependendo do tamanho da cultura da amostra, as células, até que os poços sejam 80% confluentes. Em seguida, passe as células de adesão para frascos T 25 primeiro, use 0,05% de tripsina em EDTA para desalojar as células.

Em seguida, adicione mídia para neutralizar a reação. Recolher as células desalojadas num tubo de centrifugação. Em seguida, gire as células a 400 G para coletá-las ao microscópio.

Observe a morfologia em forma de fuso das células aderentes para distinguir as células estromais cultivadas das células musculares e as corar imuno para Desmond. Usando um protocolo padrão, coloque brevemente 15.000 células em quatro lâminas de câmara de poço e cresça em meio de miofibroblastos por 24 horas. No dia seguinte, fixe as células e, antes de aplicar o anticorpo primário, bloqueie as células fixadas com 5% de soro de cabra em PBS, os anticorpos primários e secundários também devem ser diluídos em 5% de soro de cabra.

Incubar com anticorpo primário à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS após as lavagens. Adicione os anticorpos secundários e incube as células por uma hora.

À temperatura ambiente, use três lavagens em PBS para remover os anticorpos secundários. Em seguida, as células coradas podem ser analisadas após as lavagens. Aplique DPI com mídia de montagem e lamínula para estabelecer a pureza das células esofágicas.

Verifique-os quanto a marcadores de superfície celular hematopoiética e endotelial. Usando citometria de fluxo. Cultive um número suficiente em frascos de cultura até que estejam prontos para serem coletados.

Em seguida, separe as células estromais esofágicas de camundongo cultivadas usando solução de dissociação celular não enzimática a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após sua coleta. Lave as células com buffer de fax duas vezes e conte as células.

Agora, usando um procedimento de coloração padrão, core com CD 45 para identificar células imunes e core com CD 31 para identificar células endoteliais e, em seguida, passe as células pelo citômetro de fluxo. As células estromais esofágicas foram isoladas usando digestão mecânica e enzimática e cultivadas em seis placas de poços poucas horas após o plaqueamento. As células estavam em uma suspensão mista frouxamente aderida à placa.

Nas 24 horas seguintes, células fusiformes brotaram da suspensão celular e aderiram firmemente ao fundo da placa. Essas células cobriram todo o poço em cinco dias e foram aprovadas com sucesso, mantendo sua morfologia por pelo menos 15 passagens vistas aqui, as células estão em baixa densidade. Estas são as células fusiformes próximas à cofluência, imunocoloração de culturas primárias de células estromais esofágicas.

Cultivadas em lâminas de câmara demonstraram uma expressão abundante de marcadores de citoesqueleto de miofibroblastos. A pureza da cultura alfa, SMA e menton foi avaliada por citometria de fluxo. A dispersão frontal e lateral foi estabelecida para células estromais esofágicas primárias, seguida de gating e análise de células vivas para proteínas de superfície celular.

As células estromais esofágicas primárias não expressaram CD 45 hematopoiético e não expressaram marcadores de superfície celular CD 31 endotelial. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer culturas primárias de miofibroblastos de esôfago de camundongos e humanos. Sim.