Name: Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a analisar perfis proteômicos de macrófagos M1 e M2 humanos por eletroforese 2D diferencial em gel. Esta técnica sensível detecta variações proteicas com apenas cinco microgramas de amostra.

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Este trabalho foi apoiado pelo Inserm. Marion Bouvet é membro do Ministério da Pesquisa e Tecnologia da França. Annie Turkieh é bolsista do FP7 HOMAGE (305507) da União Europeia.

O protocolo segue as diretrizes da nossa humana comitê de ética em pesquisa das instituições. Buffy coat de dadores humanos saudáveis ​​foram obtidos a partir do Centro Regional de Sangue Transfusion (Lille, França). As amostras obtidas a partir dos casacos de Buffy são declaradas como uma coleção Inserm (n ° DC2010-1209). 1. Material e Meios de Cultura Preparação <ol><li> Diluir 10x de Tampão Fosfato Salino (PBS) em água destilada estéril para obter 1x PBS. </li><li> Adicione meio RPMI 1640 suplementado com gentamicina (40 ug / ml) e L-glutamina (2 mM), com e sem 10% de soro humano reunido. </li></ol> 2. As culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos (MDM) <ol><li> Diluir buffycoat (25 ml) com 1x PBS. Encher cuidadosamente num gradiente de Ficoll tubo de centrífuga e / Leucosep a 1.600 xg durante 20 min, à temperatura ambiente. </li><li> Recolhe monócitos na interface para um novo tubo. Lavar 3x com 10 ml de 1x PBS contendo 0,1% etilenodiaminotetraácido acético (EDTA) por centrifugações sucessivas a 1.000 xg, 370 xg e 160 xg durante 10 min cada, e depois uma vez em 1x PBS sozinho a 160 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de meio RPMI-1640 sem soro e semear as células em pratos de 35 mm a uma densidade de 1 x 10 6 células por prato. </li><li> Após sedimentação durante 90 minutos na incubadora, desprezar o sobrenadante contendo as células não aderentes. Lavam-se as células aderentes, que consiste de monócitos, 3x com 1 ml de PBS; em seguida adicionar 1 ml de meio fresco contendo 10% (v / v) de soro humano para as células livres de soro anteriormente. </li><li> Após 6 dias de cultura, para se obter os macrófagos diferenciados alternativos (M2), adicionar recombinante humana IL-4 (15 ng / ml) e manter durante 6 dias. Em seguida, o tratamento de macrófagos diferenciados com lipopolissacárido (100 ng / mL) no dia 12 durante 4 horas para se obter os macrófagos M1. </li></ol> 3. Extração de macrófagos M1 e M2 Proteínas para 2D Eletroforese <ol><li> Wash macrophidades três vezes com Tris 25 mM, pH 7,4, e resíduos em tampão contendo 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), 2 M tioureia e 7 M de ureia. </li><li> Lisar células utilizando um misturador adequado para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para 5 min em gelo e armazenar a -20 ° C. </li><li> Determinar a concentração de proteína usando um reagente de Bradford comercial. Armazenar aliquotas de 100 ul das proteínas à temperatura de -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 4. Isoelectrofocusing NOTA: Realizar todos os procedimentos de rotulagem no escuro. <ol><li> Reduzir a 5 ug de cada amostra (M1 e M2 macrófagos) ajustado para 9 mL com tampão de lise com Tris 2 mM (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Adicionar cianina 3 (Cy3) de extracto de M1 e M2 extracto corante sulfidrilo reactivo, a uma concentração de 0,8 nM de proteína / ug. Adicionar cianina 5 (Cy5) a M1 e M2 extrai a uma concentração de 0,8 nM / mg de proteína e incubardurante 30 min a 37 ° C. </li><li> Pare a reacção com a adição de um volume igual de tampão de amostra contendo 7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 130 mM de ditiotreitol (DTT) e 2% pharmalytes. </li><li> Mix Cy3 marcado amostras M1 com amostras M2 Cy5-rotulados em uma mão e Cy3 marcado amostras M2 com amostras M1 Cy5-rotulados em outro lado. </li><li> Reidratar um gradiente de pH imobilizado (IPG) faixa (240 milímetros, pH 3-10 gradiente linear) com 450 mL de amostras misturadas marcados em tampão contendo 7 M uréia, 2 M de tiouréia e 4% CHAPS em uma focalização isoelétrica (IEF) sistema de célula para 24 horas, sem aplicar qualquer corrente. </li><li> Realizar concentrando a 300 volts (V) durante 3 horas, e, em seguida, em um gradiente a 1.000 V durante 6 h, em um gradiente a 8000 V durante 3 horas e, finalmente a 8000 V durante 3 horas. </li></ol> 5. Segunda Dimensão NOTA: Execute todos os procedimentos de eletroforese no escuro. <ol><li> Incubar as tiras de IPG em tampão de equilíbrio contering 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M de ureia, 2% (w / v) de dodecil sulfato de sódio (SDS) e 30% (v / v) de glicerol durante 10 min. </li><li> Transferem-se as tiras de IPG equilibradas para a segunda dimensão (electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE)) em 12,5% PAGE e selar com baixo ponto de fusão de agarose. </li><li> Levar a cabo a electroforese a 20 ° C utilizando um sistema Ettan-Daltsix a uma voltagem constante de 70 V durante a noite seguido de 300 V até o azul de bromofenol a frente atinge o fundo do gel. </li></ol> 6. Aquisição de Imagem e Análise Bioinformatic <ol><li> Geles de digitalização expressos entre as duas placas de vidro de baixa fluorescência com um scanner DIGE Imager em comprimentos de onda de excitação / emissão de 532/580 nm para Cy3 e Cy5 para 633/670 nm para se obter imagens com um tamanho de pixel de 100 um. </li><li> Realizar análise de imagem com software comercial, como anteriormente descrito 12. </li><li> Calcule e normalizar volumes pontuais em cada imagem. Atribuir um volume local normalizada como um suporteortion do valor total de cada mancha detectada no gel. </li><li> Analise as diferenças de volumes pontuais de proteína para cada tipo de macrófagos por comparação do valor de volume normalizado local entre os dois grupos (M1 e M2). Considere a diferença entre os volumes pontuais para ser significativa se a mudança é de 1,5 vezes (p &lt;0,05, de um modo análise ANOVA). </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Não há conflito de interesses declarado.

