Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

Os macrófagos são as células-chave envolvidas na patogenicidade do hospedeiro. Os macrófagos apresentam diversidade fenotípica e funcional que pode ser analisada e detectada por análise proteômica. Este artigo descreve como realizar eletroforese 2D de culturas primárias de macrófagos humanos diferenciados em fenótipo M1 ou M2.

O objetivo geral deste procedimento é analisar o fenótipo de subpopulações de macrófagos pró-inflamatórios M1 humanos e M anti-inflamatórios por diferencial 2D em eletroforese em gel. Isso é feito primeiro marcando proteínas extraídas de M1 e M primários de duas culturas de macrófagos com corantes senoidais. Na segunda etapa, as proteínas são misturadas e o eletrofoco ISO por reidratação é realizado nas amostras.

Na segunda dimensão, a eletroforese é realizada com um gradiente de pH mobilizado ou tiras de IPG no escuro e, em seguida, os géis são escaneados com o diferencial no scanner de eletroforese em gel. Por fim, a análise das imagens numeradas é realizada para detectar as diferenças nas manchas pépticas dos pólipos entre M1 e M, dois subconjuntos de macrófagos. A principal vantagem desta técnica entre os métodos existentes, como a eletroforese clássica em gel todi, é que esta técnica é mais sensível, exigindo apenas cinco microgramas de proteínas, o que é muito importante para amostras obtidas de pacientes humanos.

Demonstrando o procedimento estará Mario Bove, um estudante de doutorado, Olivia Beza e técnico Magac do meu laboratório Para preparar culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos, comece diluindo 25 mililitros de revestimento Buffy em 25 mililitros de PBS. Em seguida, carregue cuidadosamente o sangue diluído em um gradiente de separação e centrifugue as células por 20 minutos a 1600 Gs e temperatura ambiente quando as células terminarem de girar. Colete os monócitos na camada de interface, seguido por três lavagens sucessivas das células colhidas em 10 mililitros de PBS contendo 0,1% de EDTA após a terceira lavagem.

Gire as células mais uma vez apenas em PBS e, em seguida, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio RPMI 1640 sem semente de soro. As células em placas de 35 milímetros a uma densidade de uma vez 10 elevado a seis células por placa e, em seguida, após uma sedimentação de 90 minutos na incubadora, descartar o sobrenadante e lavar os monócitos aderentes três vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, as células em 10 mililitros de meio fresco contendo 10% de volume por volume de soro humano por seis dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, para produzir macrófagos M dois anti-inflamatórios, suplemente algumas das culturas com 15 nanogramas por mililitro de IL quatro no sexto dia de cultura para produzir macrófagos pró-inflamatórios no dia 12. Trate as outras culturas de macrófagos diferenciados com 100 nanogramas por mililitro de LPS por quatro horas para isolar os subconjuntos de macrófagos para eletroforese 2D. Em seguida, lave a cultura de interesse três vezes com 25 tris milimolares e, em seguida, solte as células do fundo das placas com tampão de extração de rachaduras.

Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e amarre-as a quatro graus Celsius. Após cinco minutos, transferir as células em alíquotas de 100 microlitros para um armazenamento de 20 graus Celsius negativos até à análise da concentração de proteínas para a focalização ISO dos subconjuntos de macrófagos. Primeiro, ajuste as amostras para alíquotas de nove microlitros e, em seguida, reduza as soluções celulares com tampão de lise suplementado com dois milimolares de TCEP a 37 graus Celsius.

Após uma hora, incubar os extratos com S SI três e S SI cinco a 37 graus Celsius, interrompendo a reação após 30 minutos com a adição de um volume igual de tampão de amostra. Em seguida, crie duas misturas separadas de volumes iguais de proteínas M1 marcadas com S SI três com SCI cinco marcadas com M duas proteínas. Em seguida, reidratar uma tira de IPG com 450 microlitros das amostras misturadas marcadas em tampão de extração de chaps em um sistema de célula de focalização isoelétrica por 24 horas sem aplicar nenhuma corrente.

No dia seguinte, inicie a focalização a 300 volts por três horas, depois configure um gradiente para 1000 volts por seis horas, seguido por dois gradientes de 8.000 volts por três horas cada para realizar eletroforese de segunda dimensão e incubar as tiras IPG no tampão de equilíbrio. Após 10 minutos, transfira as tiras para géis de 12,5% e sele-as com aros de baixo ponto de fusão. Em seguida, use um sistema edin dsic a uma tensão constante de 70 volts para realizar a eletroforese a 20 graus Celsius durante a noite, seguida por uma corrida de 300 volts até que a frente do azul de bromo fenol atinja o fundo do gel para adquirir imagens dos géis.

Coloque-os entre as duas placas de vidro de baixa fluorescência de um scanner de eletroforese diferencial e de gel e escaneie os géis em comprimentos de onda de emissão de excitação de 5 32, 5 80 nanômetros para três e 6 33 6 70 nanômetros para cinco para produzir imagens com um tamanho de pixel de 100 micrômetros. Analise o com o software apropriado e, em seguida, calcule e normalize os volumes de pontos em cada imagem, atribuindo um volume de pontos normalizado como proporção do valor total de cada ponto detectado no gel. Analise as diferenças nos volumes pontuais de proteínas para cada tipo de macrófago, comparando o valor do volume pontual normalizado entre os dois grupos de macrófagos, considerando que a diferença entre os volumes pontuais é significativa se a alteração for de 1,5 vezes.

Neste experimento. Os padrões de proteína 2D dos dois subtipos de macrófagos M1 pró-inflamatório e M dois anti-inflamatórios foram determinados por diferencial 2D. Na eletroforese em gel, o mesmo padrão de proteínas foi observado para M1 ou M dois, independentemente dos corantes ciano usados.

Curiosamente, a análise bioinformática do gel revelou 20 áreas contendo manchas, aumentos e diminuições entre os volumes das manchas foram quantificados conforme visualizado pelas manchas de coloração amarela, azul e verde foram consideradas como tendo uma expressão diferencial significativa se a mudança de dobra do volume da mancha normalizada fosse maior que 1,5 com um valor de P menor que 0,05. Seguindo este CH, métodos de oferta como quantitativo, espectrometria de massa ou análise proteômica adicional podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como que tipo de proteínas são expressas diferencialmente entre os dois subconjuntos de macrófagos em resposta a vários estímulos.