O protocolo aqui descrito detalha um método para analisar o impacto de vários estímulos dos dois subtipos de macrófagos, M1 (pró-inflamatória) e M2 (anti-inflamatório). As culturas primárias de M1 e M2 macrófagos foram obtidos a partir da diferenciação de monócitos como publicado anteriormente 7. O procedimento de eletroforese em gel 2D DIGE requer materiais e equipamentos especializados, como o IEF celular para placas isoelectrofocusing, baixa fluorescência para a SDS-PAGE, a fim...

Os macrófagos são células heterogéneas e de plástico que são capazes de adquirir fenótipos funcionais distintos. In vivo, estas células respondem a uma grande variedade de micro signalssuch ambiental como produtos microbianos, citoquinas, etc. 1. In vitro, o fenótipo pró-inflamatória (M1) de macrófagos pode ser induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e o fenótipo anti-inflamatória (M2) por algumas citocinas tais como a interleucina-4 (IL-4). Além disso, os macrófagos podem alternar de um M1 M2 activado para fenótipo, e, inversamente, mediante sinais específicos 2. Dependendo do fenótipo, os macrófagos possuem diferentes funções. M1 macrófagos são células que produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral α (TNF-α), para matar os microorganismos ou células tumorais 3. Em contraste, os macrófagos M2 evitar estes resposta inflamatória como na cicatrização de feridas e fibrose através da produção de anti-inflammatory factores, tais como TGF-β 3,4. As células mononucleares do sangue periférico humano a partir de dadores saudáveis ​​foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll como previamente descrito 5 utilizando uma técnica adaptada de Boyum 6. Os macrófagos em cultura podem ser diferenciadas em M1 ou M2 fenótipo após 6 dias de cultura primária 7. Análise da expressão de proteínas ou mudanças de proteína entre os dois subtipos de macrófagos sob vários estímulos controlados, tais como patogenicidade hospedeiro ou toxinas microbianas, será útil para decifrar a funcionalidade do pro- macrófagos e anti-inflamatórios. Proteômica são ferramentas exclusivas para o monitoramento direto de proteínas que são especificamente para cima ou para baixo-regulado em macrófagos cultivados humanos sob vários estímulos. Corantes fluorescentes resolveu algumas das limitações de eletroforese em gel 2D, como a baixa sensibilidade e análise de imagem de 8 &lt;<html> / Sup&gt;. Os corantes que reagem com resíduos de cisteína aumentou a sensibilidade de detecção em comparação com aqueles reagir com 9 resíduos de lisina. Em um estudo anterior, demonstramos a utilidade de rotulagem saturação DIGE para a análise de amostras de escassos 10 em comparação com o 2D eletroforese manchada de prata clássica 11. Esta tecnologia é útil para analisar rapidamente modificações de proteína entre os dois subtipos de macrófagos ou entre os macrófagos não tratados e tratados do mesmo subtipo. As vantagens desta técnica são proteómica ter acesso às informações do tamanho da proteína e modificações pós-tradução através da análise do gel 2D 12. Deve ser tomado em consideração que esta não é uma técnica de alto rendimento, o que limita o número de amostras que podem ser analisadas. O desenvolvimento de ensaios de alto rendimento com base em espectrometria de massa como revisto recentemente 13 pode melhorar esta. _content &quot;&gt; Aqui apresentamos como realizar análise 2D DIGE da extração de proteínas de macrófagos em cultura através dos processos de eletroforese, isoelectrofocusing e SDS-PAGE, bem como informações sobre a utilidade do software 2D adequada.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>soro humano</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de 6 poços PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolissacarídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml cilindro</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-corante reativo</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>tira IPG 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean Célula IEF</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Ettan-Daltsix</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Imager scanner</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Dinâmica</td><td></td><td></td>não linear</tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>seu&eacute; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida 40%</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>2D limpam</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Dim&eacute; tilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>mechas de eléctrodo</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

proteômica profiling de macrófagos por eletroforese 2d

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

O objetivo do protocolo de eletroforese bidimensional (2D) descrito aqui é mostrar como analisar o fenótipo de macrófagos cultivados em humanos. O papel fundamental dos macrófagos tem sido demonstrado em vários distúrbios patológicos, como doenças inflamatórias, imunológicas e infecciosas. Neste protocolo, usamos culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos humanos que podem ser diferenciados no fenótipo M1 (pró-inflamatório) ou M2 (antiinflamatório). Este modelo in vitro é confiável para estudar as atividades biológicas de macrófagos M1 e M2 e também para uma abordagem proteômica. As técnicas proteômicas são úteis para comparar o fenótipo e o comportamento dos macrófagos M1 e M2 durante a patogenicidade do hospedeiro. A eletroforese em gel 2D é uma técnica proteômica poderosa para mapear um grande número de proteínas ou polipeptídeos simultaneamente. Descrevemos o protocolo de eletroforese 2D usando corantes fluorescentes, denominado Eletroforese Diferencial em Gel 2D (DIGE). As proteínas dos macrófagos M1 e M2 são marcadas com corantes de cianina antes da separação por focalização isoelétrica, de acordo com seu ponto isoelétrico na primeira dimensão, e sua massa molecular, na segunda dimensão. Proteínas separadas ou manchas polipeptídicas são então usadas para detectar diferenças nos níveis de expressão de proteínas ou polipeptídeos. As abordagens proteômicas descritas aqui permitem a investigação das alterações na proteína dos macrófagos associadas a vários distúrbios, como patogenicidade do hospedeiro ou toxinas microbianas.

Para realizar a análise proteômica diferencial adequado, o processamento de amostras a serem analisadas devem ser verificadas. No exemplo apresentado, a qualidade de cultura de células de macrófagos é necessário para os aspectos morfológicos e moleculares, tal como publicado anteriormente 5. A diferenciação de monócitos em macrófagos e a homogeneidade da cultura foi seguido por microscopia de fase. A Figura 1 mostrou um exemplo de culturas primárias de M1 e M2 mac...

Os macrófagos são as células-chave envolvidas na patogenicidade do hospedeiro. Os macrófagos apresentam diversidade fenotípica e funcional que pode ser analisada e detectada por análise proteômica. Este artigo descreve como realizar eletroforese 2D de culturas primárias de macrófagos humanos diferenciados em fenótipo M1 ou M2.

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar o fenótipo de subpopulações de macrófagos pró-inflamatórios M1 humanos e M anti-inflamatórios por diferencial 2D em eletroforese em gel. Isso é feito primeiro marcando proteínas extraídas de M1 e M primários de duas culturas de macrófagos com corantes senoidais. Na segunda etapa, as proteínas são misturadas e o eletrofoco ISO por reidratação é realizado nas amostras.Na segunda dimensão, a eletroforese é realizada com um gradiente de pH mobilizado ou tiras de IPG no escuro e, em seguida, os géis são escaneados com o diferencial no scanner de eletroforese em gel. Por fim, a análise das imagens numeradas é realizada para detectar as diferenças nas manchas pépticas dos pólipos entre M1 e M, dois subconjuntos de macrófagos. A principal vantagem desta técnica entre os métodos existentes, como a eletroforese clássica em gel todi, é que esta técnica é mais sensível, exigindo apenas cinco microgramas de proteínas, o que é muito importante para amostras obtidas de pacientes humanos.Demonstrando o procedimento estará Mario Bove, um estudante de doutorado, Olivia Beza e técnico Magac do meu laboratório Para preparar culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos, comece diluindo 25 mililitros de revestimento Buffy em 25 mililitros de PBS. Em seguida, carregue cuidadosamente o sangue diluído em um gradiente de separação e centrifugue as células por 20 minutos a 1600 Gs e temperatura ambiente quando as células terminarem de girar. Colete os monócitos na camada de interface, seguido por três lavagens sucessivas das células colhidas em 10 mililitros de PBS contendo 0,1% de EDTA após a terceira lavagem.Gire as células mais uma vez apenas em PBS e, em seguida, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio RPMI 1640 sem semente de soro. As células em placas de 35 milímetros a uma densidade de uma vez 10 elevado a seis células por placa e, em seguida, após uma sedimentação de 90 minutos na incubadora, descartar o sobrenadante e lavar os monócitos aderentes três vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, as células em 10 mililitros de meio fresco contendo 10% de volume por volume de soro humano por seis dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, para produzir macrófagos M dois anti-inflamatórios, suplemente algumas das culturas com 15 nanogramas por mililitro de IL quatro no sexto dia de cultura para produzir macrófagos pró-inflamatórios no dia 12. Trate as outras culturas de macrófagos diferenciados com 100 nanogramas por mililitro de LPS por quatro horas para isolar os subconjuntos de macrófagos para eletroforese 2D. Em seguida, lave a cultura de interesse três vezes com 25 tris milimolares e, em seguida, solte as células do fundo das placas com tampão de extração de rachaduras.Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e amarre-as a quatro graus Celsius. Após cinco minutos, transferir as células em alíquotas de 100 microlitros para um armazenamento de 20 graus Celsius negativos até à análise da concentração de proteínas para a focalização ISO dos subconjuntos de macrófagos. Primeiro, ajuste as amostras para alíquotas de nove microlitros e, em seguida, reduza as soluções celulares com tampão de lise suplementado com dois milimolares de TCEP a 37 graus Celsius.Após uma hora, incubar os extratos com S SI três e S SI cinco a 37 graus Celsius, interrompendo a reação após 30 minutos com a adição de um volume igual de tampão de amostra. Em seguida, crie duas misturas separadas de volumes iguais de proteínas M1 marcadas com S SI três com SCI cinco marcadas com M duas proteínas. Em seguida, reidratar uma tira de IPG com 450 microlitros das amostras misturadas marcadas em tampão de extração de chaps em um sistema de célula de focalização isoelétrica por 24 horas sem aplicar nenhuma corrente.No dia seguinte, inicie a focalização a 300 volts por três horas, depois configure um gradiente para 1000 volts por seis horas, seguido por dois gradientes de 8.000 volts por três horas cada para realizar eletroforese de segunda dimensão e incubar as tiras IPG no tampão de equilíbrio. Após 10 minutos, transfira as tiras para géis de 12,5% e sele-as com aros de baixo ponto de fusão. Em seguida, use um sistema edin dsic a uma tensão constante de 70 volts para realizar a eletroforese a 20 graus Celsius durante a noite, seguida por uma corrida de 300 volts até que a frente do azul de bromo fenol atinja o fundo do gel para adquirir imagens dos géis.Coloque-os entre as duas placas de vidro de baixa fluorescência de um scanner de eletroforese diferencial e de gel e escaneie os géis em comprimentos de onda de emissão de excitação de 5 32, 5 80 nanômetros para três e 6 33 6 70 nanômetros para cinco para produzir imagens com um tamanho de pixel de 100 micrômetros. Analise o com o software apropriado e, em seguida, calcule e normalize os volumes de pontos em cada imagem, atribuindo um volume de pontos normalizado como proporção do valor total de cada ponto detectado no gel. Analise as diferenças nos volumes pontuais de proteínas para cada tipo de macrófago, comparando o valor do volume pontual normalizado entre os dois grupos de macrófagos, considerando que a diferença entre os volumes pontuais é significativa se a alteração for de 1,5 vezes.Neste experimento. Os padrões de proteína 2D dos dois subtipos de macrófagos M1 pró-inflamatório e M dois anti-inflamatórios foram determinados por diferencial 2D. Na eletroforese em gel, o mesmo padrão de proteínas foi observado para M1 ou M dois, independentemente dos corantes ciano usados.Curiosamente, a análise bioinformática do gel revelou 20 áreas contendo manchas, aumentos e diminuições entre os volumes das manchas foram quantificados conforme visualizado pelas manchas de coloração amarela, azul e verde foram consideradas como tendo uma expressão diferencial significativa se a mudança de dobra do volume da mancha normalizada fosse maior que 1,5 com um valor de P menor que 0,05. Seguindo este CH, métodos de oferta como quantitativo, espectrometria de massa ou análise proteômica adicional podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como que tipo de proteínas são expressas diferencialmente entre os dois subconjuntos de macrófagos em resposta a vários estímulos.

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método simples e específica foi demonstrada para marcação fluorescente e detecção aprimorada de proteínas de superfície das células sem uma etapa de fracionamento. Abundância diferencial de proteínas de superfície celular foi analisada através de eletroforese bidimensional (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

Este protocolo descreve o uso de espectrometria de massa MALDI-TOF de células inteiras em células eucarióticas. Aqui, ilustramos a precisão dessa técnica analisando os múltiplos estados de ativação dos macrófagos em resposta ao seu microambiente.

De células inteiras MALDI-TOF espectrometria de massa é um método rápido e preciso para analisar os diferentes modos de ativação de macrófagos

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.

A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

A reprogramação metabólica é uma característica e pré-requisito para a polarização de macrófagos M1 e M2. Este manuscrito descreve um ensaio para a medição de parâmetros fundamentais de glicólise e função mitocondrial em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos. Esta ferramenta pode ser aplicada para investigar como fatores específicos afetam o metabolismo e o fenótipo do macrófago.

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Nós descrevemos nosso protocolo para medir ritmos biológicos no catabolismo da proteína através do autofagia e do Proteassoma no fígado do rato.

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

Aprenda a analisar perfis proteômicos de macrófagos M1 e M2 humanos por eletroforese 2D diferencial em gel. Esta técnica sensível detecta variações proteicas com apenas cinco microgramas de amostra.

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

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